2H-吲唑衍生物作为脑癌和脑转移的治疗剂的制作方法

2h
‑
吲唑衍生物作为脑癌和脑转移的治疗剂
1.相关申请的交叉引用
2.根据35 u.s.c.
§
119(e)，本技术要求于2019年1月29日提交的美国临时申请系列号62/798,220的优先权，其公开内容通过引用全部并入本文。
技术领域
3.本技术涉及使用2h
‑
吲唑衍生物及其组合物治疗脑癌和脑转移的方法。


背景技术：

4.细胞周期蛋白依赖性激酶是调节细胞分裂和增殖的蛋白激酶家族。细胞周期进程受细胞周期蛋白及其相关的细胞周期蛋白依赖性激酶(如cdk1
‑
cdk4和cdk6)控制，而其他cdks(如cdk7
‑
cdk9)对转录至关重要。cdk与细胞周期蛋白结合形成异二聚体复合物，使丝氨酸和苏氨酸残基上的底物磷酸化，反过来启动细胞周期转录和进展所需的事件(malumbres等人,trends biochem.sci.2005,30,630
‑
641)。由于不受控制的细胞增殖是癌症的一个标志，并且大多数癌细胞表现出cdks的失调，因此抑制cdks已成为各种癌症的潜在治疗方法。已经报道了对cdks具有不同程度选择性的抑制剂。由于cdk4/6在调节细胞增殖中的关键作用以及与其他cdks抑制相关的毒性作用，选择性的cdk4/6抑制剂目前被视为一类有前途的潜在癌症治疗剂。
5.阿贝西利(abemaciclib)、帕博西尼(palbociclib)和瑞博西尼(ribociclib)是cdk4/6抑制剂，最近已被批准用于治疗hr

/her2
‑
乳腺癌。
[0006][0007][0008]
然而，这些药物在临床前药代动力学(pk)和疗效模型中均未显示出良好的血脑屏障(bbb)渗透性。参见，例如，raub,t.j.等，drug metab.dispos.2015，43,1360
–
1371。此外，帕博西尼和阿贝西利都是p
‑
糖蛋白(p
‑
gp)底物，这对于一个潜在的cns药物来说是非常不理想的特性，并且它可能会阻碍其用于大脑疾病的发展。
[0009]
脑转移(或“继发性脑肿瘤”)是指癌细胞从体内原始患病器官扩散到大脑，任何癌
症都可能发生这种情况，但更常见的是肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌和黑色素瘤。根据文献，美国大约24
‑
45％的癌症患者发生脑转移(参见https://emedicine.medscape.com/article/1157902
‑
overview)，10％至30％的成年癌症患者发生脑转移(参见https://www.mayoclinic.org/diseases
‑
conditions/brain
‑
metastases/symptoms
‑
causes/syc
‑
20350136)。脑转移会对周围的脑组织造成压力，并可能导致各种体征和症状，包括剧烈疼痛。治疗脑转移不仅有助于延长癌症患者的寿命，而且有助于减轻疼痛和其他症状，从而提高患者的生活质量。
[0010]
因此，开发一种具有高bbb渗透性的cdk4/6抑制剂显然是一个未得到满足的医学需求。


技术实现要素：

[0011]
本发明基于一个令人惊讶的发现，即式(i)的吲唑化合物是具有良好血脑屏障(bbb)渗透性的有效的、选择性cdk4/6抑制剂。因此，这些化合物是用于治疗或预防脑癌和各种其他癌症的脑转移的有效的治疗剂。
[0012]
一方面，本发明提供了一种治疗受试者脑癌或脑转移的方法，所述方法包括施用治疗有效量的式(i)的化合物：
[0013][0014]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：
[0015]
r1是氢、c1‑
c8烷基、c3‑
c7环烷基、r6c(o)
‑
或r7o(co)
‑
；
[0016]
r2和r3各自独立地为氢、c1‑
c8烷基、c3‑
c7环烷基或c3‑
c7环烷基甲基；
[0017]
r4为氢、卤素、c1‑
c8烷基或c3‑
c7环烷基；
[0018]
r5是氢或卤素；
[0019]
r6为氢，c1‑
c8烷基；或c3‑
c7环烷基；和
[0020]
r7是c1‑
c8烷基；或c3‑
c7环烷基，
[0021]
其中任何所述烷基或环烷基任选地被取代。
[0022]
另一方面，本发明提供式(i)的化合物在制备用于治疗与cdk4和/或cdk6活性相关的脑癌或脑转移的药物中的用途。
[0023]
化合物1，n
‑
(5
‑
((4
‑
乙基哌嗪
