一种用于脂质代谢及防治脂肪肝的复方组合物的制作方法

1.本发明属于脂肪肝防治药物技术领域，具体涉及一种用于脂质代谢及防治脂肪肝的复方组合物。


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝(nafld)多与嗜食肥甘厚味、好逸恶劳、情志不遂、先天禀赋不足、它病失治等因素有关，这些因素致肝郁脾虚、肾气亏虚、痰浊瘀血内蕴，遂发本病。病位在肝，涉及脾、胃、肾等脏腑，证属本虚标实，脾肾亏虚为本，痰浊血瘀为标。
3.现代研究表明，黄精有调血脂、调节免疫力、抗衰老等活性，当归有增强造血功能、降血脂、抗血栓、增强免疫力等活性，亦用于防治脂质代谢异常病症，此外，已报道九转黄精丸有抗衰老、抗炎、增强免疫力，增强骨髓造血功能及调节糖脂代谢异常等作用，因此，采用此方或在此方基础上配伍其它中药可用于防治nafld，可用于防治nafld的药物/保健品/功能食品开发。然而，该方用于脂质代谢调节以及nafld防治目前仍未见报道。


技术实现要素：

4.本发明利用黄精、当归配伍其它中药组成复方组合物，将其应用于脂肪肝的防治上，为了实现上述的技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：
5.一种用于脂质代谢及防治脂肪肝的复方组合物，其特征在于，由黄精和当归按照1:1的比例组合而成；
6.优选的，所述黄精需经过炮制后，与当归按照1:1比例制成复方提取物备用；
7.优选的，所述黄精的炮制方法包括以下步骤：
8.1)将新鲜黄精除去根须，洗净，切厚片，干燥；
9.2)黄精和黄酒按照5:1的比例，利用黄酒将其闷润直至闷透，使用蒸汽灭菌器蒸制，温度为120
‑
125℃，蒸制时间为4
‑
5小时，焖3
‑
4小时；
10.3)取出，50℃下烘干即可。
11.优选的，所述复方提取物的制备方法为：
12.1)炮制后的黄精，当归分别均匀打成细粉，粉碎后的黄精和当归按照1:1的比例混合成复方；
13.2)步骤1)中的复方先用12倍量，浓度为95％的乙醇，在90℃下回流提取第一次；再以12倍量，浓度为70％的乙醇，在90℃下回流提取第二次；合并两次回流提取液，减压浓缩回收乙醇，制得浸膏；
14.3)将步骤2)中所制得的浸膏置于
‑
80℃冰箱中结冰后，转移至冻干机中，冷冻干燥的冻干粉；
15.4)将步骤3)中制得的冻干粉研碎，混匀，置于干燥器中保存备用；
16.优选的，所述步骤2)中两次的回流提取时间均为2小时；减压浓缩回收乙醇的条件为65℃，转速100。
17.黄精有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功，归脾、肺、肾经；当归有补血活血，调经止痛，润肠通便之功，为补血活血行瘀之要药，归肝、心、脾经；二者攻补兼施，共奏补益气血、健脾益肾、活血行瘀之功。
18.本发明的有益效果是：
19.黄精、当归按照1:1比例，用于防治非酒精性脂肪肝，脂质代谢，疗效显著，对服药者的副作用小。
附图说明
20.图1是实验期间各组大鼠体重增长趋势；
21.图2复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠血清tc、tg、alt、ast、ldl
‑
c、hdl
‑
c含量的影响；
22.图3复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏tc、tg、ldl
‑
c、hdl
‑
c含量的影响；
23.图4复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏线粒体sod、mda、gsh含量的影响；
24.图5复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏线粒体atp酶、complexⅰ、complexⅱ活力的影响；
25.图6复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏脂肪酸β
‑
氧化关键酶acadl、cpt1
‑
a、cpt1
‑
b、ppargc1
‑
a、pparar及ucp
‑
2mrna表达的影响。
具体实施方式
26.下面提供具体实施方式对本发明的技术方案和效果做详细说明；
27.实施例1
