一种用于制备抗肿瘤药物或14-3-3η蛋白抑制剂的化合物的制作方法

一种用于制备抗肿瘤药物或14-3-3
η
蛋白抑制剂的化合物
技术领域
1.本发明涉及药物化学和药理学领域，具体涉及一种用于制备抗肿瘤药物或14-3-3η蛋白抑制剂的化合物。
2.发明背景
3.肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居国内恶性肿瘤第三位。肝癌恶性程度高、早期诊断率低，绝大部分患者明确诊断时多为进展期，失去了手术指征；且即使接受根治性手术的早期患者仍有较高的复发率。因此，非手术方式在肝癌总体治疗中具有重要作用。肝癌是高度血管化肿瘤，同时针对肿瘤细胞和肿瘤血管进行干预是目前临床治疗进展期/复发肝癌的一线治疗方案，其主要包括：
①
经肝动脉栓塞化疗(tace，在局部化疗同时栓塞肿瘤供血动脉)；
②
口服靶向药物索拉非尼(sorafenib，具有同时靶向癌细胞和瘤内血管之双重抑制作用)。然而，肿瘤异质性导致了二者在治疗过程中易产生药物耐受；从机制角度来说：
①
肝癌在发展过程中，肿瘤细胞经过多次分裂，其子代呈现出分子生物学或基因方面的改变，导致肿瘤在生长、侵袭转移、对药物敏感性和预后等多个方面产生差异；
②
肿瘤异质性决定了肿瘤血管的异质性；
③
tace和/或sorafenib在对肿瘤和/或血管产生杀伤作用同时亦筛选出耐药细胞亚群，最终造成治疗整体有效率低，患者获益时间短。更为重要的是，目前我国尚无已经获批能在患者产生tace/sorafenib耐受后进行补救的替代药物。因此深入研究肝癌产生药物抵抗的分子机制，探索精准方式靶向耐药细胞亚群(肿瘤 血管)，提升肝癌总体疗效已成为临床亟待解决的重大问题之一。
4.就tace而言，临床上多联用2～3种化疗药物(如5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和多柔比星)一次性大剂量灌注。这些药物经各自经典途径阻断dna复制合成，继而在影响细胞增殖同时，增加胞内活性氧(ros)水平，产生dna氧化损伤，诱导细胞凋亡。在生理情况下，细胞不可避免地暴露于来自于外界因素和细胞内有氧代谢所产生的ros；作为一把双刃剑，适量ros是调控细胞正常功能的重要信号分子，而过量ros则损伤细胞内多种生物大分子；因此，机体内存在精准的抗氧化调控体系，维持氧化还原平衡。然而与生理情况不同，肿瘤内ros水平一般显著高于同一组织来源的正常对照，这就决定了肿瘤中存在其特殊的氧化还原体系：肿瘤从属的氧化还原平衡，尤其针对耐药肿瘤而言，其细胞内发挥重要作用的抗氧化防御系统和依从性氧化应激信号均显著增加(异质性)。因此，深入研究调控耐药肝癌细胞亚群氧化还原体系的关键分子，探索以精准方式靶向干预，打破耐药异质性从属的氧化还原平衡是提升肝癌总体疗效的重要切入点之一。
5.作为多靶点(磷酸化蛋白)的抗肝癌/血管药物，sorafenib耐药亦表现为肝癌细胞耐药和肝癌血管耐药。其中，肝癌细胞耐药机制研究较为深入：如相关重要分子(raf、ras、erk、egfr、akt和stat-3等)的异常磷酸化修饰，继而导致细胞抗氧化/抗凋亡能力、上皮-间质转化(emt)、自噬、肿瘤干细胞样特性(cscs)和促血管生成能力显著增强，最终获得/维持sorafenib耐药性。与此同时，肝癌血管细胞中的相关重要分子(如vegfr、erk、akt、smads等)缺失或异常磷酸化修饰亦可促进细胞增殖、抑制凋亡，诱导细胞发生内皮-间质转化，继
而获得肿瘤相关成纤维细胞样特性(tafs)，呈现很强的血管生成能力和sorafenib耐药性。因此，深入研究耐药肝癌/血管细胞亚群中蛋白异常磷酸化的关键调控分子，探索以精准方式靶向干预，破坏耐药异质性从属的蛋白磷酸化修饰是提升肝癌总体疗效的另一重要切入点。
6.14-3-3家族(α、β、γ、ε、σ、ξ、τ和η七个亚型)是一类磷酸丝/苏氨酸识别蛋白，通过与ser-x-pser或ser-x-pthr(x代表任意氨基酸)残基结合，继而调控相关转录因子、骨架蛋白、生物酶类等下游靶分子，参与了包括肝癌发生发展在内的多种生物学过程。申请人前期研究发现：相较于其它亚型，14-3-3η在肝癌和瘤内血管均存在特异性分布，其作为调控“肿瘤—血管”交互作用的关键“开关”样分子，促进了肝癌生长和血管生成。更为重要的是，14-3-3η高表达与tace和sorafenib治疗预后不良正相关，成果发表在肝癌研究领域权威期刊j hepatol杂志上。
7.进一步对14-3-3η与肝癌耐药异质性及从属的氧化/磷酸化调控关系的研究发现：肝癌化疗多药耐药细胞14-3-3η表达水平显著高于其亲本细胞，敲除14-3-3η导致耐药细胞抗氧化能力和奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、多柔比星对细胞的ic
