荜茇十一碳三烯哌啶在制备预防或治疗与GSDMD蛋白相关疾病的药物中的应用的制作方法

荜茇十一碳三烯哌啶在制备预防或治疗与gsdmd蛋白相关疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及荜茇十一碳三烯哌啶(piperundecalidine)在制备预防或治疗与gsdmd蛋白相关疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.细胞焦亡在机体受到病原微生物侵染后发挥关键作用。当机体受到微生物或内源性刺激后，caspase
‑
1/4/5/11被激活，gsdmd活化，在膜上形成孔隙，细胞肿胀，最终导致质膜破裂，大量内源性物质被释放，导致细胞焦亡。gsdmd被认为是典型的细胞焦亡蛋白，细胞焦亡本质上是由gsdmd蛋白介导的细胞炎性坏死，与多种病理生理过程紧密相关。因此，gsdmd的过度产生与很多疾病相关，如类风湿性关节炎、阿尔兹海默症、痛风、肠炎、多发性硬化症、动脉粥样硬化、ⅱ型糖尿病、帕金森症、肿瘤、新生儿多系统炎症性疾病、家族性冷自发炎综合症、非酒精性脂肪肝等。由此说明有效的抑制gsdmd活化对于预防和治疗相关疾病有一定的作用。目前，gsdmd活化抑制剂尚未有上市品种，均处于前期开发阶段。因此开展gsdmd抑制剂的药物研究，具有广阔的前景。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种荜茇十一碳三烯哌啶在制备预防或治疗与gsdmd蛋白相关疾病的药物中的应用。
4.进一步，所述荜茇十一碳三烯哌啶在药物中发挥作用是通过抑制gsdmd蛋白的活化来实现的。
5.进一步，所述与gsdmd蛋白相关疾病包括高血脂症、ⅱ型糖尿病、急性痛风性关节炎、肠炎和老年痴呆症等。
6.进一步，所述高血脂症、ⅱ型糖尿病是由高脂食物诱导而致病的，所述急性痛风性关节炎是由尿酸钠结晶(msu)诱导而致病的，所述肠炎是由tnbs诱导致病的，所述老年痴呆症是由d
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半乳糖和β
‑
淀粉样蛋白联合诱导致病的。
7.荜茇入药有温中散寒，下气止痛的功效，多用于脘腹冷痛，呕吐，泄泻，冷痰咳嗽，胸痹心痛，头痛，牙痛。荜茇十一碳三烯哌啶(piperundecalidine)是荜茇提取物，目前关于荜茇十一碳三烯哌啶的研究报道较少，并且还没有文献报道荜茇十一碳三烯哌啶这种化合物的抑制gsdmd活化的作用，gsdmd与多种炎性疾病息息相关，因此证明荜茇十一碳三烯哌啶是良好gsdmd抑制剂具有较好的应用前景。申请人通过实验研究证明了荜茇十一碳三烯哌啶对gsdmd活性具有抑制作用。从bmdm细胞模型上看，荜茇十一碳三烯哌啶对gsdmd均具有较好的抑制作用，说明荜茇十一碳三烯哌啶具有作为gsdmd抑制剂的潜力。在动物模型上看，荜茇十一碳三烯哌啶能降低由高脂食物诱导的高血脂症、由高糖高脂 链脲佐菌素(stz)诱导的ⅱ型糖尿病，并且对msu诱导的急性痛风性关节炎、对tnbs诱导的肠炎、对d
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半乳糖和β
‑
淀粉样蛋白联合诱导的老年痴呆症也都有良好的治疗作用，提示其在治疗gsdmd
相关的疾病具有良好的应用前景。
8.与现有技术相比，本发明具有的优点及有益效果如下：
9.1、荜茇十一碳三烯哌啶对gsdmd具有很强的抑制作用，是良好的gsdmd蛋白活化抑制剂。
10.2、荜茇十一碳三烯哌啶安全性高，药理作用强，预示着良好的药用前景。
11.3、荜茇十一碳三烯哌啶制备过程简单，制备成本低，具有很好的成药性。
附图说明
12.图1为piperundecalidine对msu诱导的bmdm细胞焦亡蛋白的影响。(a)lps诱导前给予不同浓度的piperundecalidine(图中省略了单位“μmol/l”，下同)，检测gsdmd值。(b)lps诱导后给予不同浓度的piperundecalidine，检测gsdmd值。
13.图2为piperundecalidine对msu诱导痛风性关节炎小鼠足趾肿胀率。(a)msu诱导前给予不同浓度的piperundecalidine，测量小鼠足趾肿胀率。(b)msu诱导后给予不同浓度的piperundecalidine，测量小鼠足趾肿胀率。
