采用阴离子交换色谱法的生物分子(如质粒DNA)纯化工艺的制作方法

采用阴离子交换色谱法的生物分子(如质粒dna)纯化工艺
发明领域
1.本发明提出了一种新的用于纯化或分离相关生物分子(如质粒dna(pdna))的改进方法。所述方法包括简单有效地去除rna、基因组dna、蛋白质、细胞碎片或其组合等杂质。本发明的新方法特别适用于大规模生产工厂，可提供优质、高收率的纯化pdna，同时还可缩短加工时间、降低成本。
2.纯化生物分子，特别是通过本发明的方法获得的pdna，特别适用应用在合成瞬时生产、体外基因治疗、rna治疗药物、dna疫苗、dna抗体、非病毒基因治疗和病毒载体等领域。通过本发明的方法获得的纯化生物分子也可用于疫苗、病毒治疗、基因和细胞治疗、体内或体外分子(如rna或多肽)生产或嵌合抗原受体(car)t细胞治疗等方面。
3.本发明还描述了郁金香形容器的新应用，该容器适用于澄清含有相关生物分子的样品。在从含有生物分子的混合物中分离固体组分的相分离过程中，可使用郁金香形容器或储罐。更具体地说，本发明说明了郁金香形容器或储罐在相分离过程中收获含有生物分子的低相(即密度较大)混合物的新用途。


背景技术：

4.质粒dna是一种从染色体dna中物理分离的小分子，可独立复制。质粒dna通常以三种不同的构象方式存在：超螺旋pdna、开环pdna和线状pdna。鉴于pdna的各种治疗应用，包括但不限于合成瞬时蛋白生产、体外基因治疗、rna治疗药物、dna疫苗、dna抗体、非病毒基因治疗和病毒载体，本领域的技术人员应了解，非常有必要改进pdna的纯化或分离方法。
5.考虑到pdna的高负电荷，常采用阴离子交换色谱法纯化或分离pdna。阴离子交换材料含有带正电荷的基团。如果采用阴离子交换色谱法，可根据电荷情况通过阴离子交换材料来分离溶液中的蛋白质等分子。正如本领域技术人员所理解的那样，在阴离子交换色谱法过程中所使用的盐浓度将有所不同，具体取决于待洗脱的物质。典型阴离子交换材料的示例包括各种阴离子交换膜、珠和树脂。然后，根据适当缓冲液的盐浓度递增梯度，对结合到阴离子交换材料上的蛋白质进行洗脱。因此，已知阴离子交换色谱法通常采用低盐浓度的缓冲液上样，在洗脱步骤中提升盐浓度。
6.当采用阴离子交换色谱法纯化pdna时，特别是在工业规模下，在将含有pdna的溶液装载到阴离子交换柱之前，通常会执行多个上游步骤。这些步骤通常包括补料分批发酵、细胞收获和洗涤、连续细胞裂解、中和、rna去除、絮凝去除深层过滤、质粒浓缩和渗滤。pdna纯化工艺通常包括阴离子交换色谱法(aex)，其中包括使用电导率较低的盐将pdna结合到阴离子交换材料上，然后使用电导率较高的盐对pdna进行洗脱，通过缓冲液交换进行切向流过滤，然后对含有pdna的各部分进一步纯化，以进一步富集超螺旋pdna，如通过plasmidselect(psx)色谱法(可从通用电气医疗集团技术部获取)，然后通常使用最终灌装缓冲液和缓冲液交换方式进行进一步的切向流过滤。在这些已知的基于阴离子交换色谱法纯化或分离pdna的方法中，通常通过逐渐提升洗脱缓冲液的盐浓度来完成洗脱。
7.如上所述，在初始结合和洗脱之后，还需执行进一步的步骤，以获得纯度和收率可
接受的pdna。此外，已知的pdna纯化方法会导致选择性和回收率不佳。因此，已知方法不能实现有效的且具成本效益的pdna分离。同样值得注意的是，上述许多已知方法都存在使用peg或其他添加剂的缺点，由于这些添加剂需要附加分离、处理和质控，而这些操作可能很困难，更耗费时间并且成本更高，因此在制备质粒dna时可能不宜采用。由于这些附加步骤会增加纯化工艺成本以及纯化时间，因此需要一种在纯化过程中无需进行多项附加步骤的pdna纯化和分离方法，从而缩短纯化时间，而不会影响pdna的纯度或收率。
8.正如本领域的技术人员所理解的那样，已知生物分子(如pdna)纯化工艺的另一个缺点是不适合大规模生产，特别是大规模生产医药级pdna。大规模生产目前存在多种限制，例如个人安全问题和危险废物考虑因素。此外，将工作台规模的pdna纯化工艺应用于更大规模，几乎总会导致纯化pdna收率降低。鉴于这些限制，需要提供一种不仅可提供更高纯度和高收率的pdna，而且还可用于大规模生产的pdna纯化或分离方法。


技术实现要素：

9.本发明的第一个方面涉及一种从混合物中分离或纯化相关生物分子的方法，所述方法包括以下步骤：在包含一定浓度盐的溶液中使含有相关生物分子的混合物接触阴离子交换(aex)材料，所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上；使用一种洗脱剂对相关生物分子进行洗脱，所述洗脱剂包含一定浓度的盐，使洗脱液中含有纯化的生物分子。在一些实施例中，可选地收集含有所述相关生物分子的洗脱液。在某些情况下，可从任何一个或所有收集部分中分离出相关纯化生物分子。
10.在一些实施例中，可使相关生物分子选择性结合到aex材料上的所述一定浓度的盐是一种亲液盐，例如柠檬酸铵、硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠或所述盐的混合物。
11.在一些实施例中，洗脱剂中可使洗脱液含有纯化生物分子的所述一定浓度的盐是一种离液盐，如氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁、盐酸胍或其混合物。
12.使用本发明的方法纯化的生物分子通常是一种高极性/带电生物分子，如核酸。据发现，本文所述的新方法特别适用于快速、高效纯化质粒dna，特别是医药级超螺旋质粒dna(sc pdna)，此类质粒dna不得含细菌基因组dna、rna、蛋白质和内毒素。
13.另一方面，本发明提供了一种有利的样品制备步骤，可在使含有相关生物分子的混合物接触aex材料前有利的使用。
14.在这方面，可通过相分离和/或过滤方便地分离含有相关生物分子的混合物的固体组分(如细胞碎片或缓冲系统中的其他不溶性材料)。在这方面的一些实施例中，通过简单的两相分离，去除固体组分，其中，将加入缓冲液，使混合物的密度增至约1.1kg/l以上。混合物密度增加导致固体组分浮在上面，无需过滤步骤，即可方便地排出混合物(含有相关生物分子)的液体部分(或由于固体材料含量显著减少，至少具备更高的过滤能力，从而使工艺具有可扩展性，即使其可用于大规模生产)。在一些实施例中，可将该样品制备步骤与本文所述的新纯化方法有利结合。
15.本发明的相关方面还涉及将郁金香形容器或储罐用于上述相分离步骤。据发现，郁金香形容器或储罐特别适用于方便有效地从含有相关生物分子(如质粒dna)的混合物的液体部分中分离固体组分。
附图说明
