一种尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体制备方法与流程

1.本发明属于脂质体技术领域，具体涉及一种尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体制备方法。


背景技术：

2.巨型脂质体是由脂质分子在水相溶液中通过疏水作用形成的由双分子层包围而成的单层密闭球形囊泡，其尺寸一般在1
‑
100μm范围内。由于巨型脂质体具有结构和成分与天然生物膜相似，尺寸和物理性质与真实细胞相似，以及在光学显微镜下可观察和实施、操作等优点，在分子生物学、细胞生物学、药物运输、化学反应等领域都具有十分广阔的应用前景。随着科技的发展，各个领域均对巨型脂质体提出了更高的要求，包括尺寸的可控性和均一性、可脱离基底形成悬浮态等。常见的巨型脂质体制备方法主要有温和水合法、凝胶辅助水合法、电形成法等。其中，目前广泛使用的方法是电形成法，该方法是指在干燥脂质膜于水相溶液中发生自发膨胀时施加一个外加电场来刺激其生长的方法。然而，使用现有的制备方法所得到的巨型脂质体尺寸分布不均匀，直径范围在10
‑
100μm不等，同时其尺寸难以按需要来准确控制，且凝胶辅助水合法还会向巨型脂质体中引入聚合物杂质。
3.近年来，随着微纳加工技术的发展，通过向巨型脂质体制备装置中引入微结构的方式是实现巨型脂质体尺寸控制的有效手段。比如有研究构建了具有微图案的电极基底，通过改变微图案的尺寸来实现巨型脂质体的尺寸调控；还有研究基于微印章法在基底上构建了微图案化脂质膜，通过调控脂质膜的尺寸来实现巨型脂质体的尺寸控制；最近，还有研究在基底上通过微纳加工的方式构建了微米量级的凹孔结构，通过微孔结构来聚集电场，并限制脂质膜的面积来实现巨型脂质体的尺寸控制。然而，上述这些方法均需要较高的工艺技术以及昂贵的设备，操作步骤复杂且成本高昂。同时，微孔结构的边缘会与膜有较强的粘附作用而导致制备得到的巨型脂质体难以脱离基底而无法形成悬浮态，使得这类方法应用范围窄。因此，开发一种简单且有效的方法来制备尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体具有重要的经济价值和应用前景。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种巨型脂质体的制备方法，所制得的巨型脂质体为微米量级，尺寸可控制在5
‑
100μm范围内，且可脱离基底形成悬浮状态，同时本发明的制备方法操作简单有效，无需使用昂贵的设备，成本低廉，应用范围广阔。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.一种尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体制备方法，该方法包括以下步骤：
7.s1、脂质分子溶液配制：将脂质分子溶解到三氯甲烷和乙腈混合溶液中，制备得到脂质分子溶液；
8.s2、脂质膜制备：将步骤s1的脂质分子溶液沉积在导电基底上，经干燥后得到覆盖在基底上的脂质膜；
9.s3、岛状脂质膜制备：将步骤s2中覆盖了脂质膜的基底固定于高精度位移台的工作平台，通过x轴方向的单步移动参数来控制基底的横向移动距离，并用微针在y轴方向进行切割，随后将基底旋转90
°
，重复上述的切割操作，将脂质膜加工为方形的岛状脂质膜；
10.s4、巨型脂质体制备：在步骤s3中覆盖了岛状脂质膜的基底部分贴上中空绝缘硅胶垫片，在垫片的中空部分加入水相溶液，随后盖上导电基底并使上下导电基底的导电面相对，将电场施加于上下两个导电基底之间，得到特定尺寸的巨型脂质体；
11.s5、巨型脂质体转移：将步骤s4中的巨型脂质体经水相溶液稀释后即可得到具有特定尺寸的悬浮态巨型脂质体。
12.优选地，步骤s1中，所述脂质分子包括中性脂质分子、负电性脂质分子、正电性脂质分子，或至少其中两种的混合脂质分子。进一步地，所述混合脂质分子包括中性脂质分子和负电性脂质分子的混合物，中性脂质分子和正电性脂质分子的混合物，或者中性脂质分子、负电性脂质分子和正电性脂质分子的混合物。具体地，所述脂质分子为1
‑
棕榈酰基
‑2‑
油酰基卵磷脂(popc)。
13.优选地，步骤s1中，所述三氯甲烷和乙腈的体积比为18
‑
20:1。具体地，所述三氯甲烷和乙腈的体积比为19:1。
14.优选地，步骤s1中，所述脂质分子在脂质分子溶液中的浓度为2
‑