14.图3为piperundecalidine对高脂食物诱导的高血脂症的影响。(a)小鼠持续喂养8周体重变化。(b)检测小鼠肝脏中gsdmd值。
15.图4为piperundecalidine对高糖高脂 链脲佐菌素(stz)诱导的ⅱ型糖尿病的影响。具体检测小鼠胰腺中gsdmd值。
16.图5为piperundecalidine对d
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半乳糖联合β
‑
淀粉样蛋白诱导小鼠老年痴呆症的影响。(a)给药6天小鼠体重变化。(b)给药6天各组小鼠dai指数变化。(c)各组小鼠结肠长度。(d)各组小鼠hai指数变化。(e)检测结肠中gsdmd值。
17.图6为piperundecalidine对d
‑
半乳糖联合β
‑
淀粉样蛋白诱导小鼠老年痴呆症的影响。(a)空白组小鼠水迷宫路径。(b)模型组小鼠水迷宫路径。(c)piperundecalidine组小鼠水迷宫路径。(d)各组小鼠脑组织中gsdmd蛋白分泌量。
18.图7为秋水仙碱与piperundecalidine对比小鼠死亡数量。
具体实施方式
19.以下是申请人结合具体实施例及附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明权利要求书请求保护的范围并不限于这些实施例。
20.下列实施例中所用到的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
21.c57小鼠、km小鼠、sd大鼠：购于湖北省动物实验中心；
22.gsdmd elisa试剂盒：abcam；
23.lps：invivogen；
24.msu：sigma，u0881；
25.tnbs：sigma，p2297；
26.β
‑
淀粉样蛋白：sigma，158k5624；
27.d
‑
半乳糖：上海华舜生物工程有限公司，707222。
28.以下实施例中：所用荜茇十一碳三烯哌啶购于macklin公司(pb13820)，以dpbs
(ph7.4，nacl 8g/l，kcl 0.2g/l，na2hpo41.15g/l，kh2po40.2g/l)为溶剂配制成溶液。
29.实施例1：荜茇十一碳三烯哌啶对gsdmd抑制作用的体外研究
30.一、实验方法
31.1、bmdm细胞的获取
32.(1)取c57小鼠，脱颈处死，在75％的酒精中浸泡几分钟。
33.(2)剥离出小鼠后肢，除去肌肉，在0.01mol/l pbs(ph7.2～7.4，135mm nacl，2.7mm kcl，1.5mm kh2po4，8mm k2hpo4，其中单位mm指mmol/l，下同，不赘述)中浸泡。
34.(3)冲洗骨髓于2％fbs(用0.01mol/l pbs配置)中，吹打细胞，过滤，离心。
35.(4)倒掉上清，红细胞裂解液裂解1分钟，离心。
36.(5)倒掉上清，加入imdm培养基，接种到96孔板或6孔板中，7天后使用。
37.2、lps msu刺激
38.(1)lps诱导前给药：7天后bmdm细胞成熟，每孔加入200μl pbs(0.01m)冲洗两次，加入荜茇十一碳三烯哌啶(分低、高剂量两组：1μmol/ml，10μmol/ml)200μl，刺激30min，然后加入lps(200ng/ml)200μl，刺激3h，再加入msu(200μg/ml)200μl，刺激6h，最后收集上清用gsdmd的elisa试剂盒检测。
39.(2)lps诱导后给药：7天后bmdm细胞成熟，每孔加入200μl pbs(0.01m)冲洗两次，加入lps(200ng/ml)200μl，刺激3h，然后加入荜茇十一碳三烯哌啶(分低、高剂量两组：1μmol/ml，10μmol/ml)200μl，刺激30min，再加入msu(200μg/ml)200μl，刺激6h，最后收集上清用gsdmd的elisa试剂盒检测。
40.(3)control组：7天后bmdm细胞成熟，每孔加入200μl pbs(0.01m)冲洗两次，再加入200μl优化培养基(opti
‑
mem减血清培养基)培养9h，最后收集上清用gsdmd的elisa试剂盒检测。