16.图1为在工作示例中用作待纯化样品生物分子的质粒载体puc19的示意图。
17.图2a
‑
d显示了将sartobind q用作aex材料的结合缓冲液筛选结果的琼脂糖凝胶电泳(age)数据。
18.图3a
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d显示了将sartobind q用作aex材料的洗脱缓冲液筛选结果的琼脂糖凝胶电泳(age)数据。
19.图4为在洗脱梯度上放大的aex色谱装置(sartobind q)的色谱图。
20.图5显示了aex色谱法步骤(sartobind q)中各部分的琼脂糖凝胶电泳数据。
21.图6显示了图3所示的sartobind q洗脱池1(虚线)和标准品(实线)的aex
‑
hplc色谱图。
22.图7显示了sartobind q色谱法步骤中的上样和洗脱池的sds
‑
page分析数据。
23.图8包括主要回收工艺(包括aex色谱法步骤)的图示。
24.图9为使用sartobind q的aex装置的色谱图。
具体实施方式
25.正如本领域的技术人员所理解的那样，鉴于质粒dna的各种治疗应用，特别是由于通常更适用于小规模生产(如实验室和工作台规模生产)的许多已知分离/纯化步骤无法在更大规模上充分转化，非常有必要开发一种简单、可扩展的高纯度和高产量质粒dna纯化方法。
26.本发明提供了分离或纯化生物分子(如质粒dna)的方法。本发明特别包括在定义的异常条件下采用阴离子交换色谱法纯化或分离质粒dna的方法，更具体地说，不含杂质的超螺旋质粒dna，包括开环pdna、线状pdna、内毒素、rna、脂多糖、基因组dna、蛋白质和/或其组合。本发明的方法特别适用于在有限数量的步骤中对生物分子(如质粒dna，特别是超螺旋质粒dna)进行大规模分离或纯化并确保高纯度和高收率。特别是，本发明的纯化方法可用于体积高达10000升发酵工作体积的大规模生产。
27.应理解，术语“相关生物分子”、“靶分子”为同义词，系指根据纯化方法从混合物的其他组分或杂质中纯化的分子。
28.杂质包括但不限于宿主细胞蛋白质、内毒素、宿主细胞dna和/或rna。应理解，可根据本发明的方法所实施的环境确定什么是杂质。“杂质”可能是或可能不是宿主细胞衍生物，即可能是或可能不是宿主细胞杂质。
[0029]“分离”或“纯化”相关生物分子(如质粒dna)系指从与靶分子最初相关的其他组分中富集靶分子。本文提供了所需和/或可获得的纯化程度。本发明的方法会产生优选约5倍富集、优选约10倍富集、优选约20倍富集、优选约50倍富集、优选约100倍富集、优选约200倍富集、优选约500倍富集、优选约1000倍富集。或者，可以用第一个组分与另一个组分或与所得制剂的百分比表示纯化程度。本文提供了此类百分比的示例。
[0030]
发明人惊讶地发现，可快速、简单、直接地纯化相关生物分子(如超螺旋质粒dna)。在允许待纯化生物分子高度选择性结合的条件下使含有相关生物分子的混合物接触阴离子交换(aex)色谱材料，而混合物中的其他组分不会结合到aex材料上，如此即可实现这一点。
[0031]
在这方面，发明人发现，将含待纯化生物分子的混合物与aex材料装载至某些盐浓度相当高的溶液中时，会导致所需生物分子与aex材料高特异性结合，即溶液中的大多数组分不会结合到aex材料上。对于aex色谱法，这些上样条件非同寻常，其中，通常在低离子强度条件下使待纯化样品接触aex材料，然后通过(逐渐或逐步)提升洗脱缓冲液的盐浓度/离子强度进行洗脱。换句话说，在该发明人所确定的特定上样条件下，可在aex色谱法步骤的上样阶段有效富集靶分子，并可能在适当的洗脱条件下进一步纯化，详细说明见下文。
[0032]
因此，在该发明人所确定的条件下执行aex色谱法步骤时，可在一个纯化步骤中从基本所有不需要的污染物中分离所需生物分子。事实上，发明人发现甚至还可以省去常用于相关生物分子纯化的多个预备和预纯化步骤，因为其可将靶分子有效、高度选择性地结合到aex材料上，而许多污染物在谨慎选择的这些条件下并不会与aex材料结合，更详细的解释见下文。
[0033]
本发明通常涉及一种从混合物中分离或纯化相关生物分子的方法，其具体包括以下步骤：在包含一定浓度盐的溶液中使含有相关生物分子的混合物接触阴离子交换(aex)材料，所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上；使用一种洗脱剂对结合至aex材料的相关生物分子进行洗脱，所述洗脱剂包含一定浓度的盐，使洗脱液含有相关纯化生物分子。
[0034]
本发明上下文中的“选择性结合”系指在盐浓度适当的溶液中接触时，混合物中绝大多数的其他组分均不会结合到aex材料上。本领域的技术人员理解，在生物学(及化学)中，结合、洗脱等不会100％被排除，但在本发明中，“选择性结合”系指在存在盐溶液时，至少70％、80％、85％、90％，甚至95％的其他组分(“污染物”)不会在接触时结合到aex材料上。为方便起见，使混合物接触aex材料在此也可称为“上样步骤”(如柱色谱法常用的那样，当然，本方法并不仅限于柱色谱法)，含有待纯化混合物的盐溶液也被称为“上样缓冲液”或“上样溶液”。盐溶液也可称为“结合缓冲液”。
[0035]
通常收集洗脱液中含有相关纯化生物分子的一个或多个部分，但这并不总是必要的(例如在分析纯化运行中，可通过uv光谱法等在溶液中直接测量相关分子的浓度/纯度)。同样，如下所述，在大多数情况下，从任何一个或所有收集部分中分离相关生物分子，以供进一步使用。
[0036]
对于大多数生物分子，分离并不一定意味着沉淀和干燥，而是将纯化分子保存在典型的缓冲溶液中，以便在长期储存时确保降解稳定性。因此，分离也可能包括浓缩，即去除部分溶剂，以提升靶分子的浓度。正如本领域众所周知的那样，在许多情况下，含有生物分子(不论是蛋白质还是基于核酸的生物分子)的溶液均可储存在冷冻溶液中，但在某些情况下，也可通过冻干等去除溶剂。
[0037]
aex色谱法的典型特征是在含盐缓冲液/低离子(即盐浓度相当低)的缓冲液中将待纯化混合物装载到aex材料上。这些条件允许高极性和/或带电分子结合到aex材料的带电基团上，而低极性/亲水性组分在此类条件下则不会结合。然后，通常通过递增盐/缓冲液的浓度，使数量递增的离子与仍结合在aex材料上的分子相竞争，从而从色谱柱中洗脱相关分子。为了达到所需高纯度，通常通过aex色谱法，使用提升洗脱缓冲液离子强度的梯度进行纯化。但是，在许多情况下，常规aex色谱法不能达到足够高的纯度，因为在上样阶段，太多的污染物(特别是带电/高极性污染物)也会结合到aex材料上，然后作为相关分子同时进
行洗脱。
[0038]