50
均显著下降；而在其亲本肝癌细胞中高表达14-3-3η则呈现相反效应。与之类似，肝癌sorafenib耐药细胞14-3-3η表达亦显著高于其亲本细胞，敲除14-3-3η显著改变包括上述raf、erk、egfr、akt、stat-3在内149个蛋白(含不同位点)的磷酸化水平，sorafenib对细胞敏感性亦显著下降；在其亲本细胞中高表达14-3-3η亦呈现相反效应。这意味着14-3-3η是一个诱导/维持肝癌耐药异质性从属的氧化还原体系和磷酸化修饰的“开关样”分子和干预靶标。研究发现：14-3-3η不是膜蛋白，且由于缺乏分泌肽段，其在胞外主要以外泌体的形式存在，这导致无法通过抗原-抗体途径进行靶向干预；目前尚无14-3-3η特异性小分子抑制剂；因此，基于14-3-3η蛋白的分子结构筛选高效特异性小分子化学物，靶向抑制14-3-3η，摧毁肝癌耐药异质性从属的“保护”体系，对于提升肝癌总体疗效具有重要的研究意义和价值。
8.发明概述
9.为此，针对现有技术中存在的上述不足之处，本技术的发明人经过研究确定了14-3-3η蛋白与小分子抑制剂的潜在结合位点，并在此基础上针对大量候选化合物进行了筛选，最终确定了一类有效的14-3-3η蛋白靶向抑制剂，从而为开发新的有效的肿瘤，特别是肝癌治疗药物奠定了重要基础。
10.一方面，本发明提供了式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体在制备预防和/或治疗肿瘤中的用途：
[0011][0012]
其中，
[0013]
r选自c
1-5
直链或支链烷基、或芳烷基，所述芳烷基任选地被一个或多个选自卤素、c
1-5
直链或支链烷基、或c
1-5
直链或支链烷氧基的取代基取代；
[0014]
r1不存在，或选自-coor'或-conr'r”，其中r'和r”各自独立地选自氢、或c
1-5
直链
或支链烷基；
[0015]
r2不存在，或选自c
1-5
直链或支链烷基、或c
1-5
直链或支链烷氧基；
[0016]
n为0-4之间的任意整数；
[0017]
为包含0、1或2个选自o、n和s的取代杂原子的饱和或不饱和的五元或六元碳环、或五元或六元内酰胺环，其任选地被一个或多个选自c
1-5
直链或支链烷基、c
1-5
直链或支链烷氧基、或c
1-5
直链或支链烷氧基酰基的取代基取代，或者其中两个相邻的所述取代基与其所连接的碳原子一起形成五元或六元环。
[0018]
根据本发明的一个实施方案，r的结构如下：
[0019][0020]
其中，r3和r4各自独立地不存在，或选自卤素、c
1-5
直链或支链烷基、或c
1-5
直链或支链烷氧基，m为1-3之间的任意整数。
[0021]
优选地，r3和r4各自独立地不存在，或选自卤素、c
1-3
直链或支链烷基或c
1-3
直链或支链烷氧基；例如，r3和r4各自独立地不存在，或为f、cl、br、-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-och3，-och2ch3、-och2ch2ch3或-och(ch3)2。
[0022]
优选地，m为1。
[0023]
进一步优选地，r为4位被c
1-3
直链或支链烷氧基取代的苄基。
[0024]
根据本发明的一个实施方案，r1不存在，或选自-coor'或-conr'r”，其中r'和r”各自独立地选自氢、或c
1-3
直链或支链烷基；例如，r1不存在，或为-cooh、-cooch3、-cooch2ch3、-cooch2ch2ch3、-cooch(ch3)2、-conh2，-conhch3、-conhch2ch3、-conhch2ch2ch3或-conhch(ch3)2。
[0025]
根据本发明的一个实施方案，r2不存在，或选自c
1-3
直链或支链烷基、或c
1-3
直链或支链烷氧基；例如，r2不存在，或为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-och3，-och2ch3、-och2ch2ch3或-och(ch3)2。
[0026]
根据本发明的一个实施方案，n为0、1、2或3；例如，n为1。
[0027]
根据本发明的一个实施方案，为包含0、1或2个选自o、n和s的取代杂原子的饱和或不饱和的五元或六元碳环，其任选地被一个或多个选自c
1-5
直链或支链烷基、c
1-5
直链或支链烷氧基、或c
1-5
直链或支链烷氧基酰基的取代基取代。优选地，为包含0、1或2个选自o、n和s的取代杂原子的饱和或不饱和的五元或六元碳环，其任选地被一个、两个或三个选自c
