一种靶向自噬融合治疗神经退行性疾病的药物的制作方法

1.本发明属于医药领域，具体涉及13
‑
顺式视黄酸在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.自噬是一种程序化的细胞内降解过程【physiological reviews 90,1383
‑
1435(2010)】。自噬发生时，自噬小体包裹待降解的蛋白质或细胞器，如线粒体，在两个snare蛋白复合物(stx17
‑
snap29
‑
vamp8和ykt6
‑
snap29
‑
stx7)的作用下与溶酶体融合，完成降解【cell 151,1256
‑
1269(2012)；the journal of cell biology 217,2633
‑
2645(2018)】。该过程是细胞维持内稳态的关键途径，尤其对终末分化以及线粒体功能活跃的细胞至关重要，如神经元。已知许多重要自噬基因的缺失会导致神经元的功能异常；而许多神经退行性疾病的发生，如肌萎缩侧索硬化症，阿尔兹海默症和帕金森症，都与自噬的紊乱密切相关【nature reviews.molecular cell biology 19,349
‑
364(2018)】。
3.库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症是一种由于kansl1单基因单倍剂量不足导致的罕见病【nature genetics 44,639
‑
641(2012)；european journal of human genetics:ejhg 24,652
‑
659(2016)】。该疾病是一种系统性的疾病，表现为不同程度的智力障碍，心脏功能异常，肌肉张力松弛以及特殊的面部特点，其中智力障碍是该疾病最主要的特征【cytogenetic and genome research 114,89
‑
92(2006)；bmc medical genetics 16,68(2015)】。目前为止，该疾病的病理机制不明，还没有有效的治疗手段。
4.13
‑
顺式视黄酸又称异维甲酸，是一种治疗痤疮的fda药物【jamadermatology(2019)】。13
‑
顺式视黄酸在体内经异构酶转化为全反式视黄酸，是β
‑
胡萝卜素的代谢活性物质【nature reviews.neuroscience 8,755
‑
765(2007)】。β
‑
胡萝卜素，在体内经氧化剪切转变为视黄醛，视黄醛再经氧化转变为视黄酸。


技术实现要素：

5.本发明的目的是揭示库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症与自噬融合异常的关联，并提供13
‑
顺式视黄酸的药物新用途。
6.本发明所揭示的库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症与自噬融合异常的关联，为：库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症致病基因kansl1缺失导致自噬融合关键蛋白stx17表达下调，进而导致自噬及线粒体自噬的功能异常。
7.本发明所提供的13
‑
顺式视黄酸的药物新用途，为：13
‑
顺式视黄酸在制备如下产品中的应用：
8.1)治疗神经退行性疾病的药物；
9.2)治疗库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症的药物；
10.3)治疗库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的神经退行性疾病的药物；
11.4)治疗线粒体自噬异常相关的神经退行性疾病的药物；
12.5)治疗与stx17或snap29基因表达异常导致自噬融合异常相关的神经退行性疾病的药物。
13.所述应用中，所述库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症为kansl1单基因单倍剂量不足导致的库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症。
14.所述13
‑
顺式视黄酸包括13
‑
顺式视黄酸原药(cas号：4759
‑
48
‑
2)，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸，异维甲酸酯(cas号：78147
‑
42
‑
9)及其药学上可接受的盐、酯、水合物。
15.本发明还提供一种治疗神经退行性疾病的药物，所述药物含有13
‑
顺式视黄酸原药，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸，异维甲酸酯及其药学上可接受的盐、酯、水合物。
16.本发明还提供一种治疗库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症的药物，所述药物含有13