发明人惊讶地发现，可在盐浓度相对较高的溶液中执行上样操作(即混合物与aex材料初步接触)。在一些实施例中，所述上样阶段中所使用的适当盐可以称为亲液盐，它们可以使水分子进行有利的相互作用，有助于水
‑
水相互作用的稳定性和结构(“保持有序”)，也会使蛋白质等大分子的分子内相互作用稳定化。离子亲液剂以强溶剂化能为特征，通常会导致溶液的内聚力上升(常由溶液粘度和密度增加表示)。相反，离液剂/盐(无序因素)具有相反的效果，会破坏结构，提升非极性溶剂颗粒的溶解性，并使溶质总体不稳定。
[0039]
发明人发现，在接触aex材料的溶液中以足够高的浓度使用此类亲液盐时，会导致某些生物分子(特别是质粒dna等具有高电荷密度的生物分子)发生高度选择性结合现象，同时会阻止其他组分结合到所述aex材料上。因此，在某些情况下，在亲液盐浓度足够高的溶液中，上样步骤的“流穿液”已包含含有相关生物分子的混合物中的大多数污染物(即使不是全部)。
[0040]
应理解，亲液性或离液性通常归因于特定离子，而非盐(含有抗衡离子)。因此，盐很可能含有已知具有亲液性的阴离子，而抗衡离子则已知具有离液性。此类盐可能(或可能不会)使靶分子选择性地结合到aex材料上。但是，本领域的技术人员通过简单地进行常规实验，就能够确定给定盐在高浓度下是否可确保靶分子选择性结合到aex材料上。
[0041]
在大多数实施例中，可使用离液盐浓度足够高以洗脱相关生物分子的洗脱剂(即一种用于分离结合到aex材料上的组分的溶液或缓冲液)，从aex材料中洗脱靶分子。因此，在许多实施例中，洗脱阶段与常规aex色谱法并无实质差异，但是，由于在上样阶段与aex材料结合的特异性更高，洗脱液的纯度通常显著提升。
[0042]
在一些实施例中，通过本发明的方法纯化的生物分子是一种核酸(包括dna和rna)。例如，当相关生物分子为质粒dna时，通过本发明的方法已获得有利结果。质粒dna通常以不同的构象存在：除“天然”超螺旋(sc)构象之外，质粒dna还以开环(oc)形态，甚至线状形态存在。由于超螺旋质粒dna(sc pdna)通常代表质粒dna的所需(及商业相关)构象，因此，在本发明这一方面的一些实施例中，相关生物分子为sc pdna。
[0043]
待纯化/分离的质粒dna通常包括哺乳动物dna、细菌dna、非编码dna或病毒dna。在某些情况下，质粒dna将包括能够表达相关多肽的dna。纯化方法通常并不取决于质粒dna的大小，即通过本文所述方法可有效纯化仅350bp的小载体和包含多达20个基因(35kbp)的大质粒载体以及大小在两者之间的任何载体。
[0044]
本发明的方法可从其他污染物中有效纯化质粒dna。因此，在某些实施例中，质粒dna的所获纯度至少为90％、93％、95％、97％、98％或99％。
[0045]
在一些实施例中，所述方法甚至可以分离超螺旋质粒dna与其他质粒dna形态(如线状质粒dna、开环质粒dna)以及(可选地)其他核酸分子。
[0046]
由于相关生物分子通常通过生物工艺(如细胞培养/发酵工艺)获得，因此，在一些实施例中，含有靶分子的混合物包含质粒dna(包括超螺旋pdna、开环pdna和线状pdna)、基因组dna、rna、脂多糖、内毒素、蛋白质或上述组分的任何组合。
[0047]
应理解，在上样步骤中使相关生物分子选择性结合到aex材料上的盐浓度通常取决于靶分子的性质以及所选aex材料。在一些实施例中，已使用约大于0.5m、0.6m或0.8m的盐浓度实现靶分子的高度选择性结合。在某些实施例中，允许靶分子选择性结合的溶液盐
浓度约为0.5m
‑
4.0m、0.8m
‑
2.0m或1.0m
‑
2.0m(如1.5m)。
[0048]
在本文中，术语“约”系指大概、大约、大致或左右。当术语“约”与数值范围连用时，它通过将边界扩展至所述数值以上及以下来修改该范围。在本文中，术语“约”通常用于按10％的变化将数值修改至规定值以上及以下。
[0049]
如前所述，上述浓度的亲液盐首选用于本纯化方法的上样步骤。在任何情况下，用于上样步骤的所述盐的理想浓度取决于靶分子的实际特性以及aex材料，但可由本领域的技术人员通过常规实验轻松确定。在确定适当浓度后，使用与含有待纯化靶分子的上样溶液浓度相同的缓冲液来平衡aex材料可能有助于一致、可重复的结合。
[0050]
在任何情况下，适当亲液盐的示例包括但不限于硫酸铵、柠檬酸铵、磷酸铵、磷酸钾、柠檬酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠或其混合物。例如，据发现，当待纯化的靶分子为质粒dna时，硫酸铵是一种在上样阶段特别有用的亲液盐。
[0051]
从示例1中可以看出，在硫酸铵浓度较高(>0.5m)的溶液中将混合物装载到可选预平衡aex膜上，可确保pdna高度选择性结合到aex材料上，而rna及其他污染物不会结合到aex膜上(参考图2a和2b)。因此，在某些实施例中，上样溶液中硫酸铵的有用浓度约为0.5m
‑
2.0m。
[0052]
本领域的技术人员理解，其他因素也可能影响混合物中各组分的结合行为。其中一个因素为溶液的ph。对于生物分子，用于纯化的可用ph范围自然相当有限。为了避免可能对靶分子稳定性产生不利影响(例如通过促进生物分子水解)的ph条件，虽然首选接近于中性的ph值，但是，在相关生物分子上样和洗脱过程中，ph值通常在ph 2到ph 11之间，特别是对于在酸性或碱性条件下对降解很敏感的生物分子。例如，在一些实施例中，含有与aex材料接触的亲液盐的溶液(即“上样缓冲液”)的ph值在4
‑
9之间、5
‑
8之间、6
‑
10之间或6
‑
8之间(如7.0左右)。本领域的技术人员认为，根据常规实验结果可确定最佳ph条件。
[0053]
还应理解，ph变化(例如在洗脱步骤中)可能会改变结合到aex材料上的生物分子的结合行为/强度，因此，在一些实施例中，可以受控和选择性方式从aex材料中释放靶分子。但是，在其他情况下，靶分子结合到aex材料上基本与ph无关。例如，在较宽的ph范围(低至ph 2)内，质粒dna结合保持不变。
[0054]
对于选择用于靶分子洗脱的条件，可使洗脱液含有相关纯化生物分子的所述一定浓度的盐(优选离液盐)浓度通常在约0.25m
‑
4.0m、0.4m
‑
3.0m或0.5m
‑
2.0m。正如本领域众所周知的那样，洗脱步骤可能包括根据改变洗脱剂中盐(优选离液盐)的浓度来进行梯度洗脱，其中通常涉及提高洗脱液中的盐浓度。
[0055]
在一些实施例中，用于洗脱步骤的离液盐选自：氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁、盐酸胍及其混合物。硫酸镁是一种特别有用的盐，特别是对于质粒dna纯化很有用。在这些实施例中，离液盐(例如硫酸镁或氯化钠)的浓度通常至少约为0.5m，在某些情况下，可能约为0.5m