1-5
直链或支链烷基、或c
1-5
直链或支链烷氧基的取代基取代。更优选地，为不包含取代杂原子的饱和或不饱和的五元或六元碳环，其任选地被一个、两个或三个选自c
1-5
直链或支链烷基、或c
1-5
直链或支链烷氧基的取代基取代。例如，为苯环，其任选地被一个、两个或三个选自c
1-3
直链或支链烷基、或c
1-3
直链或支链烷氧基的取代基取代。
[0028]
具体地，本发明所述的式(i)所示的化合物选自以下化合物：
[0029]
[0030]
。
[0031]
优选地，本发明的所述式(i)所示的化合物选自以下化合物：
[0032]
[0033]
。
[0034]
更优选地，本发明所述的式(i)所示的化合物选自以下化合物：
[0035]
。
[0036]
所述肿瘤选自可以白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和直肠癌中的一种或多种，优选为肝癌。此外，所述肿瘤可以为耐药肿瘤，例如动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肿瘤，优选为动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肝癌。
[0037]
此外，所述式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体还可以与其它抗肿瘤活性物质组合使用。例如，所述肿瘤可以选自白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和直肠癌中的一种或多种，优选为肝癌。此外，所述肿瘤可以为耐药肿瘤，例如动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肿瘤，优选为动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肝癌。其中，所述其它抗肿瘤活性物质可以选自索拉非尼(sorafenib)、乐伐替尼(lenvatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、纳武单抗(nivolumab)、folfox4、贝伐单抗(bevacizumab)、利尼伐尼(linifanib)、tivantinib和阿昔替尼(axitinib)中的一种或多种。
[0038]
相应地，本发明提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括给予有其需要的对象预防和/或治疗有效量的本发明的式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体。其中，所述肿瘤可以选自白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、
宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和直肠癌中的一种或多种，优选为肝癌。此外，所述肿瘤可以为耐药肿瘤，例如动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肿瘤，优选为动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肝癌。
[0039]
另一方面，本发明提供了上述式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体在制备用于预防和/或治疗与14-3-3η蛋白高表达相关的疾病的药物中的用途。优选地，所述与14-3-3η蛋白高表达相关的疾病为肿瘤。
[0040]
相应地，本发明提供了一种预防和/或治疗与14-3-3η蛋白高表达相关的疾病的方法，其包括给予有其需要的对象预防和/或治疗有效量的本发明式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体。优选地，所述与14-3-3η蛋白高表达相关的疾病为肿瘤。其中，所述肿瘤可以选自白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和直肠癌中的一种或多种，优选为肝癌。此外，所述肿瘤可以为耐药肿瘤，例如动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肿瘤，优选为动脉栓塞化疗(tace)和/或索拉非尼耐药肝癌。
[0041]