28.一种用于脂质代谢及防治脂肪肝的复方组合物，其特征在于，由黄精和当归按照1:1的比例组合而成；
29.优选的，所述黄精需经过炮制后，与当归按照1:1比例制成复方提取物备用；
30.优选的，所述黄精的炮制方法包括以下步骤：
31.1)将新鲜黄精除去根须，洗净，切厚片，干燥；
32.2)黄精和黄酒按照5:1的比例，利用黄酒将其闷润直至闷透，使用蒸汽灭菌器蒸制，温度为121℃，蒸制时间为4小时，焖3小时；
33.3)取出，50℃下烘干即可。
34.优选的，所述复方提取物的制备方法为：
35.1)炮制后的黄精，当归分别均匀打成细粉，粉碎后的黄精和当归按照1:1的比例混合成复方一；
36.2)步骤1)中的复方先用12倍量，浓度为95％的乙醇，在90℃下回流提取第一次；再以12倍量，浓度为70％的乙醇，在90℃下回流提取第二次；合并两次回流提取液，减压浓缩回收乙醇，制得浸膏；
37.3)将步骤2)中所制得的浸膏置于
‑
80℃冰箱中结冰后，转移至冻干机中，冷冻干燥的冻干粉；
38.4)将步骤3)中制得的冻干粉研碎，混匀，置于干燥器中保存备用；
39.优选的，所述步骤2)中两次的回流提取时间均为2小时；减压浓缩回收乙醇的条件为65℃，转速100。
40.实施例2
41.在实施例1的基础上，将黄精、当归、黄芪按照1:1:1的比例混合成复方二；炮制和复方提取物的制备方法均与实施例1相同。
42.实施例3
43.本发明复方组合物对高脂饮食诱导nafld大鼠的干预作用；
44.1、实验材料：黄精选用滇黄精，选购自文山某药材种植农民专业合作社，其余药材购自中药材批发市场；
45.2、实验动物：8周龄清洁级spraque
‑
dawley健康雄性大鼠150只，体重200
±
20g，购自成都达硕实验动物有限公司，质量合格证号：scxk(川)2015
‑
030。实验条件和方法经云南中医药大学动物实验中心伦理审查合格，动物伦理学审查文件编号为：r
‑
06201966。实验前，所有大鼠适应性喂养1周，在适应性饲养期间，动物自由取食，自由饮水。饲养室内保持安静，室内温度维持在23～25℃，湿度55～75％，日光灯照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗；
46.3、实验方法：
47.1)复方、黄精、当归提取物制备：按照实施例1和实施例2的技术方案制备得到复方一和复方二；
48.2)实验分组：150只清洁级spraque
‑
dawley健康sd雄性大鼠随机分成15组，每组10只，即正常组(生理盐水)，模型组(生理盐水)，阳性药组(白藜芦醇)，复方一低、中、高剂量组，复方二低、中、高剂量组，黄精低、中、高剂量组，当归低、中、高剂量组；
49.3)给药方式：白藜芦醇给药量为40mg/kg/d，低、中、高剂量组给药量分别为2、4、8g/kg/d。各组大鼠均以250g体重给1ml的剂量灌胃给药，连12周，每天1次。除正常组喂普通饲料外，其余各组均喂高脂饲料(基础饲料79％、猪油10％、蛋黄10％、胆固醇1％)，实验期间，每天记录一次大鼠进食量，每周记录一次大鼠体重，计算各组大鼠每周的进食量和体重；大鼠分组及给药情况如表1所示；
50.表1大鼠分组及给药情况
51.组别饲料第1天开始给药剂量(mg/kg体重)正常组基础饲料生理盐水 模型组高脂饲料生理盐水 阳性药组高脂饲料白藜芦醇水溶液40mg/kg/d复方一低剂量组高脂饲料复方一醇提物2g/kg/d复方一中剂量组高脂饲料复方一醇提物4g/kg/d复方一高剂量组高脂饲料复方一醇提物8g/kg/d复方二低剂量组高脂饲料复方二醇提物2g/kg/d复方二中剂量组高脂饲料复方二醇提物4g/kg/d复方二高剂量组高脂饲料复方二醇提物8g/kg/d黄精低剂量组高脂饲料黄精醇提物2g/kg/d
黄精中剂量组高脂饲料黄精醇提物4g/kg/d黄精高剂量组高脂饲料黄精醇提物8g/kg/d当归低剂量组高脂饲料当归醇提物2g/kg/d当归中剂量组高脂饲料当归醇提物4g/kg/d当归高剂量组高脂饲料当归醇提物8g/kg/d
52.4)样品采集：在第12周最后一次给药后，对实验大鼠禁食处理12h，戊巴比妥钠麻醉大鼠，取血后，立即离心(3500r﹒min
‑
1，10min)分离血清，所需脏器放置于
‑
80℃冰箱保存，备用；