‑
2.0m或0.5m
‑
1.0m。
[0056]
此外，与上样缓冲液中含有的亲液盐一样，用于靶分子洗脱的离液盐及其最佳浓度也取决于相关生物分子的性质以及用于纯化的具体aex材料，并且本领域的技术人员可根据常规实验结果轻松确定。由于aex材料通常可重复用于另一次纯化运行，因此，在结束时加入高盐浓度洗脱可能有用(例如使用约2.0
‑
4.0m的nacl)，这将从aex材料中基本洗脱所有结合材料。
[0057]
原则上，对于本发明的方法，可使用任何可用aex材料。例如，可在弱、强aex设置下以及在较高及较低的配体密度条件下，使用不同的珠化学成分和/或接头执行所述方法。适当的aex材料可用作阴离子交换膜、阴离子交换树脂、三维微孔水凝胶结构、一层超多孔珠、大孔珠、整块材料、琼脂糖珠、交联琼脂糖、硅珠、大孔凝胶、甲基丙烯酸酯基珠、聚苯乙烯基珠、纤维素基珠、葡聚糖基珠、双丙烯酰胺基珠、聚乙烯醚基珠、陶瓷基珠或聚合物基珠。商用aex材料示例包括sartobindmustangmustangporosporosnuviacaptobakerbonddeaenh2
‑
qgigaq
‑
650m、emd coo、hd
‑
q和3m
tm
emphaze
tm
aex混合纯化器(所有材料均已注册商标名称)。
[0058]
特别是对于大型工业规模的纯化，可采用aex膜色谱法或树脂床色谱法执行所述方法。在一些实施例中，阴离子交换膜的平均孔径约为3.0μm
‑
5.0μm，优选平均孔径约为3.0μm。
[0059]
或者，可采用aex柱色谱法执行所述方法。在这些实施例中，阴离子交换树脂的平均粒径优选约为30μm
‑
300μm。
[0060]
在任何情况下，本领域的技术人员理解，本文所述方法不要求aex材料采用特定的形式，如上述其他替代方法，并且也可以在本文所述的纯化方法中用作纯化剂。
[0061]
由于所述方法有卓越的纯化能力，通常可以在不使用任何有机溶剂、洗涤剂、乙二醇、六氨合钴、亚精胺和/或聚乙烯吡咯烷酮的情况下执行，因此在以分离形态提供最终靶分子前，不再需要去除这些药剂。
[0062]
虽然aex纯化步骤代表本发明的主要方面，但是，相关生物分子的纯化方法通常包括进一步的方法步骤，其中包括在aex色谱法步骤前进行的步骤，以及在aex色谱法步骤后进行的附加步骤(可选地)。
[0063]
如前所述，通常从所谓的细胞培养物中生长的细胞中获得相关生物分子。在某些情况下，当分子由细胞分泌到周围细胞培养基中时，可直接从细胞培养物中获得相关生物分子。但是，正如本领域众所周知的那样，在大多数情况下，需要通过细胞裂解来破坏细胞，从细胞中释放靶分子，这可通过物理和/或化学方法实现。细胞裂解通常会产生靶分子和大量宿主细胞衍生的水溶性和不溶性污染物，如细胞膜、细胞器、基因组dna、rna和宿主细胞蛋白质。因此，靶分子的纯化通常需要去除这些污染物，特别是在aex色谱步骤之前，通常通过机械方法去除固体(即不溶性)污染物。
[0064]
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括在使混合物接触aex材料前，从含有相关生物分子的混合物中分离固体组分。
[0065]
可通过过滤或相分离，去除待纯化混合物中的固体组分。在某些情况下，所述方法步骤可通过两相分离(如固液相分离)来去除固体组分。
[0066]
在一些实施例中，为了实现更好的分离，可通过提升混合物的密度(例如增至约1.1kg/l以上)等改变含有固体组分的混合物。混合物密度的此类增加会导致固体组分(如细胞碎片或其他沉淀物质)浮在混合物上面。然后，可从盛装混合物的容器/储罐的底部方便地排出含有相关生物分子(如质粒dna)的溶液。因此，通过密度调整(如至少调整至约1.1kg/l)，无需过滤即可获得澄清的混合物，并可用于随后的aex色谱步骤。通常可通过各
种操作来提升溶液的密度，例如，水溶性盐、碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、甘油等)、尿素或提升水溶液密度的其他组分。特别是对于本发明的纯化方法，使用同样适用于aex色谱法步骤上样步骤的亲液盐可能很有利，如上述任何示例性亲液盐。
[0067]
或者，用于去除不溶性污染物的相分离技术也可以通过以其他方式改变混合物的密度来实现。例如，向混合物中加入醇类(例如乙醇、甲醇、异丙醇等)将降低密度，导致固体组分在容器或储罐底部沉降(可选地，可通过离心辅助沉降)。另一种选择是向混合物中加入液体无水化合物，以建立液/液两相系统，例如peg/盐两相系统，其中不溶性颗粒为peg相，靶分子(如质粒dna)为盐相。
[0068]
此外，还理解，在某些情况下，可将轻微过滤(例如深层过滤)应用于混合物的液体排出部分和/或最终剩余体积的混合物(以使收率最大化)。可选的附加过滤步骤可确保去除混合物液体部分中的剩余固体颗粒。在任何情况下，应理解，此类过滤更快，并且由于混合物中的固体含量更低，不会堵塞过滤器。深层过滤装置可以在市场上买到，如merck
‑
millipore的深层过滤器。
[0069]
由于所述方法也可用于其他纯化方法的准备阶段，因此，本发明的另一个方面涉及上述两相分离，即随后不是或不一定是本发明的aex色谱法步骤。
[0070]
发明人还发现，郁金香形容器或储罐对于去除混合物中的固体组分特别有用，特别是在将密度调整至约1.1kg/l时，这将确保固体组分浮在固/液两相混合物的上面，即容器/储罐直径大于排出液相的容器底部的位置(见图8中的郁金香形容器)。因此，使用郁金香形储罐或容器进行上述两相分离代表本发明的另一个方面。
[0071]
上述两相分离是一种高效、快速、可重复且经济的方法，用于制备含有相关生物分子的溶液，以供任何随后纯化步骤使用，如本发明的aex色谱法步骤。特别是在利用后续aex色谱法步骤中所用的相对较高浓度的亲液盐(如硫酸铵)完成密度调整时，两相分离可能是在收获细胞上清液后需执行的唯一一个步骤(在使混合物接触aex材料前，可能与深层过滤结合)。由于一些亲液盐用作缓冲液，使用所述亲液盐调整混合物密度的另一个优势为，在细胞裂解后需要使用较少的中和缓冲液(防止靶分子可能的降解现象)。
[0072]
此外，通过简单排出含有靶分子的密度较大的溶液来方便地去除固体组分非常有利于后续(虽然可选)深层过滤，不仅仅是由于过滤器仅处理不溶性颗粒的一小部分，所需过滤面积大大减少。
[0073]