本发明所述的式(i)所示的化合物及其任意优选形式均涵盖了其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、氘代化合物、前药或其混合物形式，或式(i)所示的化合物、其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体，氘代化合物，前药或其混合物的药学上可以接受的盐或溶剂化物。
[0042]
本发明所述基团和化合物中所涉及的元素碳、氢、氧、硫、氮或卤素均包括它们的同位素情况，本发明所述基团和化合物中所涉及的元素碳、氢、氧、硫或氮任选地进一步被一个或多个它们对应的同位素所替代，其中碳的同位素包括
12
c、
13
c、
14
c，氢的同位素包括氕(h)、氘(d，又叫重氢)、氚(t，又叫超重氢)，氧的同位素包括
16
o、
17
o和
18
o，硫的同位素包括
32
s、
33
s、
34
s和
36
s，氮的同位素包括
14
n和
15
n，氟的同位素
19
f，氯的同位素包括
35
cl和
37
cl，溴的同位素包括
79
br和
81
br。
[0043]
本发明的发明人应用分子动力学模拟联合分子力学—广义伯恩表面积法计算得出：肽和14-3-3η蛋白的结合自由能为-48.69
±
7.88kcal/mol。在此基础上进一步通过上述方法进行自由能分解，共鉴定出3个肽和14-3-3η蛋白之间相互作用的关键位点：第50位赖氨酸残基、第57/132位精氨酸残基。因此：lys-50、arg-57、arg-132即为14-3-3η蛋白与小分子抑制剂的潜在结合位点。14-3-3η是经典的磷酸丝氨酸(sep)识别/结合蛋白，本发明人进一步以sep作为结合袋的活性中心，以上述3个关键氨基酸残基为范围，确定用于虚拟筛选的网格结构域，在此基础上结合chemdiv数据库1456156种化合物构建有效药物过滤模型，按照“高通量筛选——标准精度筛选——高精度筛选——优化排序”的筛选策略开展分子对接虚拟筛选，并通过western blot结合剂量—效应关系进一步筛选潜在靶向干预14-3-3η的化合物。
[0044]
由于14-3-3η在不同类型细胞中的表达水平为正常肝细胞显著<肝癌细胞显著<耐药肝癌细胞，且其作为诱导/维持肝癌耐药异质性从属的氧化还原体系和磷酸化修饰的“开关样”分子，因此，本发明通过靶标筛选得出的靶向抑制14-3-3η的小分子化合物能够在对正常肝细胞不产生毒性的剂量范围内，特异性靶向肝癌耐药异质性细胞亚群，继而摧毁肝
1,2-二氯乙烷中，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.49g，7mmol)。反应混合液在氮气保护下常温搅拌2h，接着用5ml饱和碳酸氢钠溶液猝灭反应。反应液用100ml乙酸乙酯稀释，5％碳酸氢钠和饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得1.88g固体(二氯甲烷：甲醇＝20:1，rf＝0.4)，收率82％。c
28
h
30
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}459.2278，实测值459.2288。
[0056]
化合物5：将化合物5b(0.92g，2mmol)溶解于thf：水＝1：1的混合溶液20ml中，然后将反应液冷至0℃，缓缓加入溶解于4ml水中的lioh
·
h2o 0.42g(10mmol)溶液，反应进程用tlc监测。待原料消失完全，再用20％的柠檬酸溶液调节ph至3左右，然后水层用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品用乙醚洗涤，得0.79g白色固体(乙酸乙酯：甲醇＝3:1，rf＝0.4)，收率91.7％。c
26
h
26
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}431.1965，实测值431.1967。
[0057]
实施例2化合物6的合成
[0058][0059]
化合物6a：将3-甲酰基-6-甲基-1h-吲哚-2-甲酸乙酯(3.36g，14.5mmol)，naoh(6g，150mmol)溶解于200ml二氯甲烷/水(1:1)溶液中，搅拌至0℃。然后逐滴滴入4-甲氧基苄氯(2.5ml，16.0mmol)。反应混合物在1小时后升温至18℃，并在此温度下反应15h，接着用3m的hcl溶液调节至ph＝1。分离水层及有机层，水层用二氯甲烷萃取三次，每次50ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得2.32g油状物(二氯甲烷：甲醇＝20:1，rf＝0.35)，收率45.5％。c