‑1‑
基)甲基)吡啶
‑2‑
基)
‑5‑
氟
‑4‑
(3
‑
异丙基
‑2‑
甲基
‑
2h
‑
吲唑
‑5‑
基)嘧啶
‑2‑
胺，是式(i)的化合物的实例，其中r1为乙基，r2为异丙基，r3为甲基，r4为氢，且r5为氟。化合物1是一种有效的cdk4/6选择性抑制剂，可用于治疗或预防通过某些cdk(特别是cdk4和cdk6)介导的疾病、病症或医学病况，例如各种类型的癌症和炎症相关病况。脑癌，如胶质母细胞瘤，代表了一个治疗领域，其中cdk4/6抑制剂预计具有很高的疗效潜力。
[0024][0025]
特别地，本发明提供了治疗各种癌症的脑转移的方法，包括但不限于乳腺癌、肺癌，尤其是非小细胞肺癌(nsclc)、结直肠癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、慢性粒细胞白血病(cml)、急性粒细胞白血病(aml)等。
附图说明
[0026]
图1显示了阿贝西利/tmz组合的疗效。剂量：tmz，qd x 5；6mg/kg 阿贝西利，po，qd x 21，100mg/kg。
[0027]
图2显示了化合物1/tmz组合的疗效。剂量：tmz：qd x 5；6mg/kg 化合物1，po，qd x 21，100mg/kg。
具体实施方式
[0028]
本发明的一个方面涉及一种治疗脑癌或源自其他癌症的脑转移的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含式(i)的化合物：
[0029][0030]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：
[0031]
r1是氢、c1‑
c8烷基、c3‑
c7环烷基、r6c(o)
‑
或r7o(co)
‑
；
[0032]
r2和r3各自独立地为氢、c1‑
c8烷基、c3‑
c7环烷基或c3‑
c7环烷基甲基；
[0033]
r4为氢、卤素、c1‑
c8烷基或c3‑
c7环烷基；
[0034]
r5是氢或卤素。r1可以是c1‑
c6烷基；
[0035]
r6为氢，c1‑
c8烷基；或c3‑
c7环烷基；和
[0036]
r7是c1‑
c8烷基；或c3‑
c7环烷基，
[0037]
其中任何所述烷基或环烷基任选地被取代。
[0038]
在一个实施方案中，r1是氢、甲基、乙基、丙基或异丙基。
[0039]
在另一个实施方案中，r2可以是c1‑
c6烷基、c3‑
c6环烷基或c3‑
c6环烷基甲基。
[0040]
在另一个实施方案中，r2是甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、环戊基、环丙基甲基或环戊基甲基。
[0041]
在另一个实施方案中，r3可以是c1‑
c6烷基或c3‑
c6环烷基。
[0042]
在另一个实施方案中，r3是甲基、乙基、丙基、异丙基或环丙基。
[0043]
在另一个实施方案中，r4是氢或卤素。
[0044]
在另一个实施方案中，r5是氢或氟。
[0045]
在另一个实施方案中，有时优选地，r1是甲基或乙基；r2为异丙基、环丙基、环丙基甲基或环戊基；r3是甲基或乙基；r4是氢或氟；且r5是氢或氟。
[0046]
在另一个实施方案中，本发明包括本文描述的实施方案的任何组合。
[0047]
优选地，所述被治疗的脑癌或转移性癌症表达cdk4和/或cdk6。优选地，所述脑癌是胶质母细胞瘤。
[0048]
本发明的另一方面涉及治疗脑癌或源自其他癌症的脑转移的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含下式的化合物：
[0049][0050]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。优选地，所述被治疗的脑癌或转移性癌症表达cdk4和/或cdk6。优选地，所述脑癌是胶质母细胞瘤。
[0051]
本发明的另一方面涉及式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗与cdk4和/或cdk6活性相关的脑癌的药物中的用途，
[0052][0053]
其中：
[0054]
r1是氢、c1‑
c8烷基或c3‑
c7环烷基；
[0055]
r2和r3各自独立地为氢、c1‑
c8烷基、c3‑
c7环烷基或c3‑
c7环烷基甲基；
[0056]
r4为氢、卤素、c1‑
c8烷基或c3‑
c7环烷基；和
[0057]