4mg/ml。具体地，所述脂质分子在脂质分子溶液中的浓度为3mg/ml。
15.优选地，步骤s2中，利用溶液旋涂法将脂质分子溶液沉积在导电基底上，旋涂的转速为600
‑
1000r/min，旋涂所得脂质膜的厚度为20
‑
50nm。
16.优选地，步骤s2中，所述导电基底为镀有氧化铟锡(ito)的基片。进一步地，所述基片包括玻璃基片、硅基片和镀金基片等常规导电基片。
17.优选地，步骤s3中，移动参数为450
‑
486，单步移动距离为250
‑
270μm，微针在y轴方向切割10次，旋转90
°
后重复切割10次。
18.优选地，步骤s4中，所述水相溶液为0.1m蔗糖溶液或去离子水。
19.优选地，步骤s5中，所述水相溶液包括0.1m蔗糖溶液、0.1m葡萄糖溶液、去离子水。
20.优选地，步骤s4中，所述电场包括交流电场和直流电场，所述电场的电压为1
‑
4v，频率为10hz，施加电场的时间为1
‑
2h。具体地，所述电场为交流电场。
21.优选地，步骤s2中，所述导电基底在使用前先依次用异丙醇、丙酮、去离子水和无水乙醇超声清洗15min，并用高纯氮气吹干。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.为解决采用现有巨型脂质体制备方法制备得到的巨型脂质体尺寸均一性差且难以控制的问题，本发明提供了一种巨型脂质体的制备方法，通过高精度位移台和切割微针构建的薄膜微结构加工装置，可将脂质膜加工为不同尺寸的方形岛状脂质膜结构，加工精度可达到微米量级，无需使用昂贵的光刻设备，操作简单，成本大大降低，易于大规模工业化生产；同时，上述制备得到不同尺寸的岛状脂质膜通过外加电场刺激的方式能够在单个岛状脂质膜上得到具有特定尺寸的单个巨型脂质体，所得巨型脂质体为单层脂质体，结构完整，尺寸可在5
‑
100μm范围内(实施例部分只展现了30
‑
70um的情况)，生长尺寸可控。此外，上述制备得到的巨型脂质体可以脱离基底，并转移至其它溶液中，从而得到许多尺寸均一性良好的悬浮巨型脂质体，可被转移至观察皿中进行操控加载，可用于更加多样的研究
和更广的应用领域。
附图说明
24.图1为巨型脂质体制备的流程示意图；
25.图2为沉积在ito玻璃表面上的脂质膜在原子力显微镜下的形貌图；
26.图3为不同边长的正方形岛状脂质膜及其对应各个尺寸岛状脂质膜上制备得到不同直径的巨型脂质体在显微镜相差模式下的观察图(a对应d，b对应e，c对应f；a边长为30μm的岛状脂质膜；b边长为40μm的岛状脂质膜；c边长为50μm的岛状脂质膜；d直径为39μm的巨型脂质体；e直径为47μm的巨型脂质体；f直径为61μm的巨型脂质体)；
27.图4为转移至0.1m葡萄糖溶液中的悬浮态巨型脂质体在显微镜相差模式的观察图；
28.图5为方形岛状脂质膜的边长与相对应得到的巨型脂质体的平均直径的关系图。
具体实施方式
29.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
31.实施例1一种尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体制备方法
32.巨型脂质体的制备流程如图1所示，具体的制备方法包括以下步骤：
33.(1)ito玻璃基底的清洗：将ito玻璃基底(厚度为0.1cm、边长为3cm的正方体基底)依次放置于异丙醇、丙酮、去离子水和无水乙醇中超声清洗15min，随后用高纯氮气吹干备用；
34.(2)脂质分子溶液的配制：取75mg的popc加入到19ml三氯甲烷和1ml乙腈的混合溶剂中，随后均匀晃动至完全溶解得到浓度为3mg/ml的脂质分子溶液；
35.(3)脂质膜的制备：将400μl脂质分子溶液旋涂在ito基底上得到湿膜样品，旋涂转速为600r/min，旋涂时间为4min；随后在真空条件下室温干燥2h，得到覆盖在基底上的致密干燥脂质膜，脂质膜的厚度为45nm。
36.对上述制备在ito玻璃基底上的脂质膜用原子力显微镜进行形貌观察发现(图2)，所制备得到的脂质膜均匀且致密，没有孔洞。
37.(4)岛状脂质膜的制备：将上述覆盖着脂质膜的基底固定于高精密电动位移台(购自北京卓立汉光仪器有限公司，品牌为zolix，设备型号为tsa50
‑
c)的面板(工作平台)上，通过控制器设置面板x轴方向的单步移动参数，来控制基底的横向移动距离，其中移动参数为450，对应的单步移动距离为250μm，每移动一个单步用微针沿y轴方向对脂质膜进行切割，进行10次切割；随后将基底旋转90