‑
顺式视黄酸原药，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸，异维甲酸酯及其药学上可接受的盐、酯、水合物。
17.本发明还提供一种治疗库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的，线粒体自噬异常相关的，以及与stx17或snap29基因表达异常导致自噬融合异常相关的神经退行性疾病的药物【proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 116,556
‑
565(2019)；autophagy 4,590
‑
599(2008)；the journal of biological chemistry 287,32861
‑
32873(2012)；nature medicine 24,313
‑
325(2018)；the journal of cell biology 200,731
‑
741(2013)；autophagy 11,1608
‑
1622(2015)】，所述药物含有13
‑
顺式视黄酸原药，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸，异维甲酸酯及其药学上可接受的盐、酯、水合物。
18.上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
19.需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
20.上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
21.本发明还提供一种治疗神经退行性疾病、库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症或库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的，线粒体自噬异常相关的，以及与stx17或snap29基因表达异常相关的神经退行性疾病的方法。
22.本发明所提供的治疗神经退行性疾病、库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症或库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的，线粒体自噬异常相关的，以及与stx17或snap29基因表达异常导致自噬融合异常相关的神经退行性疾病的方法，为：给予患者相应剂量(0.5～2mg/kg/day)的13
‑
顺式视黄酸原药，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸，异维甲酸酯及该药其他盐、酯、水合物。
23.本发明的发明人发现kansl1基因缺失导致自噬融合关键基因stx17表达显著下调；通过构建kansl1的全身敲除小鼠以及杂合小鼠，利用线粒体自噬探针mitokeima转基因小鼠，发现kansl1缺陷的小鼠原代神经元线粒体自噬水平异常。通过经典的“新事物识别实验”和“水迷宫实验”，发现该杂合小鼠表现出学习记忆能力下降；通过病理学分析，发现杂合小鼠海马神经元树突棘数量下降，排列紊乱。发明人发现胡萝卜类物质13
‑
顺式视黄酸能够靶向stx17以及snap29，并促进介导自噬融合snare蛋白的相互作用，进而有效提高kansl1缺陷的小鼠原代神经元线粒体自噬水平，并且能够有效改善kansl1杂合小鼠神经元
树突棘的异常和学习记忆能力的缺陷。该发现提示13
‑
顺式视黄酸物质对库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的，线粒体自噬异常相关的，以及与stx17或snap29基因表达异常相关的神经退行性疾病治疗具有潜在的应用价值。
附图说明
24.图1为kansl1缺失下调stx17的表达。
25.图2为13
‑
顺式视黄酸化学结构式。
26.图3为13
‑
顺式视黄酸能够结合stx17和snap29。
27.图4为13
‑
顺式视黄酸促进介导自噬融合snare蛋白的相互作用。
28.图5为13
‑
顺式视黄酸能够改善kansl1缺陷小鼠原代神经元线粒体自噬水平的异常。
29.图6为13
‑
顺式视黄酸能够缓解kansl1杂合小鼠神经元树突棘的异常。
30.图7为13
‑
顺式视黄酸能够改善kansl1杂合小鼠新事物认知能力。
31.图8为13
‑
顺式视黄酸能够提高kansl1杂合小鼠空间学习记忆能力。
具体实施方式
32.下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.本发明提供13
‑
顺式视黄酸在制备如下产品中的应用：
35.1)治疗神经退行性疾病的药物；