r5是氢或卤素。
[0058]
在一些实施方案中，r1是c1‑
c6烷基。优选地，r1是氢、甲基、乙基、丙基或异丙基。
[0059]
在一些实施方案中，r2是c1‑
c6烷基、c3‑
c6环烷基或c3‑
c6环烷基甲基。优选地，r2是甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、环戊基、环丙基甲基或环戊基甲基。
[0060]
在一些实施方案中，r3是c1‑
c6烷基或c3‑
c6环烷基。优选地，r3是甲基、乙基、丙基、异丙基或环丙基。
[0061]
在一些实施方案中，r4是氢或卤素。
[0062]
在一些实施方案中，r5是氢或氟。
[0063]
在一些实施方案中，有时更优选地，r1是甲基或乙基；r2为异丙基、环丙基、环丙基甲基或环戊基；r3是甲基或乙基；r4是氢或氟；且r5是氢或氟。
[0064]
在一些优选的实施方案中，有时优选地，与cdk4和/或cdk6活性相关的脑癌是胶质母细胞瘤或其他癌症的脑转移。
[0065]
本发明的另一方面涉及下式的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗与cdk4和/或cdk6活性相关的脑癌或转移性癌症(例如转移性脑癌)的药物中的用途，
[0066][0067]
优选地，所述脑癌是胶质母细胞瘤。
[0068]
在上述任一实施方案中，与cdk4和/或cdk6活性相关并引起脑转移的癌症包括但不限于，乳腺癌、肺癌(尤其是非小细胞肺癌(nsclc))、结直肠癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、慢性粒细胞白血病(cml)、急性粒细胞白血病(aml)等，所述方法包括向癌症患者施用治疗有效量的根据本文公开的任何实施方案的化合物。
[0069]
在一个优选的实施方案中，所述方法是针对转移性乳腺癌的治疗。
[0070]
在另一个优选的实施方案中，所述方法是针对转移性肺癌，特别是转移性非小细胞肺癌的治疗。
[0071]
在一些实施方案中，本发明提供了一种将本文公开的化合物用于癌症患者的方法，用于预防脑转移，即癌细胞从原始患病器官的扩散。
[0072]
在所有实施方案中，优选地，所述脑癌或脑转移与cdk的活性，特别是cdk4或cdk6的活性相关。
[0073]
本发明包括本文公开的任何实施方案的所有可能组合。
[0074]
除非另有说明，本文所用的术语“烷基”旨在包括含有1至8个碳，优选1至6个，更优选1至4个碳的支链和直链饱和脂肪族烃基。该术语包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基等。
[0075]
除非另有说明，本文所用的术语“亚烷基”是指通过去除两个氢原子而衍生自烷烃的二价饱和脂肪族基团。实例包括但不限于亚甲基(
‑
ch2‑
)、亚乙基(
‑
ch2ch2‑
)、亚丙基(
‑
ch2ch2ch2‑
)等。
[0076]
除非另有说明，本文中单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“环烷基”包括具有3至8个、有时优选3至6个形成环的碳的饱和环烃基。实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
[0077]
本文所用的“卤代”或“卤素”是指氟(f)、氯(cl)、溴(br)和碘(i)。
[0078]
此外，在本文公开的任何实施方案中，烷基、亚烷基、环烷基和环烷基甲基可各自任选地被一个或多个，优选一至三个，有时优选一至两个独立地选自由如下组成的组的取代基取代：卤素、c1‑
c4烷基、oh、c1‑
c4烷氧基和cn。
[0079]
当任何基团被称为“任选地取代”时，除非具体定义，否则意味着该基团被或未被取代，前提是这种取代不会违反本领域普通技术人员已知的常规成键原则。当在一组基团之前使用短语“任选地取代”时，表示所列基团中的每一个都可以任选地被取代。
[0080]
本领域普通技术人员将理解，对于描述为包含一个或多个取代基的任何分子，仅
意在包括空间上实用和/或合成上可行的化合物。除非在本说明书中另有说明，当一个变量被称为任选地被取代基取代或代替时，应理解这种取代是通过用这些取代基之一取代与该变量共价结合的氢而发生的。
[0081]
本发明的化合物通常被认为是有机碱，其能够与酸，特别是药学上可接受的酸反应，形成药学上可接受的盐。
[0082]