53.5)血清生化指标测定：按试剂盒说明书具体步骤操作，检测血清的tc、tg、hdl
‑
c、ldl
‑
c、ast、alt水平；
54.6)肝组织生化指标测定：取0.1g大鼠肝脏，于匀浆管内剪碎(冰浴上操作)，加0.9ml预冷的生理盐水匀浆10次，转移至1.5ml离心管中，4℃、3000rpm﹒min
‑
1离心10min，取上清液待用。采用bca蛋白测定试剂盒测定上清液中的蛋白含量，按照试剂盒说明书操作，依次加入各试剂，振荡充分混匀，测定上清液中的tc、tg、hdl
‑
c、ldl
‑
c的含量；
55.7)肝细胞线粒体相关指标：
56.①
肝细胞线粒体分离
57.取大鼠肝脏0.1g，加入1ml预冷的线粒体分离液(0.21m甘露醇、0.07m蔗糖、10mm tris base、1mm edta、0.5mm egta，ph至7.4)，于冰水浴中匀浆；将组织匀浆液转移至离心管中，于4℃，1000
×
g离心10min，弃去沉淀，上清液转移至另一离心管中，4℃，10000
×
g离心10min，所得沉淀即为肝细胞线粒体；
58.②
肝细胞线粒体中mda、sod、gsh、atp合酶及complex i、ii测定
59.取肝细胞线粒体，加生理盐水混匀成混悬液，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定线粒体蛋白浓度；分别取100μl线粒体混悬液，按试剂盒说明书操作，羟胺法测定sod活性，硫代巴比妥酸法测定mda含量，比色法测定gsh、atp合酶活性，双抗体夹心法酶联免疫吸附试验测定complex i、ii活性。
60.8)各组数据采用均数
±
标准差表示，采用spss 21.0统计软件分析处理数据，组间比较采用方差分析(one way
‑
anova)，多组两两之间比较采用lsd
‑
t检验，*p<0.05认为有统计学差异。
61.4、实验结果
62.1)复方一、复方二、黄精和当归对高脂诱导nafld大鼠体重增长的影响
63.实验过程中，各组大鼠均无死亡，正常进食饮水，活动自如，皮毛光泽度好，对外界刺激反应迅速。实验开始至12周实验结束，结果显示，各组大鼠均呈正向增长趋势(图1)，体重增长正常。
64.2)复方一、复方二、黄精和当归对高脂诱导nafld大鼠血清tc、tg、alt、ast、ldl
‑
c、hdl
‑
c水平的影响
65.如图2所示，与正常组相比，模型组大鼠血清中tg、alt、ast、ldl
‑
c水平显著升高，且ldl
‑
c水平显著降低，说明高脂饮食诱导造成大鼠血清脂质紊乱。与模型组相比，第12周实验结束，白藜芦醇组大鼠血清中tc、tg、ast含量显著降低(p<0.05)，hdl
‑
c含量显著升高(p<0.001)，表明其可调节高脂饲料诱发的血清脂质异常；给予不同提取物后，复方一、复方
二中、高剂量组tg含量均显著降低(p<0.01，p<0.001)，且复方一效果优于复方二；与模型组相比，复方一高剂量组、黄精低、中剂量组、当归中、高剂量组alt含量均显著降低(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，且黄精低剂量组效果较优；与模型组相比，复方一、复方二低剂量组，黄精中、高剂量组，当归中剂量组ast含量均显著降低(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，且复方一效果明显优于复方二及黄精、当归组；与模型组相比，各给药组ldl
‑
c无显著性差异；与模型组相比，复方一、复方二的低、中、高剂量组及当归高剂量组hdl
‑
c含量均显著升高(p<0.01，p<0.001)，且复方一效果明显优于复方二及当归组。结果表明，复方一、复方二及黄精、当归给药组都可调节nafld大鼠血脂异常，且复方一给药组在调节tg、ast及hdl
‑
c方面，效果明显强于复方二及黄精、当归给药组。
66.3)复方一、复方二、黄精和当归对高脂诱导nafld大鼠肝脏tc、tg、ldl
‑
c、hdl
‑
c水平的影响
67.如图3所示，与正常组相比，模型组tc、tg、ldl
‑
c含量明显升高(p<0.05，p<0.001)，说明高脂饮食诱导极易造成大鼠肝脏脂质紊乱。第12周实验结束，与模型组比较，白藜芦醇组肝组织中tc、tg和ldl
‑