36.2)治疗库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症的药物；
37.3)治疗库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的神经退行性疾病的药物；
38.4)治疗线粒体自噬异常相关的神经退行性疾病的药物；
39.5)治疗与stx17或snap29基因表达异常导致自噬融合异常相关的神经退行性疾病的药物。
40.所述应用中，所述库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症为kansl1单基因单倍剂量不足导致的库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症。
41.所述13
‑
顺式视黄酸包括13
‑
顺式视黄酸原药，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸，异维甲酸酯及该药其他盐、酯、水合物。
42.本发明的发明人发现kansl1基因缺失导致自噬融合关键基因stx17表达显著下调；通过构建kansl1的全身敲除小鼠以及杂合小鼠，利用线粒体自噬探针mitokeima转基因小鼠，发现kansl1缺陷的小鼠原代神经元线粒体自噬水平异常。通过经典的“新事物识别实验”和“水迷宫实验”，发现该杂合小鼠表现出学习记忆能力下降；通过病理学分析，发现杂合小鼠海马神经元树突棘数量下降，排列紊乱。发明人发现胡萝卜类物质13
‑
顺式视黄酸能够靶向stx17以及snap29，并促进介导自噬融合snare蛋白的相互作用，进而有效提高kansl1缺陷的小鼠原代神经元线粒体自噬水平，并且能够有效改善kansl1杂合小鼠神经元树突棘的异常和学习记忆能力的缺陷。该发现提示13
‑
顺式视黄酸物质对库伦
‑
德
‑
弗里斯综合症相关的，线粒体自噬异常相关的，以及与stx17或snap29基因表达异常相关的神经退
行性疾病治疗具有潜在的应用价值。
43.实施例1、kansl1缺失下调stx17表达。
44.1)kansl1敲低。在hela细胞中利用lipofectamine rnaimax(thermo fisher)转染试剂转染kansl1 sirna。转染60h后，用ripa裂解液裂解hela细胞，通过western blot检测stx17蛋白的表达水平变化。
45.2)实验结果。kansl1敲低使stx17的蛋白水平显著下调(如图1所示)。
46.实施例2、13
‑
顺式视黄酸能够结合stx17和snap29，并促进snare蛋白间的相互作用。
47.1)biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸pulldown实验。将biotin与13
‑
顺式视黄酸偶联，合成biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸化合物。分别将终浓度5μm的biotin和biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸加入hela细胞中处理24小时，细胞经ebss饥饿处理2小时后收样。将streptavidin agarose beads(thermo,20357)与细胞裂解液孵育过夜，western blot检测各蛋白表达。
48.2)13
‑
顺式视黄酸促进介导自噬融合snare蛋白的相互作用。利用表达shrna的慢病毒在hela细胞中稳定敲低kansl1，利用turbofect
tm transfection reagent(invitrogen,r0531)转染试剂，在该细胞中瞬时过表达flag
‑
snap29。待转染24小时后，将终浓度5μm的13
‑
顺式视黄酸加入hela细胞中处理24小时，细胞经ebss饥饿处理2小时后收样。将anti
‑
flag m2 affinity gel(sigma
‑
aldrich,a2220)与细胞裂解液孵育过夜，western blot检测各蛋白表达。
49.3)实验结果。biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸pulldown实验结果表明，biotin
‑
13
‑
顺式视黄酸能够结合stx17和snap29(如图3所示)；免疫共沉淀实验结果表明，13
‑
顺式视黄酸能够增强stx17，vamp8，stx7以及ykt6与snap29蛋白的相互作用，并且能逆转kansl1缺失导致的stx17以及vamp8与snap29相互作用的减弱(如图4所示)。
50.实施例3、13
‑
顺式视黄酸能够改善kansl1缺陷小鼠原代神经元线粒体自噬水平的异常。
51.1)构建kansl1
‑
/
‑
诱导型条件敲除小鼠。kansl1
loxp/loxp
小鼠的构建：以c57bl/6胚胎干细胞作为靶细胞，利用turboknockout技术对kansl1基因第三个外显子进行编辑，最终造成整个基因功能丧失型突变，该项目由赛业(苏州)生物科技有限公司完成。通过将该小鼠与cag