在一些实施例中，本发明的aex色谱法可能涉及相关纯化生物分子洗脱后的进一步步骤。例如，在某些情况下，所述方法进一步包括从洗脱液中沉淀相关生物分子。沉淀可通过本领域众所周知的各种方法实现，如改变含有靶分子的洗脱液部分的ph，或向洗脱液中加入抗溶剂或其他添加剂，从而使靶分子从洗脱液中沉淀。
[0074]
沉淀后，所述方法在某些情况下进一步包括通过切向流过滤来过滤洗脱液来分离沉淀的生物分子。例如，在某些情况下，切向流过滤步骤中所用过滤膜的平均孔径≤0.45μm，甚至≤0.2μm。
[0075]
在某些情况下，所述方法可能进一步包括将相关纯化生物分子冻干，该操作可在存在储存时可使质粒dna稳定在冻干形态的碳水化合物的情况下完成。正如本领域众所周知的那样，许多但单糖或二糖均可用于所述目的。
[0076]
在其他实施例中，所述方法将进一步包括对含有纯化靶分子的部分进行稀释、浓
缩或缓冲液交换。在某些情况下，靶分子可进行化学修饰(例如生物素化、甲基化、乙酰化)，或切成更小的片段(例如，对于核酸，由限制性内切酶消化)。
[0077]
根据具体的纯化问题以及靶分子来源，在某些情况下，从上样步骤(即在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触aex材料，所述一定浓度的盐可使生物分子选择性结合到阴离子交换材料上)中进一步收集流穿液。
[0078]
如本文所述，aex色谱法步骤能够使相关生物分子选择性结合到aex材料上，即混合物中的大多数无用组分在这些上样条件下不会结合到aex材料上。例如，为了从细胞培养物中纯化质粒dna，流穿液可能包含rna、基因组dna、蛋白质、细胞碎片或其组合。在一些实施例中，流穿液将包含与aex材料接触的混合物中的基本所有(即至少80％、至少90％，甚至至少95％)rna。
[0079]
在某些情况下，可通过进一步纳入洗涤步骤来改进纯化。因此，在一些实施例中，所述方法将进一步包括在相关生物分子洗脱前使用洗涤缓冲液洗涤aex材料。在某些情况下，可使用其他干净的“上样”缓冲液(即通常含有相对较高浓度的亲液盐)继续洗涤。在其他情况下，洗涤缓冲液可能含有浓度低于相关生物分子洗脱所需浓度的离液盐。
[0080]
在这些情况下，洗涤缓冲液也可能含有亲液盐(浓度可能低于上样缓冲液中的浓度)，或可能仅含有离液盐。优选从包括以下盐的一组中选择用于洗涤缓冲液的离液盐：氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁及其混合物。特别是在离液盐没有缓冲能力时，洗涤缓冲液可能进一步含有可将ph保持在所需水平的适当缓冲物质。虽然在纯化效率方面可能并不需要，但是，为简化起见，在许多情况下，洗涤缓冲液可能含有与洗脱剂相同的离液盐。
[0081]
应进一步理解，特别是在靶分子纯化必须获得纯度极高的产物时，本发明的方法可能进一步包括一个附加纯化步骤，该步骤通常在从aex色谱法步骤中洗脱并可选地分离生物分子步骤之后。在一些实施例中，即待纯化的靶分子为超螺旋质粒dna时，第二个纯化步骤可能因此涉及使用由通用电气医疗集团生命科学部提供的商品名为plasmidselect(简称“psx”)的嗜硫芳烃吸附色谱介质。众所周知，这种特殊树脂有出色的选择性，可将超螺旋质粒dna从开环和/或线状质粒dna中分离出来，因此可用于对医药级dna的超螺旋构象进行最终富集。
[0082]
在一些实施例中，所述方法将进一步包括，在核酸(如质粒dna)纯化和分离后，使用所述核酸表达所述核酸所编码的相关多肽的进一步步骤。在这些情况下，此类核酸优选为质粒dna。通常将收获并可选地纯化通过核酸(优选质粒dna)产生的多肽。最后，在某些情况下，所述方法甚至可能包括将多肽(通过纯化核酸表达获得)配制成药物组合物，其中可能含有一种或多种可药用的赋形剂。
[0083]
或者，当核酸(如质粒dna)旨在直接用于制药时，所述方法可能包括将核酸配制成药物组合物，其中可能可选地含有一种或多种可药用的赋形剂。通过本发明的方法纯化的质粒dna可用作dna疫苗或“前药”，其中质粒将涉及细胞转录和翻译装置，以在体生物合成治疗实体。
[0084]
在其他实施例中，所述方法将进一步包括使用纯化血浆dna生产rna，包括基于rna的药物，生产较短的寡核苷酸，如sirna或适配子(短单链核酸片段)(通常20
‑
60个核苷酸)，或生产dna酶(核酶类似物，其中rna骨架由dna基序代替，生物稳定性得到了提高)。
[0085]
涉及aex色谱法的纯化方法的一个首选变体包括所述aex色谱法步骤前的细胞收获和洗涤、细胞裂解、中和以及在使含有相关生物分子的溶液接触aex材料前的絮凝去除步骤。
[0086]
如上所述，针对aex上样步骤确定的各个条件允许质粒dna选择性结合到aex材料上。因此，在标准低盐条件下通常也会结合到aex材料上的rna不会或本质上不会在本文所述的上样条件下结合到aex材料上，因此可以在一个步骤中从靶分子中定量去除。
[0087]
因此，本文所述的方法有很大的优势，即无需通过氯化钙(cacl2)沉淀步骤来去除rna。避免附加纯化步骤在收率、成本和总体纯化方法持续时间方面当然是有益的。因此，在某些实施例中，所述方法的进一步特征在于，不需要氯化钙(cacl2)沉淀步骤。
[0088]
对于同样不会在本文所确定的条件下结合到aex材料上的蛋白质来说，也是如此。由于与超螺旋质粒dna相比，开环pdna、线状pdna和基因组dna与aex配体的相互作用强度不同，因此，在aex色谱法步骤中，其水平大大降低。因此，本文所述的方法可简单、快速、高效且经济地纯化相关生物分子(如质粒dna)，其中基本上只涉及一个色谱步骤，该步骤涉及含aex配体的材料。
[0089]
可以避免现有技术所述的质粒dna纯化程序中通常需要的许多附加步骤，如缓冲液交换、(多次)深层过滤、cacl2沉淀，或附加色谱步骤，如psx色谱法(取决于sc pdna的所需含量)。最后，本文所述的方法可扩展用于大型生产工厂。
[0090]
在概括性地描述了本发明的各个方面后，本领域的技术人员明显发现，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行多次修改和轻微改动。此外，通过引用以下数量无限制的实施例和工作示例描述了本发明。
[0091]
1、一种从混合物中分离或纯化相关生物分子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0092]
在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触阴离子交换材料，所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上；以及