21
h
21
no4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}352.1543，实测值352.1534。
[0060]
化合物6b：将间甲氧基苄胺(0.69g，5mmol)，化合物6a(1.76g,5mmol)溶解于25ml 1,2-二氯乙烷中，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.49g，7mmol)。反应混合液在氮气保护下常温搅拌2h，接着用5ml饱和碳酸氢钠溶液猝灭反应。反应液用100ml乙酸乙酯稀释，5％碳
酸氢钠和饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得1.79g固体(二氯甲烷：甲醇＝25:1，rf＝0.3)，收率75.7％。c
29
h
32
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}473.2435，实测值473.2442。
[0061]
化合物6：将化合物6b(0.95g,2mmol)溶解于thf/水(1：1)的混合溶液20ml中，然后将反应液冷至0℃，缓缓加入溶解于4ml水中的lioh
·
h2o 0.42g(10mmol)溶液，反应进程用tlc监测。待原料消失完全，再用20％的柠檬酸溶液调节ph至3左右，然后水层用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品用乙醚洗涤，得0.82g白色固体(乙酸乙酯：甲醇＝3:1，rf＝0.4)，收率92.2％。c
27
h
28
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}445.2122，实测值445.2118。
[0062]
实施例3化合物13的合成
[0063]
[0064]
化合物13a：将6-溴-3-甲酰基-1h-吲哚-2-甲酸乙酯(8.60g，29mmol)，naoh(12g，300mmol)溶解于400ml二氯甲烷/水(1:1)溶液中，搅拌至0℃。然后逐滴滴入4-甲氧基苄氯(5ml，32mmol)。反应混合物在1小时后升温至18℃，并在此温度下反应15h，接着用3m的hcl溶液调节至ph＝1。分离水层及有机层，水层用二氯甲烷萃取三次，每次100ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得5.44g油状物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，rf＝0.3)，收率45.0％。c
20
h
18
br no4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}416.0492，实测值416.0501。
[0065]
化合物13b：将四(三苯基膦)钯(0.47g，0.4mmol)和化合物13a(2.10，5mmol)溶解于无水四氢呋喃15ml中，在氮气保护下，加入溶解于6ml蒸馏水中的碳酸钾(2.10g，15mmol)溶液。反应混合物在室温氮气保护下搅拌5min后，加入乙基硼酸(0.45g，6.0mmol)。然后升温至80℃反应24h后降至室温。反应液用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得1.57g油状物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，rf＝0.35)，收率85.9％。c
22
h
23
no4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}366.1700，实测值366.1696。
[0066]
化合物13c：将间甲氧基苄胺(0.28g，2mmol)，化合物13b(0.74g，2mmol)溶解于10ml 1,2-二氯乙烷中，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.64g，3mmol)。反应混合液在氮气保护下常温搅拌2h，接着用3ml饱和碳酸氢钠溶液猝灭反应。反应液用50ml乙酸乙酯稀释，5％碳酸氢钠和饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得0.81g固体(二氯甲烷：甲醇＝20:1，rf＝0.4)，收率83.2％。c
30
h
34