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和低等动物组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应等的盐，并且与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。参见，例如，s.m.berge等人，j.pharm.sci.，1977，66，1
‑
19，在此引入作为参考。本发明化合物的药学上可接受的盐包括那些衍生自合适的无机和有机酸的盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的氨基盐，或通过使用本领域中使用的其他方法如离子交换。其他药学上可接受的盐包括：己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2
‑
羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2
‑
萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3
‑
苯基丙酸盐、磷酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。优选的药学上可接受的盐包括盐酸盐。
[0083]
本文所用的术语“溶剂化物”是指本发明的化合物与化学计量或非化学计量量的溶剂分子的物理结合。例如，一分子化合物与一或多个，优选一至三个，溶剂分子缔合。化合物的多个(例如，1.5或2个)分子共享一个溶剂分子也是可能的。这种物理结合可以包括氢键。在某些情况下，溶剂化物将能够作为结晶固体分离。溶剂化物中的溶剂分子可以以规则排列和/或无序排列存在。示例性的溶剂化物包括但不限于水合物、乙醇化物、甲醇化物和异丙醇化物。溶剂化方法是本领域公知的。
[0084]
尽管本文公开的通式(i)的化合物本身可以是“前药”形式，即当r1是酰基(即rc(o)
‑
)或酯基(即roc(o)
‑
)时，这些“前药”可以在生理条件下由其他“前药”在体内产生。因此，对于这些公开的化合物，本文所用的术语“前药”是指可在体内转化以产生母体化合物的化合物的衍生物，例如，通过在血液中水解。本发明中前药的常见实例包括但不限于活性胺化合物的酰胺或磷酰胺形式，例如式(ii)的化合物：
[0085][0086]
其中r6是酰基(例如，乙酰基、丙酰基、甲酰基等)或磷酰基[例如
‑
p(＝o)(oh)2]基
团；或者任选地，当活性化合物中的r3是氢时，相应的酰胺或磷酰胺化合物可以作为前药。此类酰胺或磷酰胺前药化合物可根据本领域已知的常规方法制备。
[0087]
虽然本发明的化合物的治疗有效量，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为化学原料给药用于治疗，但可以将活性成分作为药物组合物呈现。因此，本公开进一步提供了药物组合物，其包含本发明的任何化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及一种或多种，优选一到三种药学上可接受的载体、稀释剂或其他赋形剂。载体、稀释剂或其他赋形剂在与制剂的其他成分相容并且对所治疗的受试者无害的意义上必须是可接受的。
[0088]
本文所用的“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与患者组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应的化合物、材料、组合物和/或剂型的特性，或其他问题或并发症与合理的收益/风险比相称，并对其预期用途有效。
[0089]
药物制剂可以单位剂量形式存在，每单位剂量含有预定量的活性成分。代表性地，本公开的药物组合物将从每1
‑
5天给药一次至每天约1
‑
5次，或者任选地，作为连续给药。这种给药可用作慢性或急性治疗。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的病况、病况的严重程度、给药时间、给药途径、所用化合物的排泄速率、治疗持续时间以及患者的年龄、性别、体重和病况的变化。优选的单位剂量制剂是那些含有日剂量或亚剂量的活性成分，如上文所述，或其合适的部分。通常，治疗开始时，剂量要大大低于化合物的最佳剂量。此后，剂量以小幅度递增，直到在这种情况下达到最佳效果。一般而言，最理想的是在一个浓度水平上施用该药物，而不会造成实质性有害或有害的副作用。