[0093]
使用一种洗脱剂对相关生物分子进行洗脱，所述洗脱剂包含一定浓度的盐，使洗脱液含有纯化生物分子；
[0094]
可选地，其中，收集含有洗脱液中所述生物分子的部分，进一步可选地，其中，从任何一个或所有收集部分中分离所述相关生物分子。
[0095]
2、根据实施例1所述的方法，其中，可使生物分子选择性结合到阴离子交换材料上的所述一定浓度的盐是一种亲液盐。
[0096]
3、根据实施例1或实施例2所述的方法，其中，可使洗脱液含有纯化生物分子的所述一定浓度的盐是一种离液盐。
[0097]
4、根据实施例1
‑
3所述的方法，其中，待纯化的生物分子是一种核酸。
[0098]
5、根据实施例4所述的方法，其中，所述核酸为质粒dna(pdna)，可选地，其中，所述质粒dna为超螺旋dna(sc pdna)。
[0099]
6、根据实施例5所述的方法，其中，所述质粒dna包括哺乳动物dna、细菌dna、非编码dna或病毒dna；可选地，其中，所述质粒dna包括能够表达相关多肽的dna。
[0100]
7、根据实施例5或实施例6所述的方法，其中，纯化和/或分离质粒dna的纯度至少为90％、至少为95％或至少为98％。
[0101]
8、根据实施例1
‑
7中任何一项所述的方法，其中，所述混合物包含超螺旋质粒dna、
开环质粒dna、线状质粒dna、基因组dna、rna、脂多糖、内毒素、蛋白质或其任何组合。
[0102]
9、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上的盐浓度约大于0.5m，可选地，其中，使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上的盐浓度约为0.8m
‑
4.0m。
[0103]
10、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，使洗脱液含有纯化生物分子的盐浓度约为0.25m
‑
4.0m。
[0104]
11、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，洗脱步骤包括通过改变洗脱剂中离液盐的浓度来进行梯度洗脱；可选地，其中，增加洗脱剂中离液盐的浓度。
[0105]
12、根据实施例11所述的方法，其中，生物分子为质粒dna，洗脱步骤包括分离超螺旋质粒dna与其他质粒dna形态(如线状质粒dna、开环质粒dna)以及(可选地)其他核酸分子。
[0106]
13、根据实施例2
‑
12中任何一项所述的方法，其中，从以下一组盐中选择亲液盐：硫酸铵、柠檬酸铵、磷酸铵、磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠及其混合物。
[0107]
14、根据实施例13所述的方法，其中，亲液盐为硫酸铵。
[0108]
15、根据实施例14所述的方法，其中，硫酸铵的浓度约为0.5m
‑
2.0m。
[0109]
16、根据实施例2
‑
15中任何一项所述的方法，其中，含有亲液盐的溶液的ph在约为5.0
‑
10.0、5.0
‑
8.0、6.0
‑
8.0或ph7。
[0110]
17、根据实施例3
‑
16中任何一项所述的方法，其中，从以下一组盐中选择离液盐：氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁、盐酸胍及其混合物。
[0111]
18、根据实施例17所述的方法，其中，离液盐为硫酸镁。
[0112]
19、根据实施例18所述的方法，其中，硫酸镁的浓度约为0.5m
‑
1.0m。
[0113]
20、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，从以下材料中选择阴离子交换材料：阴离子交换膜、离子交换树脂、三维微孔水凝胶结构、一层超多孔珠、大孔珠、整块材料、琼脂糖珠、交联琼脂糖、硅珠、大孔凝胶、甲基丙烯酸酯基珠、聚苯乙烯基珠、纤维素基珠、葡聚糖基珠、双丙烯酰胺基珠、聚乙烯醚基珠、陶瓷基珠或聚合物基珠。
[0114]
21、根据实施例20所述的方法，其中，阴离子交换材料是一种阴离子交换膜。
[0115]
22、根据实施例21所述的方法，其中，阴离子交换膜的平均孔径约为3.0μm
‑
5.0μm，优选地，其中，平均孔径约为3.0μm。
[0116]
23、根据实施例20所述的方法，其中，离子交换树脂的平均粒径约为30μm
‑
300μm。
[0117]
24、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，在不使用任何有机溶剂、洗涤剂、乙二醇、六氨合钴、亚精胺、聚乙烯吡咯烷酮的情况下执行所述方法。
[0118]
25、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，采用膜色谱法执行所述方法。
[0119]
26、根据实施例1
‑
24中任何一项所述的方法，其中，采用柱色谱法执行所述方法。
[0120]
27、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法进一步包括在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触阴离子交换材料(所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上)前，从含有相关生物分子的混合物中分离固体组分，
[0121]
可选地，其中，通过过滤或相分离实现固体组分的所述去除目的。
[0122]
28、根据实施例27所述的方法，其中，通过两相分离，去除固体组分，并加入缓冲液，使混合物的密度增至约1.1kg/l以上。
[0123]
29、根据实施例27或实施例28所述的方法，其中，缓冲液含有亲液盐，优选地，其中，亲液盐为硫酸铵。
[0124]
30、根据实施例27
‑
29中任何一项所述的方法，其中，对两相混合物的下层(具有比上层更高的密度)进行深度过滤。。
[0125]
31、将郁金香形容器用于实施例26至30中任何一项的方法。
[0126]
32、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法进一步包括从洗脱液中沉淀生物分子。
[0127]
33、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法进一步包括通过切向流过滤来过滤洗脱液来分离生物分子。
[0128]