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}487.2591，实测值487.2595。
[0067]
化合物13：将化合物13c(0.49g，1mmol)溶解于thf：水＝1：1的混合溶液10ml中，然后反应液冷至0℃，缓缓加入溶解于2ml水中的lioh
·
h2o 0.21g(5mmol)溶液，反应进程用tlc监测。待原料消失完全，再用20％的柠檬酸溶液调节ph至3左右，然后水层用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品用乙醚洗涤，得0.40g白色固体(乙酸乙酯：甲醇＝3:1，rf＝0.4)，收率87.2％。c
28
h
30
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}459.2278，实测值459.2267。
[0068]
实施例4化合物14的合成
[0069][0070]
化合物14a：将四(三苯基膦)钯(0.47g，0.4mmol)和化合物13a(2.10，5mmol)溶解于无水四氢呋喃15ml中，在氮气保护下，加入溶解于6ml蒸馏水中的碳酸钾(2.10g，15mmol)溶液。反应混合物在室温氮气保护下搅拌5min后，加入异丙基硼酸(0.53g，6.0mmol)。然后升温至80℃反应24h后降至室温。反应液用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得1.45g油状物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，rf＝0.35)，收率76.4％。c
23
h
25
no4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}380.1856，实测值380.1848。
[0071]
化合物14b：将间甲氧基苄胺(0.28g，2mmol)，化合物14a(0.76g，2mmol)溶解于10ml 1,2-二氯乙烷中，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.64g，3mmol)。反应混合液在氮气保护下常温搅拌2h，接着用3ml饱和碳酸氢钠溶液猝灭反应。反应液用50ml乙酸乙酯稀释，5％碳酸氢钠和饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。过硅胶柱纯化得0.87g固体(二氯
甲烷：甲醇＝20:1，rf＝0.4)，收率86.8％。c
31
h
36
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}501.2748，实测值501.2750。
[0072]
化合物14：将化合物14b(0.50g，1mmol)溶解于thf：水＝1：1的混合溶液10ml中，然后反应液冷至0℃，缓缓加入溶解于2ml水中的lioh
·
h2o 0.21g(5mmol)溶液，反应进程用tlc监测。待原料消失完全，再用20％的柠檬酸溶液调节ph至3左右，然后水层用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品用乙醚洗涤，得0.43g白色固体(乙酸乙酯：甲醇＝3:1，rf＝0.4)，收率90.9％。c
29
h
32
n2o4的hr-ms(esi)m/z:计算值{[m h]

}473.2435，实测值473.2439。
[0073]
实施例5本发明的代表性化合物对14-3-3η蛋白表达及erk磷酸化抑制活性的测定
[0074]
采用wb(western blotting)检测14-3-3n及其下游erk的磷酸化水平：蒸馏水清洗灌胶玻璃板(美国bio-rad公司)，竖直晾干。使用碧云天公司(江苏海门，货号：p0012a)生产的sds-page凝胶配制试剂盒配制10％分离胶10ml，加temed 10μl、10％过硫酸铵100μl，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2～3mm，用去离子水封闭液面去除气泡隔绝空气，室温静置45分钟待胶完全聚合后，倾去顶部去离子水，用滤纸将水吸干。配制5％浓缩胶5ml，加temed 5μl，将水、10％过硫酸铵50μl混匀后立即灌胶至顶部，并插入齿梳，室温静置20分钟待胶聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中(bio-rad)，加入电泳缓冲液(碧云天，货号：p0014d)，并冲洗上样孔去除气泡。