41.(4)lps msu组：7天后bmdm细胞成熟，每孔加入200μl pbs(0.01mol/l)冲洗两次，加入lps(200ng/ml)200μl，刺激3h，再加入msu(200μg/ml)200μl，刺激6h，最后收集上清用gsdmd的elisa试剂盒检测。
42.3、gsdmd的elisa检测
43.gsdmd的elisa试剂盒来自abcam公司，实验操作按照说明书进行，具体如下：
44.(1)分别加入25μl的样品和标准品。
45.(2)再每孔加入25μl抗体混合物，封板，至平板摇床上，700rpm，室温下孵育1h。
46.(3)每孔加入清洗缓冲液洗涤100μl，洗涤3次，最后一次吸干水分，去除多余的液体。
47.(4)每孔加入50μl，1％的tmb显色液，避光，在400rpm的摇床上孵育育30min。
48.(5)最后加入50μl终止液，在摇床上混合1min，检测450nm处的od值。
49.(6)分析数据。
50.二、结果分析
51.由图1可知，在lps刺激前加入荜茇十一碳三烯哌啶，gsdmd水平显著降低(p<0.01)(图1a)，说明荜茇十一碳三烯哌啶能够延迟lps的诱导作用，对lps和msu联合诱导的细胞焦亡具有一定的预防作用；lps刺激后加入荜茇十一碳三烯哌啶，明显降低了gsdmd的水平(p<0.01)(图1b)。说明荜茇十一碳三烯哌啶能够抑制lps和msu联合诱导的细胞焦亡，具有一定
的治疗作用。
52.实施例2：荜茇十一碳三烯哌啶对gsdmd抑制作用的体内研究
53.一、建模
54.1、msu诱导的急性痛风性关节炎模型
55.(1)取c57小鼠，购于湖北省动物实验中心，称重，测量足趾容积。
56.(2)msu诱导后给药：左膝关节注射5％的msu 20μl，半小时后注射荜茇十一碳三烯哌啶(分低、高剂量两组：1μmol/l，10μmol/l)20μl。
57.(3)msu诱导前给药：左膝关节注射荜茇十一碳三烯哌啶(分低、高剂量两组：1μmol/l，10μmol/l)20μl，半小时后再注射5％的msu 20μl。
58.(4)control组：左膝关节注射20μl 0.9％的生理盐水。
59.(5)msu组：左膝关节注射5％的msu 20μl。
60.(6)然后测量在0h，3h，6h，9h，12h，24h，48h的足趾容积，并计算足趾肿胀度(swelling rate)。足趾肿胀度＝(造模后时间点测量足趾容积
‑
0h测量足趾容积)/0h测量足趾容积
×
100％。
61.2、高脂食物诱导的高血脂症模型
62.取6周龄左右的，体重相近的km小鼠，购于湖北省动物实验中心，适应性喂养3天。随机分组，分为空白组、模型组和荜茇十一碳三烯哌啶给药组。空白组喂养普通饲料(蛋白质19.2/20gm％/kcal％，脂肪4.3/10gm％/kcal％，碳水化合物67.3/70gm％/kcal％，微量元素9.2/0gm％/kcal％)，其他组喂养高脂饲料(蛋白质24/20gm％/kcal％，脂肪24/45gm％/kcal％，碳水化合物41/35gm％/kcal％，微量元素11/0gm％/kcal％)，4周后，眼眶取血验证模型，随后给药组腹腔注射荜茇十一碳三烯哌啶(10μmol/l)100μl，空白组腹腔注射等体积的0.9％的生理盐水。记录小鼠体重变化，实验中除空白组外其他组持续喂养高脂饲料。4周后，股动脉取血，离心获取血清，检测甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白(ldl
‑
c)、高密度脂蛋白(hdl
‑
c)。最后将小鼠处死，取肝脏。加入pipa裂解液和蛋白酶抑制剂(1：100)，置于组织匀浆器中，放在冰上进行研磨，然后12000rpm，离心15min，取上清，用gsdmd elisa试剂盒检测gsdmd蛋白表达水平。
63.3、高糖高脂 链脲佐菌素(stz)诱导的ⅱ型糖尿病模型
64.取6
‑
8周龄雄性km小鼠，购于湖北省动物实验中心，适应性喂养3天，随机分组，分为空白组、模型组和荜茇十一碳三烯哌啶给药组。空白组喂养普通饲料(蛋白质19.2/20gm％/kcal％，脂肪4.3/10gm％/kcal％，碳水化合物67.3/70gm％/kcal％，微量元素9.2/0gm％/kcal％)，其他组喂养高糖高脂饲料(在普通饲料的基础上添加10％蔗糖，10％猪油，5％胆固醇)，同时腹腔注射60mg/kg stz溶液。4周后，尾尖放血，测血糖验证模型。随后给药组腹腔注射荜茇十一碳三烯哌啶(10μmol/l)100μl，空白组腹腔注射等体积的0.9％的生理盐水，记录小鼠体重变化，实验中除空白组外其他组持续喂养高脂饲料并腹腔注射60mg/kg stz溶液。