c具有显著性差异(p<0.05，p<0.001)，表明其可调节高脂诱导的nafld大鼠肝脏脂质异常；给予不同提取物后，与模型组相比，复方一低、中、高剂量组，当归低剂量组tg含量显著降低(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，复方二给药组及黄精给药组tg含量也有降低趋势，但无显著性差异，且复方一给药组效果显著优于其余给药组；与模型组相比，复方一低、中剂量组tc含量显著降低(p<0.01，p<0.001)，复方二给药组tc含量也有降低趋势，但无显著性差异；与模型组相比，复方一、复方二给药组，黄精低、高剂量组，当归低、高剂量组ldl
‑
c显著降低(p<0.01，p<0.001)，且复方一给药组及黄精、当归给药组效果较优；与模型组相比，黄精中剂量和当归中剂量组hdl
‑
c显著升高(p<0.001)。结果表明，复方一、复方二及黄精、当归给药组都可调节nafld大鼠肝脏脂质异常，且复方一给药组在调节肝脏tc、tg及ldl
‑
c方面，效果明显强于复方二及黄精、当归给药组。
68.4)复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏线粒体中sod、mda和gsh的影响
69.如图4所示，与正常组相比，模型组大鼠肝脏中sod活力降低极显著(p<0.001)，且mda含量有升高趋势，表明nafld大鼠肝脏线粒体中存在氧化应激与脂质过氧化损伤。与模型组比较，白藜芦醇给药组可一定程度提高gsh含量，表明其可一定程度改善nafld大鼠肝线粒体氧化应激与脂质过氧化损伤。给予不同提取物后，与模型组相比，黄精低剂量组及当归低剂量组sod活力显著升高(p<0.05)，黄精中、高剂量组及当归中剂量组sod活力也有升高趋势，但无显著性差异；与模型组相比，当归高剂量组mda含量显著降低(p<0.05)，复方二中、高剂量组及当归低、中剂量组mda含量也有降低趋势，但无显著性差异；与模型组相比，复方一中、高剂量组，复方二高剂量组，黄精低剂量组gsh活力显著升高(p<0.01，p<0.001)，且复方一高剂量组效果明显优于复方二给药组。结果表明，复方一、复方二及黄精、当归给药组都可调节nafld大鼠肝脏线粒体氧化应激与脂质过氧化损伤，从而缓解nafld的发生，但两个复方及黄精、当归药效差异不明显。
70.5)复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏线粒体中atp合酶与complexⅰ、complexⅱ的影响
71.由图5结果可见，与正常组相比，模型组大鼠肝脏线粒体中na
‑
k
‑
atp酶、complexⅰ、complexⅱ活力均显著降低(p<0.05，p<0.001)，ca2
‑
mg2
‑
atp酶也有降低趋势，表明高
脂诱导nafld大鼠肝线粒体能量代谢紊乱。与模型组比较，白藜芦醇给药组na
‑
k
‑
atp酶、ca2
‑
mg2
‑
atp酶和complexⅰ酶的酶活力显著升高(p<0.05，p<0.001)，表明其可一定程度改善nafld大鼠肝线粒体能量代谢异常。
72.给予不同提取物后，与模型组相比，复方一中剂量组，复方二高剂量组，黄精低、中剂量组，当归低、中、高剂量组na
‑
k
‑
atp酶活力显著升高(p<0.01，p<0.001)，但各组间药效没有明显差异；与模型组相比，复方一中、高剂量组，复方二高剂量组，黄精给药组及当归给药组ca2
‑
mg2
‑
atp酶活力显著升高(p<0.01，p<0.001)，且复方一、黄精和当归药效明显优于复方二；与模型组相比，复方一高剂量组、复方二高剂量组、黄精给药组、当归给药组complexⅰ活力显著升高(p<0.05，p<0.001)，且复方一效果优于复方二，而黄精和当归效果优于两个复方；与模型组相比，黄精低剂量组complexⅱ活力显著升高(p<0.001)。结果表明，复方一、复方二及黄精、当归给药组都可调节nafld大鼠肝脏线粒体能量代谢障碍紊乱，且复方一效果较复方二给药组明显。
73.6)复方一、复方二、黄精和当归对nafld大鼠肝脏脂肪酸β
‑
氧化关键酶mrna表达的影响
74.由图6结果可见，与正常组相比，模型组大鼠肝脏脂肪酸β
‑
氧化关键酶acadl、cpt1
‑
a、cpt1
‑
b、ppargc1
‑
a、pparar mrna活力均显著降低(p<0.001)，且ucp