‑
cre小鼠[来源为c57bl/6(004682，jackson laboratory)]和mitokeima(线粒体自噬探针蛋白)转基因小鼠[来源为c57bl/6(028072，jackson laboratory)]杂交后得到kansl1
‑
/
‑
诱导型条件敲除小鼠；
[0052]
2)原代神经元分离与培养。取e14.5天胎龄胎鼠，将皮层组织取出，剪碎并消化成单细胞，按照合适密度种于不同孔板及腔室中。进行体外分化培养。分化第一天时，加入1μm他莫昔芬，在分化第5天时，撤掉药物。换液为无维生素a的神经元培养基培养神经元，在分化第6天时，加入20μm 13
‑
顺式视黄酸，培养24h后，对mitokeima荧光进行激光共聚焦拍摄以及定量分析；
[0053]
3)实验结果。kansl1缺陷小鼠原代神经元的线粒体自噬水平显著下降。神经元经过经过13
‑
顺式视黄酸给药后，kansl1缺陷小鼠原代神经元的线粒体自噬水平增强。n＝48,52,43，49(每点代表一个细胞)。结果为平均值
±
sem；统计方法为one
‑
wayannova(如图5所示)。
[0054]
实施例4、13
‑
顺式视黄酸能够改善kansl1杂合小鼠树突棘的异常。
[0055]
1)构建kansl1
/
‑
小鼠。通过将kansl1
loxp/loxp
小鼠与eiia
‑
cre小鼠[来源为b6.fvb
‑
tg(eiia
‑
cre)c5379lmgd/j(003727，jackson laboratory)经与c57bl/6背景小鼠交配八代以上完成洗背景]杂交后得到kansl1杂合小鼠；
[0056]
2)13
‑
顺式视黄酸药物治疗。对4月龄的kansl1
/
‑
和kansl1
/
小鼠进行13顺势视黄酸腹腔注射(0.5mg/kg/day)，持续给药一个月；
[0057]
3)高尔基染色。小鼠用4％多聚甲醛灌流，迅速取脑，浸泡在提前一天配置好的a液b液混合液中(试剂盒为fd neuro technologies公司的pk401产品fd rapid golgistain kit)。在黑暗中储存14天，第2天更换新鲜a液b液混合液。将脑组织转移至c液中，第2天更换新鲜c液，浸泡3天。将组织置于干冰上的异戊烷中冷冻，于冰冻切片机上切100um厚度的切片。将切片于d液e液混合液中染色。常规脱水，中性树脂胶封片。晾干片子后，用pe激光共聚焦显微镜对ca1区进行扫描。
[0058]
4)实验结果。杂合小鼠海马ca1区树突棘密度有显著下降。小鼠经过13
‑
顺式视黄酸给药后，杂合小鼠树突棘密度增大。n＝25，26，33，31(每组来自于2至3只小鼠)。结果为平均值
±
sem；统计方法为one
‑
wayannova(如图6所示)。
[0059]
实施例4、13
‑
顺式视黄酸增强kansl1杂合小鼠的学习记忆能力
[0060]
1)新事物识别实验。提前三天，将小鼠放于房间内适应，减少紧张，期间将小鼠放入箱子中适应10min，标记尾巴号码；测试当天，1#将物体aa放入箱内，设置背景，将小鼠头背向物体放入箱子中央，记录10min；24h后，2#将物体ab放入箱内，重新设置背景，将小鼠放入箱子中央，记录10min，鼻尖距离物体小于1cm认为探索物体，站上物体任务无效。统计小鼠探索2#中a和b的的时间，统计分析结果discrimination＝tb/(tb ta)。每个点代表一只小鼠。结果为平均值
±
sem；统计方法为one
‑
wayannova(如图7所示)。
[0061]
由图7可知：kansl1杂合小鼠相比于野生小鼠，新事物识别能力显著下降；而13
‑
顺式视黄酸能够显著提高kansl1杂合小鼠的新事物识别能力。
[0062]
2)水迷宫实验。提前一周使小鼠适应环境，每天操作人员与小鼠玩耍抚摸。水迷宫水池直径122cm，平台直径6cm。平台放置于southeast象限。空间参照物3个，白底黑图，图形分别为圆形/三角形/正方形，固定在水迷宫三个围栏柱上。水池提前蓄水，水面高于平台1cm，训练前加入钛白粉，充分搅匀，使水池内不可透视，水温20
‑
22℃。将小鼠面对水池壁平行水面缓慢放入水中。记录小鼠潜伏时间，若潜伏时间到60s仍未上台通知操作人员引导小鼠上平台，并在平台上停留20s熟悉周围环境后取走；若小鼠在60s潜伏时间内游上平台，并在平台上停留5s，允许小鼠在平台上继续停留15s熟悉周围环境后取走。小鼠从水池中取出后，用干毛巾擦干被毛，放回笼盒。所有小鼠每完成一轮测试后完成后，间隔30min以上进行下一轮，每天共4次训练。共训练4天。n＝4次测试(每组来自于5至7只小鼠)。结果为平均值
±
sem；统计方法为two
‑
wayannova(如图8所示)。
[0063]
由图8可知：kansl1杂合小鼠相比于野生小鼠，空间学习记忆能力显著下降；而13
‑
顺式视黄酸能够显著提高kansl1杂合小鼠的空间学习记忆能力。