65.(1)血糖检测
66.小鼠尾尖放血，然后用ea
‑
11型血糖尿酸测试仪(购于三诺生物传感股份有限公司)检测血糖。
67.(2)葡萄糖耐量实验
68.小鼠禁食14小时后，检测0小时血糖，随后注射葡萄糖1.5g/kg，然后分别在0min、20min、60min、120min检测血糖。
69.(3)gsdmd的elisa检测
70.检测结束后，将小鼠处死，取胰腺。加入pipa裂解液和蛋白酶抑制剂(1：100)，置于组织匀浆器中，在冰上进行研磨，然后12000rpm，离心15min，取上清，用gsdmd elisa试剂盒检测gsdmd蛋白表达水平。
71.4、tnbs诱导小鼠肠炎模型
72.取6
‑
8周龄c57小鼠，购于湖北省动物实验中心，适应性喂养三天。随机分组，分为空白组、模型组(tnbs)和荜茇十一碳三烯哌啶给药组(10μmol/l)。除空白组外，小鼠禁食12h，置于麻醉机中麻醉后，用带有灌肠针的注射器抽取5％tnbs[0.2ml/(100g
·
bw)] 50％乙醇(0.25ml)溶液，将小鼠头朝下，将针头插入肛门中，约3
‑
4厘米，推入药液，最后将针头缓缓拔出，让小鼠头朝下保持5min。荜茇十一碳三烯哌啶给药组给同体积10μmol/l的药物，持续5天。观察小鼠的饮食、大便、体重和潜血等情况，评价小鼠的疾病活动指数(dai)，最后一天截取小鼠结肠标本、采集血液，观察结肠长度并评价组织病理学活动指数(hai)。观察结束后取部分结肠，加入pipa裂解液和蛋白酶抑制剂(1：100)，置于组织匀浆器中，在冰上进行研磨，然后12000rpm，离心15min，取上清，用gsdmd elisa试剂盒检测gsdmd蛋白表达水平。
[0073]
5、d
‑
半乳糖联合β
‑
淀粉样蛋白诱导小鼠老年痴呆症模型
[0074]
取sd大鼠，雄雌各半，体重200g左右，购于湖北省动物实验中心，适应性喂养三天后，分为空白组、模型组、荜茇十一碳三烯哌啶组(10μmol/l)，除空白组外其他各组皮下注射d
‑
半乳糖(150mg/kg)，持续6周，第7周开始，双侧海马注射β
‑
淀粉样蛋白4nmol/l，使用行为学验证模型，造模成功后，给药组每天腹腔注射相应的药物100μl，持续8周。进行morris水迷宫实验检测。测试结束后，大鼠禁食24h，处死，取大鼠脑部。
[0075]
脑组织样品加入ripa裂解液和蛋白酶抑制剂(1：100)，置于组织匀浆器中，在冰上进行研磨，然后12000rpm，离心15min，取上清，用gsdmd elisa法检测gsdmd蛋白表达水平。
[0076]
二、结果分析
[0077]
为了探究荜茇十一碳三烯哌啶对于体内gsdmd生成的抑制效果，申请人使用msu注射小鼠关节诱导小鼠急性痛风性关节炎模型。结果显示，msu造模前给予荜茇十一碳三烯哌啶，能够明显的抑制msu诱导的小鼠足趾肿胀，并呈现出一定的剂量依赖性关系(图2a)，说明荜茇十一碳三烯哌啶对msu诱导的关节炎能起到预防的作用。msu造模后给予荜茇十一碳三烯哌啶，能够显著抑制msu诱导的小鼠足趾肿胀(图2b)，说明荜茇十一碳三烯哌啶对于急性痛风性关节炎具有较好的治疗效果。总之，上述结果表明荜茇十一碳三烯哌啶对急性痛风性关节炎既具有预防作用，也具有治疗作用。
[0078]
此外申请人还探究了荜茇十一碳三烯哌啶对于慢性高血脂症的治疗作用。高血脂症是一种慢性的gsdmd焦亡蛋白相关疾病。申请人研究结果显示，荜茇十一碳三烯哌啶组的小鼠体重升高趋势小于模型组(如图3a)，并且给予荜茇十一碳三烯哌啶的小鼠血清中甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白(ldl
‑
c)和高密度脂蛋白(hdl
‑
c)的含量明显低于模型组(表1)，说明荜茇十一碳三烯哌啶对于高血脂症具有良好的治疗作用。进一步的研究结果显示，给予荜茇十一碳三烯哌啶的小鼠肝脏组织中，gsdmd蛋白活化被抑制(图3b)。说