‑
2含量有明显的升高趋势，表明高脂诱导nafld大鼠肝脏脂肪酸β
‑
氧化紊乱。与模型组比较，白藜芦醇给药组acadl、cpt1
‑
a、cpt1
‑
b、ppargc1
‑
a、pparar mrna活力显著升高(p<0.001)，表明其可一定程度改善nafld大鼠肝脏脂肪酸β
‑
氧化异常，促进脂肪酸代谢。
75.给予不同提取物后，与模型组相比，复方一低、中、高剂量组acadl mrna活力均显著升高(p<0.05，p<0.01)，复方二低、中、高剂量组acadl mrna活力也有上升趋势，但无显著性差异；与模型组相比，复方一低、中、高剂量组cpt1
‑
a mrna活力均显著升高(p<0.001)，复方二低、中、高剂量组及当归低剂量组cpt1
‑
a mrna活力也有上升趋势，但无显著性差异；与模型组相比，复方一及复方二的低、中、高剂量组cpt1
‑
b mrna活力均显著升高(p<0.05，p<0.01,p<0.001)，但复方一效果明显优于复方二；与模型组相比，复方一低、中剂量组及复方二中剂量组pparar mrna活力均显著升高(p<0.05)，复方一高剂量组及复方二低、高剂量组pparar mrna活力也有上升趋势，但无显著性差异；与模型组相比，复方一低、中、高剂量组ppargc1
‑
a mrna活力均显著升高(p<0.05，p<0.01)，复方二低、中、高剂量组及当归中、高剂量组ppargc1
‑
a mrna活力也有上升趋势，但无显著性差异；与模型组相比，黄精低、中、高剂量组及当归低、高剂量组可显著降低ucp
‑
2含量(p<0.05)。结果表明，复方一、复方二及黄精、当归给药组都可调节nafld大鼠肝脏脂肪酸β
‑
氧化紊乱，促进脂肪酸代谢，且在acadl、cpt1
‑
a、cpt1
‑
b、ppargc1
‑
a、pparar mrna表达量调节方面，复方一效果明显优于复方二及黄精、当归给药组。
76.实施例4
77.本发明复方组合物对医用脂肪乳诱导肝l02细胞脂质代谢紊乱的调节作用；
78.1、材料、试剂及仪器
79.1)材料与试剂
80.非诺贝特(上海源叶生物科技有限公司)；rpmi
‑
1640(美国gibco invitrogen公司)；胎牛血清(fbs；美国hyclone公司)；triton
‑
x100(美国sigma公司)；胰蛋白酶(1：250；
美国amresco公司)；医用脂肪乳(四川国瑞药业有限公司；每250ml医用脂肪乳内含50g大豆油、3g卵磷脂和5.5g甘油)；甘油三脂(tg)测试盒、总胆固醇(tc)测试盒、总超氧化物歧化酶(t
‑
sod)测试盒、丙二醛测试盒(mda)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)测试盒、大鼠线粒体呼吸链复合物i(complex i)elisa测试盒、大鼠线粒体呼吸链复物ii(complex ii)elisa测试盒均购自南京建成生物工程研究所；bca蛋白浓度测试盒(碧云天生物技术研究所)；其余试剂为分析纯。复方一(黄精：当归＝1:1)、复方二(黄精：当归：黄芪＝1:1:1)及黄精、当归药材来源及提取物制备方法同实施例1。
81.2)主要仪器
82.co2细胞培养箱(美国thermo公司)；超净工作台(sw
‑
cj
‑
ifd型；苏州安泰空气技术有限公司)；wt600
‑
1f蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)；bs224电子天平(万分之一，北京赛尔利斯仪器系统有限公司)；suno全自动生化分析仪(ab
‑
1020；中国长春赛诺迈德医学技术有限公司)；eclipse ts 100荧光倒置相差显微镜(日本nikon公司)；85
‑
2型磁力搅拌器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；ql
‑
861型旋涡混合器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；ph计(fe20；梅特勒
‑
托利多仪器(上海)有限公司)；tgl
‑
16bs台式微量离心机(上海安亭科学仪器厂)；uv
‑