[0090]
当本公开的组合物包含本公开的化合物和一种或多种，优选一种或两种额外的治疗剂或预防剂的组合时，化合物和额外的药剂通常以约10
‑
150％，并且更优选约10
‑
80％的剂量水平存在于通常在单一治疗方案中施用的剂量。
[0091]
药物制剂可适宜通过任何适当的途径给药，例如，通过口服(包括口腔或舌下)、直肠、鼻腔、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或皮内注射或输注)途径。这类制剂可以通过药学领域已知的任何方法来制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂结合。优选口服给药或注射给药。
[0092]
适合口服给药的药物制剂可以以独立的单位形式出现，如胶囊或片剂；粉末或颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；可食用的泡沫或甜点；或水包油液体乳剂或油包水乳剂。
[0093]
例如，对于片剂或胶囊形式的口服给药，活性药物成分可以与口服的、无毒的药学上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等结合。粉末的制备方法是将化合物粉碎到合适的细小尺寸，并与同样粉碎的药物载体(如可食用的碳水化合物，如淀粉或甘露糖醇)混合。调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂也可以存在。
[0094]
如上所述，胶囊是通过制备粉末混合物和填充成型的明胶护套制成的。助流剂和润滑剂，如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇，可以在填充操作之前加入到粉末混合物中。也可以加入崩解剂或增溶剂，如琼脂、碳酸钙或碳酸钠，以提高胶囊摄入时药物的利用率。
[0095]
此外，当需要或有必要时，适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可以加入混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖，如葡萄糖或β
‑
乳糖、玉米甜味剂、天然和合
成胶，如阿拉伯树胶、黄芪胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂的配制，例如，通过制备粉末混合物，造粒或压块，添加润滑剂和崩解剂，并压制成片剂。粉末混合物的制备方法是将适当粉碎的化合物与上述稀释剂或基质混合，并任选地与粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、凝胶剂或聚乙烯吡咯烷酮、溶液阻滞剂如石蜡、吸收促进剂如季铵盐和/或吸收剂如膨润土、高岭土或磷酸二钙混合。粉末混合物可以通过用粘合剂(如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚粘液或纤维素或聚合物材料的溶液)润湿并压过筛来造粒。作为造粒的替代方法，粉末混合物可以通过压片机运行，其结果是不完全形成的块状物被破碎成颗粒。可以通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油的方式对颗粒进行润滑，以防止粘在片剂成型模具上。然后将经过润滑的混合物压制成片剂。本公开的化合物还可以与自由流动的惰性载体结合，直接压制成片剂，而不需要经过造粒或压块的步骤。可以提供由虫胶的密封涂层、糖或聚合材料的涂层和蜡的抛光层组成的透明或不透明的保护层。染料可以被添加到这些涂层中以区分不同的单位剂量。
[0096]
口服液例如溶液、糖浆和酏剂可以按剂量单位形式制备，以便使一定数量的化合物含有预定的数量。糖浆可以通过将化合物溶解在适当口味的水溶液中来制备，而酏剂则通过使用无毒的载体来制备。还可以添加增溶剂和乳化剂，如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚、防腐剂、风味添加剂，如薄荷油或天然甜味剂，或糖精或其他人造甜味剂等。
[0097]
在适当的情况下，用于口服给药的剂量单位制剂可以进行微囊化。制剂也可以被制备成延长或维持释放，例如通过在聚合物、蜡等材料中涂抹或嵌入颗粒材料。
[0098]