明这种改善作用是通过抑制gsdmd蛋白活化，从而降低对肝脏的损伤，进一步改善高血脂症小鼠血清中甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白(ldl
‑
c)和高密度脂蛋白(hdl
‑
c)的含量，达到缓解高脂血症的目的。
[0079]
表1.各组小鼠血脂水平
[0080][0081]
注：与模型组比较，*，p<0.05，**，p<0.01。
[0082]
申请人还通过使用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素(stz)诱导小鼠ⅱ型糖尿病，ⅱ型糖尿病是一种代谢性疾病，可因长期肥胖导致。在发病过程中，gsdmd也发挥着重要的作用。从实验中申请人发现，给予荜茇十一碳三烯哌啶的小鼠的血糖和糖耐量都有明显的改善(表2和表3)。
[0083]
表2.各组小鼠血糖水平
[0084][0085]
注：与模型组比较，*，p<0.05，**，p<0.01。
[0086]
表3各组小鼠糖耐量
[0087][0088]
注：与模型组比较，*，p<0.05，**，p<0.01。。
[0089]
申请人还发现，给予荜茇十一碳三烯哌啶的小鼠胰腺中gsdmd蛋白的分泌量明显低于模型组(图4)。以上数据表明了荜茇十一碳三烯哌啶是通过抑制gsdmd的活化，从而抑制胰岛细胞的凋亡，来缓解ⅱ型糖尿病的症状，改善小鼠的血糖和糖耐量。
[0090]
gsdmd焦亡蛋白在肠炎的发病机制中也发挥了重要的作用，因此申请人探究了荜茇十一碳三烯哌啶对tnbs诱导的小鼠肠炎的作用。结果显示荜茇十一碳三烯哌啶能够改善肠炎引起的体重下降(图5a)，并且给予荜茇十一碳三烯哌啶后，申请人发现小鼠每天饮食量、大便性状及出血症状、疾病活动指数(dai)及组织病理学活动指数(hai)也具有明显的
改善(图5b和5d)，荜茇十一碳三烯哌啶组的结肠长度(colon length)也更接近正常小鼠，表明荜茇十一碳三烯哌啶能缓解肠炎造成的结肠损伤(图5c)。此外，荜茇十一碳三烯哌啶组结肠中gsdmd蛋白的含量也显著降低(图5e)。说明荜茇十一碳三烯哌啶是通过抑制gsdmd蛋白活化，阻止肠炎导致的结肠细胞焦亡，进而改善肠炎引起的结肠损伤。
[0091]
抗细胞焦亡也是缓解老年痴呆症的途径之一，最后申请人通过d
‑
半乳糖联合β
‑
淀粉样蛋白诱导sd大鼠老年痴呆症，来探究荜茇十一碳三烯哌啶能否通过抑制gsdmd达到治疗老年痴呆的作用。morris水迷宫实验结果显示，模型组大鼠具有明显的记忆障碍，表现出了痴呆的症状(图6b)，而荜茇十一碳三烯哌啶组的大鼠空间记忆能力具有一定的改善(图6c)。gsdmd elisa检测结果显示，d
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半乳糖联合β
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淀粉样蛋白诱导的老年痴呆的大鼠gsdmd蛋白分泌水平明显升高，给予荜茇十一碳三烯哌啶的大鼠大脑中gsdmd蛋白分泌水平显著降低(图6d)。说明荜茇十一碳三烯哌啶能通过抑制gsdmd的活化，从而抑制d
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半乳糖联合β
‑
淀粉样蛋白诱导的神经元死亡，而达到改善老年痴呆症状的效果。
[0092]
实施例3：荜茇十一碳三烯哌啶的急性毒性研究
[0093]
取6
‑
8周龄健康km小鼠，购于湖北省动物实验中心，适应性喂养三天。随机分组，分为空白组(control)、秋水仙碱组(colchicine)和荜茇十一碳三烯哌啶组(piperundecalidine)，每组20只。第一天，秋水仙碱组小鼠尾静脉注射秋水仙碱4.13mg/kg，荜茇十一碳三烯哌啶组尾静脉注射4.13mg/kg，空白组注射等体积的0.9％的生理盐水。每天观察小鼠死亡情况，持续14天。
[0094]
结果分析
[0095]
秋水仙碱在临床用于治疗痛风性关节炎的急性发作，根据秋水仙碱的急性毒性实验，小鼠静脉注射ld
50
为4.13mg/kg，申请人的实验也证明了，秋水仙碱组小鼠在4.13mg/kg的剂量下，出现部分小鼠死亡(接近一半)，但是荜茇十一碳三烯哌啶组在相同剂量下小鼠死亡数量远低于秋水仙碱(如图7)，则说明，本研究中荜茇十一碳三烯哌啶具有更高的安全性。