1800pc型紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；infinite m200 pro多功能酶标仪(瑞士tecan公司)；hr/16m高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；milli
‑
q超纯水系统(美国millipore公司)。
83.2、细胞培养试剂的配制
84.1)rpmi
‑
1640培养液配制：取1.69g hepes，150mg l
‑
glutamine，165mg pyruril acid sodium salt，2g nahco3，10.0g rpmi
‑
1640粉溶于1l超纯水中，加hcl调节ph至7.20，0.22μm孔径滤器过滤除菌分装，4℃保存，备用。
85.2)完全培养液的配制(含10％fbs的rpmi
‑
1640培养液)：将50ml的fbs与450ml rpmi
‑
1640培养基混匀，4℃冰箱保存备用。
86.3)g0液的配制(含有0.2％血清的rpmi
‑
1640培养液)：将1ml的fbs与500ml rpmi
‑
1640培养基混匀，4℃冰箱保存备用。
87.4)磷酸缓冲液(pbs)：分别称取0.2g kcl，3.49g nahpo4.12h2o，0.2g k2hpo4，8g nacl溶于800ml超纯水，充分搅拌均匀，测ph7.4，定容至1000ml，0.22μm孔径滤器过滤除菌分装，4℃保存，备用。
88.5)0.25％胰酶溶液：胰蛋白酶0.5g，溶于200ml pbs缓冲液中，0.22μm孔径滤器过滤除菌分装，4℃保存，备用。
89.6)造模液的配制(医用脂肪乳rpmi
‑
1640造模液)：将10ml的fbs与5ml的20％医用脂肪乳混匀，用无血清的rpmi
‑
1640定容到100ml即为医用脂肪乳诱导液。
90.7)0.01％triton x
‑
100溶液：100ml双蒸水中加入100μltriton x
‑
100，充分搅拌混匀后，4℃保存。
91.3、方法
92.1)肝l
‑
02细胞的复苏、培养、传代、冻存
93.1.1细胞的复苏：用镊子将冻存有l
‑
02细胞的eppendorf管从液氮罐中取出，迅速放入37℃恒温水浴中，轻轻震摇使其尽快融化，注意防止水浴锅中的水没过冻存管瓶口。
94.在酒精灯外焰灼烧eppendorf管盖子外壁，打开盖子用吸管吸出细胞悬液，移入25ml培养皿中，并滴加5ml含10％fbs的rpmi
‑
1640培养液，置于培养箱(5％co2、37℃)内培养，次日换液一次，以后隔日换液一次，继续培养。
95.1.2细胞的培养：根据细胞生长情况，待细胞长至80％
‑
90％融合(约2d
‑
3d)，用胰蛋白酶消化，按l：3的比例传代，置培养箱中培养。
96.1.3细胞冻存：取对数生长期细胞冻存，冻存细胞前24h换液一次。依照传代的步骤，离心后加入细胞冻存液1.5ml吹散细胞，将细胞悬液转入冻存管中。在将冻存管分别置4℃30min，
‑
20℃4h，
‑
80℃过夜后转入液氮罐冻存。
97.2)医用脂肪乳诱导的肝细胞脂肪变性模型复制
98.取对数生长期的l
‑
02细胞用0.25％胰蛋白酶消化，细胞计数后用正常培养液配成单个细胞悬液，以每孔3
×
105个细胞的密度接种于6孔培养板中，每孔培养液体积2ml。将培养板移入co2培养箱中，在37℃、5％co2及饱和湿度条件下，培养48h使其充分贴壁生长，待细胞长至80％融合时，换成g0液培养24h，使细胞周期同步化。加入造模液(医用脂肪乳rpmi
‑
1640)刺激48h，对照组则给予正常培养液相同的时间，即可得到脂肪变性的肝l
‑
02细胞。
99.3)实验分组及给药
100.将肝细胞传板至6孔板，分为正常组、模型组、给药组，模型组、给药组细胞按“3.1”项下的方法进行培养，复制好模型后，给予以下处理因素：
101.1.1正常组：继续给予g0(含0.2％fbs的rpmi
‑
1640培养液)培养；
102.1.2模型组：继续给予g0(含0.2％fbs的rpmi
‑
1640培养液)培养；
103.1.3给药组：分别取非诺贝特、复方一提取物、复方二提取物、黄精提取物、当归提取物适量溶于dmso，取dmso溶解的受试样品用g0液稀释到所需要浓度(dmso质量浓度<1
‰
)。加入受试样品(分别为50μg/ml、100μg/ml)和阳性对照非诺贝特(20μg/ml)进行培养；