°
，重复上述的切割操作，从而得到边长为30μm的正方形岛状脂质膜(图3a)。
38.(5)巨型脂质体的制备：在上述基底覆盖有岛状脂质膜的位置上贴上厚度为3mm的中空绝缘硅胶垫片(外径为2.4cm、内径为1.4cm的环形中空绝缘硅胶垫片)，在直径为1.4mm
的圆形中空部分(贯穿的圆形空腔)加入0.1m蔗糖溶液(所有的岛状脂质膜均被包围在垫片的中空部分)，随后在上层盖上ito基底并使上下基底的导电面相对，构成巨型脂质体生长装置。将交流电场通过导线施加于上下两个导电基底之间，持续2h后在单个岛状脂质膜上得到尺寸为39μm的单一巨型脂质体(图3d)。其中交流电场的电压为1.5v，频率为10hz。
39.(6)巨型脂质体的转移：使用开口为2mm的移液器将上述生长腔中制备得到的巨型脂质体(约0.46ml液体，液体内含巨型脂质体)小心地吸入移液管中，并转移稀释至0.1m葡萄糖溶液(约7ml)中，得到均匀的悬浮态巨型脂质体(图4)。
40.实施例2一种尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体制备方法
41.巨型脂质体的制备流程如图1所示，具体的制备方法包括以下步骤：
42.步骤(1)、(2)、(3)同实施例1；
43.(4)岛状脂质膜的制备：将上述覆盖着脂质膜的基底固定于高精密电动位移台的面板(工作平台)上，通过控制器设置面板x轴方向的移动参数为468，单步移动距离为260μm，每移动一个单步用微针沿y轴方向对脂质膜进行切割，进行10次切割；随后将基底旋转90
°
，重复上述的切割操作，从而得到边长为40μm的正方形岛状脂质膜(图3b)。
44.(5)巨型脂质体的制备：在上述基底覆盖有岛状脂质膜的位置上贴上厚度为3mm的中空绝缘硅胶垫片，在直径为1.4mm的圆形中空部分加入0.1m蔗糖溶液(所有的岛状脂质膜均被包围在垫片的中空部分)，随后在上层盖上ito基底并使上下基底的导电面相对，构成生长装置。将交流电场通过导线施加于上下两个导电基底之间，持续2h后在单个岛状脂质膜上得到尺寸为47μm的单一巨型脂质体(图3e)。其中交流电场的电压为1.5v，频率为10hz。
45.步骤(6)同实施例1。
46.(6)巨型脂质体转移：使用开口为2mm的移液器将上述生长腔中制备得到的巨型脂质体(约0.46ml液体，液体内含巨型脂质体)转移稀释至0.1m葡萄糖溶液(约7ml)中，得到均匀的悬浮态巨型脂质体。
47.实施例3一种尺寸可控且可脱离基底的巨型脂质体制备方法
48.巨型脂质体的制备流程如图1所示，具体的制备方法包括以下步骤：
49.步骤(1)、(2)、(3)同实施例1；
50.(4)岛状脂质膜的制备：将上述覆盖着脂质膜的基底固定于高精密电动位移台的面板(工作平台)上，通过控制器设置面板x轴方向的移动参数为468，单步移动距离为270μm，每移动一个单步用微针沿y轴方向对脂质膜进行切割，进行10次切割；随后将基底旋转90
°
，重复上述的切割操作，从而得到边长为50μm的正方形岛状脂质膜(图3c)。
51.(5)巨型脂质体的制备：在上述基底覆盖有岛状脂质膜的位置上贴上厚度为3mm的中空绝缘硅胶垫片，在直径为1.4mm的圆形中空部分加入0.1m蔗糖溶液(所有的岛状脂质膜均被包围在垫片的中空部分)，随后在上层盖上ito基底并使上下基底的导电面相对，构成生长装置。将交流电场通过导线施加于上下两个导电基底之间，持续2h后在单个岛状脂质膜上得到尺寸为61μm的单一巨型脂质体(图3f)。其中交流电场的电压为1.5v，频率为10hz。
52.步骤(6)同实施例1。
53.(6)巨型脂质体转移：使用开口为2mm的移液器将上述生长腔中制备得到的巨型脂质体(约0.46ml液体，液体内含巨型脂质体)转移稀释至0.1m葡萄糖溶液(约7ml)中，得到均匀的悬浮态巨型脂质体。
54.如图5所示，通过统计多组不同边长的正方形岛状脂质膜上制备得到的巨型脂质体直径得到的边长
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直径关系图可见。随着岛状脂质膜边长的增大，得到的巨型脂质体的直径也随之增大，两者之间存在很好的线性关系且每组数据的标准偏差小。说明本发明能够实现巨型脂质体尺寸的控制，得到尺寸均一性好的巨型脂质体。
55.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。