[0075]
取各个处理组的蛋白提取液，使用碧云天公司bca蛋白浓度测定试剂盒(货号：p0009)调整蛋白浓度，和等体积5
×
sds上样缓冲液(碧云天，货号：p0015)混合后，于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/min离心1min。每孔加上样液10μl，留一孔加10μl预染的marker(碧云天，货号：p0071)。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用60v恒压电泳，约30min，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90v恒压电泳，当溴酚蓝带到分离胶底部位置时停止电泳。预先将美国millipore公司生产的pvdf膜浸泡在甲醇中15s，然后用去离子水漂洗2min，浸泡于转移缓冲液5min后开始后续操作。在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。按海绵
→
胶
→
pvdf膜
→
海绵顺序制备转膜“三明治”，接上正负极，半干法200ma恒流转膜60min。转膜结束后，快速取出pvdf膜，放入5％bsa室温封闭1h。取出膜，于摇床上用tbst洗膜5min
×
3次。孵育袋中分别加入tbst稀释的抗14-3-3η或抗p-erk抗体(cst公司，货号分别为9640和4370，稀释比例：1:1000)，4℃孵育过夜。tbst洗膜5min
×
3次，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(碧云天，货号：a0208，稀释比例1：1000)室温孵育1h。tbst洗膜10min
×
5次。再应用cst公司生产的增强型化学发光检测试剂(试剂a：试剂b＝1：1)反应2min，取出膜，去除多余的液体，暗室中用x胶片感光、显影、定影。
[0076]
由图1可知，通过western blot结合剂量—效应关系进一步筛选，化合物5、6、13和14在<10μm剂量范围内均对14-3-3η表达及其下游靶分子erk的磷酸化水平具有显著的抑制效果。
[0077]
实施例6本发明的代表性化合物对肝癌耐药细胞株的抑制活性的测定
[0078]
实验选用人正常肝上皮l02细胞株、人肝癌bel-7402细胞株以及对5-氟尿嘧啶(5-fu)耐药的bel-7402细胞株(记为bel/5-fu，注：该细胞经验证具有化疗多药耐药特性[qiu,et al.j exp clin canc res.2018；37:321])。分别应用0-1000μm上述5、6、13和14号化合物处理24h。使用碧云天公司生产的cck-8试剂盒(货号：c0037)测定细胞活力。ic
50
通过graph pad 6.0软件计算：对于每个试验，使用三参数剂量-反应方程确定抑制率，并用非线
性回归计算。生成乙状曲线，得到ic
50
值。简言之，纵坐标表示抑制率[(1-处理细胞的吸光度/对照细胞的吸光度)
×
100％]，横坐标表示对数(浓度)。使用的计算模式是“对数(抑制剂)与响应(三个参数)”，结果显示为“最佳拟合值
”±“
标准误差”。测定结果见表1和图2。
[0079]
表1本发明的化合物对肝癌耐药细胞株的抑制活性的测定
[0080]
[0081][0082]
由表1和图2可知，本发明的多种化合物均特异性地针对肝癌耐药细胞株发挥抑制作用。
[0083]
实施例7本发明的代表性化合物对裸鼠皮下移植肿瘤的抑制活性的测定
[0084]
balb/c裸鼠购自slrc实验动物中心(中国，上海)，在特定无病原体、温控环境(20-22℃温控)中，光暗循环12小时，可自由饮水和进食环境中饲养。为进行异种移植研究，将2
×
106个耐药肝癌bel/5-fu细胞在100μl基质凝胶中皮下注射到小鼠右腋窝3周后，分别应用上述4种化合物(5、6、13和14)以尾静脉注射方式给药。干预剂量依据细胞模型中的ic
50
剂量(≈10μm)。配制干预化学物：以丙二醇为溶剂，配制4mg/ml母液，然后稀释为200μg/ml应用液。以裸鼠血容量2ml计算，血药浓度4.5μg/ml计，每次注射应用液45μl，每周注射3次。每天测量肿瘤体积：[体积＝1/2(短径2×
长径)]，干预14d后，处死裸鼠，取肿瘤组织。
[0085]
由图3a和b可知，本发明的4种化合物均对bel/5-fu细胞裸鼠皮下移植瘤呈现较好的抑制作用。
[0086]
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。