104.每个浓度设3个复孔，给药刺激24h后，分别置于倒置显微镜下观察细胞形态，并取细胞裂解液检测其中的总胆固醇tc及总甘油三酯tg含量。
105.4)肝细胞内tg、tc含量测定
106.取各组细胞pbs洗涤1
‑
2次，加入1ml胰酶消化细胞，再加入正常培养液停止消化，并吹打细胞(确保将各孔内的所有细胞吹下)，将各孔中的细胞悬液置于l.5ml离心管中，2000r/min，离心5min，弃上清，加入triton反复冻融三次。当细胞充分裂解后，4℃，12000r/min，离心10min，取上清液按相应试剂盒说明书操作，测定tg和tc含量。
107.5)肝细胞线粒体中mda、sod、gsh
‑
px、atp合酶及complex i、ii测定
108.取各组细胞按“4)”项下方法处理细胞得裂解细胞上清液，按各试剂盒说明书操作，测定各指标水平。
109.6)统计学处理
110.各组数据用均数
±
标准差表示，采用spss 21.0统计软件分析处理数据，组间比较采用方差分析(one way
‑
anova)，*p<0.05认为有统计学差异。
111.4、结果
112.1)受试提取物对肝细胞tg、tc含量的影响
113.表2结果显示，与正常组比较，模型组肝细胞中tc及tg均显著升高(p<0.01)，表明
经脂肪乳诱导的肝细胞发生脂代谢紊乱。与模型组比较，非诺贝特组tc与tg均显著降低(p<0.05，p<0.01)；复方一低、高剂量组，复方二、黄精和当归高剂量组tc显著降低(p<0.05，p<0.01)；复方一、复方二及黄精高剂量组tg显著降低(p<0.01)。结果表明，复方一、复方二、黄精和当归均可较好改善脂肪乳诱发的肝细胞脂质异常，且对于tc调节，复方一效果显著优于其它给药组。
114.表2受试提取物对肝细胞tg、tc含量的影响(n＝6)
[0115][0116]
与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01
[0117]
2)受试提取物对肝细胞mda、sod及gsh
‑
px水平的影响
[0118]
表3结果显示，与正常组比较，模型组肝细胞中mda含量显著升高(p<0.01)，且sod与gsh
‑
px活力显著降低(p<0.01)，提示肝线粒体发生氧化应激与脂质过氧化。与模型组比较，复方一、复方二、黄精及当归高剂量可显著降低肝细胞中mda含量(p<0.05)；复方一、复方二及黄精高剂量能显著升高sod活力(p<0.05；p<0.01)，且复方效果优于黄精；复方一低、高剂量，复方二与当归高剂量能显著升高gsh
‑
px活力(p<0.05；p<0.01)。结果说明复方一、复方二、黄精及当归可提高受损肝细胞抗氧化能力，且对于sod与gsh
‑
px调节复方效果优于单味药，对于gsh
‑
px调节复方一效果优于复方二及单味药。
[0119]
表3受试提取物对肝细胞mda、sod及gsh
‑
px水平的影响(n＝6)
[0120]
[0121]
与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01
[0122]
3)受试提取物对肝细胞atp合酶与complex i、ii的影响
[0123]
表4结果显示，与正常组比较，模型组肝细胞中na
‑
k
‑
atpase、ca2
‑
mg2
‑
atpase、complex ii水平显著降低(p<0.05)，提示肝线粒体能量代谢相关酶活性受抑制。与模型组比较，复方一、黄精和当归高剂量可显著提高na
‑
k
‑
atpase活性(p<0.05；p<0.01)；复方一低、高剂量与复方二高剂量能显著升高ca2
‑
mg2
‑
atpase活力(p<0.05)；复方一低、高剂量，复方二高剂量及当归高剂量能显著升高complex ii活性(p<0.05)。结果说明，复方一、复方二、黄精及当归可改善线粒体能量代谢，且对于ca2
‑
mg2
‑
atpase、complex ii调节效果，复方一效果显著优于复方二及单味药。
[0124]
表4受试提取物对肝细胞atp合酶与complex i、ii的影响(n＝6)
[0125][0126][0127]
与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。