34、根据实施例33所述的方法，其中，切向流过滤步骤中所用过滤膜的平均孔径≤0.2μm。
[0129]
35、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法进一步包括将相关纯化生物分子冻干，可选地，其中，在存在碳水化合物的情况下进行冻干。
[0130]
36、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法进一步包括在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触阴离子交换材料(所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上)后收集流穿液。
[0131]
37、根据实施例36所述的方法，其中，所述流穿液包含rna、基因组dna、蛋白质、细胞碎片或其组合，优选地，其中，所述流穿液包含rna。
[0132]
38、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法将进一步包括在相关生物分子洗脱前使用洗涤缓冲液洗涤阴离子交换材料。
[0133]
39、根据实施例38所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液含有浓度低于相关生物分子洗脱所需浓度的离液盐，其中，从以下一组盐中优选离液盐：氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁及其混合物。
[0134]
40、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法进一步包括洗脱和可选地分离生物分子后的进一步纯化；
[0135]
可选地，其中，第二个纯化步骤包括使用嗜硫芳烃吸附色谱介质，其选择性可使超螺旋质粒dna与开环和/或线状dna分离。
[0136]
41、根据实施例4
‑
40中任何一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用核酸表达相关多肽；优选地，其中，所述核酸为质粒dna。
[0137]
42、根据实施例4
‑
41中任何一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用核酸生产并收获相关多肽；优选地，其中，所述核酸为质粒dna。
[0138]
43、根据实施例42所述的方法，其中，所述方法进一步包括将相关多肽配制成药物组合物。
[0139]
44、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法包括细胞收获和洗涤、细胞裂解、中和以及在使含有相关生物分子的所获混合物接触阴离子交换材料前的絮凝去除步骤。
[0140]
45、根据任何一项前述实施例所述的方法，其中，所述方法不包括用于去除rna的cacl2沉淀步骤。
[0141]
示例
[0142]
示例1：使用阴离子交换材料sartobind q结合和洗脱样品质粒dna(puc19)的条件筛选
[0143]
使用前，通过0.2μm过滤器过滤在整个过程中使用的所有缓冲液。使含有质粒puc19(该质粒dna的图解性说明见图1)的大肠杆菌细胞生长、裂解并通过过滤方法澄清，更详细的说明见下文。
[0144]
细胞在分批补料条件下在小型生物反应器中生长至光密度65
‑
90，该值在600nm(od
600
)处测得。通过离心收获细胞(4400
–
4800，45分钟)。将在细胞生长结束时收获的细胞重悬于p1缓冲液(50mm tris，10mm edta；ph 7.4)中。然后，按1:1的比率(v/v)加入p2缓冲液(0.2m naoh，1％(w/v)sds)，以进行细胞的碱裂解。轻轻摇匀，然后在室温下静置5分钟。为了停止细胞裂解并中和混合物，加入适当体积的冷p3缓冲液(5m醋酸钾，醋酸，4℃)，其体积约占其他缓冲液体积的25％。轻轻摇匀后，按1:1的比率(v/v)加入含有3m硫酸铵的调节缓冲液，以改变溶液密度，从而使细胞碎片浮在溶液上部。然后，对溶液进行最终的深层过滤(merck
‑
millipore的clarisolve深层过滤器，孔径为40至0.5μm)，以去除任何剩余细胞碎片以及一些沉淀的基因组dna和蛋白质。过滤后，向滤液中加入适当体积的1m naoh，将滤液的ph调节至ph 7.0。
[0145]
结合和洗脱条件的筛选在液体处理机器人(freedom evo 150；tecan)上进行，并且允许并行运行96个色谱步骤。sartobind q 96孔板(货号：99iexq42gc
‑‑‑‑‑
v,sartorius)用于筛选。使用zeba spin脱盐板(货号：89808，thermoscientific)和相应结合缓冲液，通过更换缓冲液进行上样调节。在使用2.0ml上样溶液前，使用结合缓冲液平衡sartobind q装置。使用1ml相应结合缓冲液和1ml洗涤缓冲液(20mm磷酸钠，ph 7.5)对膜进行洗涤。使用1ml洗脱缓冲液对材料进行洗脱，然后使用1ml 4m nacl执行洗提步骤。通过琼脂糖凝胶电泳(age)进行样品分析，可对数量和质量进行估计。
[0146]
a)结合缓冲液筛选
[0147]
在第一轮，在不同浓度下筛选几种结合缓冲液，并使用含有2m nacl的20mm磷酸钠(ph 7.5)洗脱缓冲液进行洗脱。根据表1，装载洗脱液以及琼脂糖凝胶。除非另有说明，否则将表中所列的结合缓冲盐与20mm磷酸钠(ph 7.0)一起使用。
[0148]
表1：不同结合缓冲液条件下的上样方案。
[0149]
[0150]
[0151][0152][0153]
结合缓冲液筛选工作的结果如图2a
‑
2d所示，其中，上面板和下面板显示了相同凝胶在不同暴露时间后的结果(上面板＝较短暴露时间；下面板＝较长暴露时间)。凝胶右侧的标记显示了琼脂糖凝胶内的开环(oc)和超螺旋(sc)puc19质粒dna和rna杂质的条带。
[0154]
结果表明，在高盐浓度下结合是可行的，特别是在使用亲液盐(例如檬酸铵、硫酸铵、磷酸铵、柠檬酸钾、磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠等)时，并且此类结合基本与结合缓冲液的ph无关。结果还表明，与上样(参考泳道50和101)相比，特别是在高盐浓度条件下，rna的结合显著减少，或根本不会结合(例如泳道10
‑
15)。
[0155]
b)洗脱缓冲液筛选
[0156]
在第二轮，在不同浓度条件下筛选几种洗脱缓冲液，并使用含有20mm磷酸钠和1.5m硫酸铵(ph 7.0)的结合缓冲液完成样品混合物结合。根据表2，装载洗脱液以及琼脂糖
凝胶。除非另有说明，否则将表中所列的洗脱缓冲盐与20mm磷酸钠(ph 7.0)一起使用。
[0157]
表2：不同洗脱缓冲液条件下的上样方案。
[0158][0159]
[0160][0161][0162]
洗脱缓冲液筛选工作的结果如图3a
‑
3d所示，上面板和下面板显示了相同凝胶在不同暴露时间后的结果(上面板＝较短暴露时间；下面板＝较长暴露时间)。凝胶右侧的标记显示了琼脂糖凝胶内的开环(oc)和超螺旋(sc)puc19质粒dna和rna杂质的条带。
[0163]
结果表明，即使洗脱缓冲液的电导率显著低于结合缓冲液的电导率，在使用离液盐(例如氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁)时，也可从aex树脂中洗脱质粒dna。此外，大多数受试洗脱缓冲液的sc pdna洗脱能力均优于oc pdna洗脱能力，但不会洗脱rna。但是，经观察，某些离液盐(例如硝酸镁)优先洗脱oc pdna，而非sc pdna(参考图3c)。
[0164]
示例2：使用sartobind q和硫酸镁的puc19纯化，以使用磷酸盐缓冲系统进行洗脱
[0165]
a)纯化程序
[0166]
通过0.2μm过滤器过滤在整个过程中使用的所有缓冲液。如示例1所述，使含有质粒puc19的大肠杆菌细胞生长和裂解。
[0167]
使用150ml调节缓冲液(40mm磷酸钠，ph 7.0，3m硫酸铵)调节含有puc19的150ml溶液。在4cv/分钟的流速下，使用20倍柱体积(cv)的20mm磷酸钠、1.5m硫酸铵(ph 7.0)平衡色谱装置。然后将经调节的上样溶液应用于阴离子交换装置。使用20cv的平衡缓冲液洗涤该装置，然后使用20cv的洗涤缓冲液2(20mm磷酸钠，0.5m硫酸镁，ph 7.0)进行二次洗涤，结果表明，该操作可去除rna杂质。然后，使用25cv的洗涤缓冲液2至洗脱缓冲液(20mm磷酸钠，1.0m硫酸镁，ph 7.0)的梯度洗脱质粒dna。最后，使用30cv的4m nacl对色谱装置进行洗提。
[0168]
图4显示了在洗脱梯度上放大的阴离子交换装置(sartobind q)的代表色谱图。已建立两个池：包含部分1c2至2b4的池1(淡灰色框)，以及包含1c4至2b2的池2(深灰色框)。
[0169]
b)残留杂质评估
[0170]
通过琼脂糖凝胶电泳分析使用sartobind q执行的aex色谱法步骤中的各部分(有关琼脂糖凝胶的上样方案，参考表3)，结果见图5。
[0171]
表3：阴离子交换色谱法步骤(sartobind q)中各部分的上样方案(通过琼脂糖凝胶电泳分析)。
[0172][0173]
在琼脂糖凝胶上大量上样，以观察杂质。图5表明，通过第二个洗涤步骤(见泳道4；洗涤缓冲液：50mm tris
‑
base/taps([tris(羟甲基)甲胺基]丙磺酸)，0.5m硫酸镁，ph 7.0)中去除了大量的rna。对于所选条件下的梯度洗脱，经观察，oc pdna的保留时间小于sc pdna(同见图5)。
[0174]
还通过hplc分析aex色谱法步骤(sartobind q)中的各部分。图6显示了sartobind q洗脱池1(参考图4；虚线)和标准品(实线)的aex
‑
hplc色谱图，结果总结见表4。为了测量上样和洗脱池1内的残留rna，通过执行切向流过滤步骤(pellicon 3盒式超滤膜包，30kda，c screen ultracel膜，货号：p3c030c00，merck millipore)，将pdna转移到水中。由于池2是池1的子集，因此未测量池2的残留rna。
[0175]
表4：aex装置操作的分析结果。
[0176]
[0177]
以上表4中总结的结果证明定量去除了rna。对于池1和池2，dna和线状pdna分别减至4％和3％的较低水平。总的来说，通过梯度洗脱可分离rna以及开环质粒dna(oc pdna)与超螺旋质粒dna(sc pdna)。sds
‑
page分析(图7)证实，同样可通过aex色谱法步骤定量去除蛋白质类杂质(有关sds
‑
page凝胶的上样方案，参考表5)。
[0178]
表5：上样方案(通过sds
‑
page分析)。
[0179][0180][0181]
示例3：使用sartobind q和硫酸镁改进主要回收工艺和pdna puc19纯化，以使用tris缓冲系统进行洗脱
[0182]
使含有质粒puc19的大肠杆菌细胞生长和裂解，更详细的说明见下文。通过0.2μm过滤器过滤在整个过程中使用的所有缓冲液。图8为主要回收工艺(包括aex色谱法步骤)的图示。
[0183]
为初步回收，将含有质粒puc19的76.4g大肠杆菌颗粒用764ml悬浮缓冲液(50mm tris，10mm edta)悬浮1小时。加入764ml裂解缓冲液(1％sds，0.2m naoh)，开始细胞裂解。加入198ml中和缓冲液(3m醋酸钾，2m醋酸，在5℃下冷藏)，4分钟后，裂解过程停止。结果表明，0.26倍体积足以中和。
[0184]
在郁金香形储罐中加入1800ml调节缓冲液(200mm tris碱/taps，3m硫酸铵，ph 7.0)，以增加溶液密度，对1800ml的中和溶液进行调节。郁金香形储罐有助于去除不溶性颗粒，从而在将调节溶液应用于深层过滤器(clarisolve；货号：cs40ms01l3；40μm，merck millipore)时改善其过滤行为。加入194ml 1m naoh，将滤液的ph值调节至7.0。
[0185]
在4cv/分钟的流速下，使用20倍柱体积(cv)的50mm tris碱/taps、1.5m硫酸铵(ph 7.0)平衡色谱装置。然后，将深层滤液应用于aex装置(sartobind q；货号：96iexq42euc11—a；3ml床体积；sartorius)。在1.5m硫酸铵的浓度下进行质粒dna结合。上样流穿液的吸光度值较高，这表明蛋白质和大量rna种类在这些上样条件下未结合到aex材料上。使用20cv的平衡缓冲液洗涤该装置，然后使用20cv的洗涤缓冲液(50mm tris碱/taps，0.5m硫酸镁，ph 7.0)进行二次洗涤，以去除rna杂质。使用25cv的洗涤缓冲液至洗脱缓冲液(50mm tris碱/taps，1.0m硫酸镁，ph 7.0)的梯度洗脱质粒dna。梯度洗脱可分离主要两个种类，其中，第一个峰包含oc pdna，第二个峰包含sc pdna。最后，使用30cv的4m nacl对色谱装置进行洗提。图9显示了在阴离子交换装置(sartobind q)的代表色谱图。