应该理解的是，除了上述特别提到的成分外，制剂还可以包括本领域中讨论到有关制剂类型的其他常规制剂，例如适合口服给药的制剂可以包括调味剂。
[0099]
术语“受试者”或“患者”包括人类和其他哺乳动物，包括但不限于马、狗、猫、猪、猴子等，优选地是人类。
[0100]
术语“治疗有效量”是指一种化合物或组合物的量，当给受试者治疗疾病时，该量足以实现对疾病的这种治疗。“治疗有效量”可根据化合物、疾病及其严重程度、以及待治疗对象的年龄、体重或其他因素而变化。当适用于单独的活性成分时，该术语指的是该成分本身。当适用于组合物时，该术语指的是产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合、连续或同时给药。
[0101]
在一些实施方案中，术语“治疗”或“疗法”指的是：(i)抑制疾病、病症或病况，即阻止其发展；(ii)缓解疾病、病症或病况，即导致疾病、病症和/或病况的消退；或(iii)防止疾病、病症或病况在可能易患该疾病、病症和/或病况但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生。因此，在一些实施方案中，“治疗”或“疗法”是指改善疾病或病症，这可能包括改善一个或多个身体参数，尽管也许无法被接受治疗的受试者察觉。在一些实施方案中，“治疗”或“疗法”包括调节疾病或病症，可以是身体上的(例如，稳定可察觉的症状)或生理上的(例如，稳定的身体参数)或两者兼而有之。在又一些实施方案中，“治疗”或“疗法”包括推迟疾病或病症的发生。
[0102]
进行了化合物1和阿贝西利与替莫唑胺(tmz)联合治疗小鼠原位u87mg
‑
luc人胶质母细胞瘤的疗效和比较研究。在每项研究中，tmz以6mg/kg、qd x 5po给药，化合物1或阿贝西利以100mg/kg po给药。用生物发光法观察肿瘤的生长。阿贝西利/tmz组合显示肿瘤体积
减少到第42天，随后在第49天重新生长(图1)。相比之下，化合物1/tmz组合在第28天显示出明显的肿瘤体积减少，并在第63天肿瘤体积持续减少(图2)。鉴于化合物1和阿贝西利的体外效力相当，在胶质母细胞瘤模型中，化合物1相对于阿贝西利的体内疗效更优，可归因于化合物1相对于阿贝西利更有利的bbb渗透性特征。从广义上讲，化合物1和阿贝西利在脑部疾病模型中的显著差异可以追溯到它们不同的分子结构。
[0103]
化合物1和阿贝西利在分子结构上的主要区别是，化合物1含有一个2h
‑
吲唑核，而阿贝西利含有一个苯并咪唑核：
[0104][0105]
相比于
[0106][0107]
这种结构差异出人意料地导致两种化合物之间存在明显的bbb渗透性分布差异。实施例3描述了小鼠体内研究，观察到化合物1的脑部浓度比阿贝西利高约3倍，化合物1的脑/血浆(b/p)比率为1.43，而阿贝西利为0.43(见表1和2)。此外，值得注意的是，化合物1不是p
‑
gp底物(参见实施例2)。
[0108]
表1.化合物1在小鼠中的脑部浓度和b/p比率(10mg/kg，p.o)
[0109][0110]
表2.阿贝西利在小鼠中的脑部浓度和b/p比率(10mg/kg，p.o)
[0111]
[0112][0113]
尽管无意限制，但可用于本发明的化合物的示例性非限制性实例列于表3中。
[0114]
表3.式(i)的化合物的选定的实例
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128][0129]
实施例
[0130]
实施例1.小鼠体内疗效的研究
[0131]
材料和方法
[0132]
d
‑
荧光素(lot#0000204125)从promega公司获得，为白色粉末，并在
‑
80℃下储存在有盖的盒子中以减少光照。在d
‑
荧光素粉末中加入生理盐水，生成15mg/ml的黄色透明溶液，用于体内成像。d
‑
荧光素在每次生物发光成像之前立即制备，并在使用期间避光保存在湿冰上。
[0133]
替莫唑胺(99.0％母体，mw 194g/mol，fw 194g/mol，99％纯度，c6h6n6o2，lot#s123705)从selleckchem公司获得，为粉红色精细粉末。收到后，避光保存在
‑
20℃。该化合物被配制在无菌水的载体中。涡旋给药制剂以形成无色透明的溶液，ph值为6.3。每周配制一次给药溶液，并在治疗之间避光保存在4℃。
[0134]
化合物1(92.8％母体，mw 489g/mol，fw 525g/mol，99.7％纯度，c
27
h
33
fn8·
hcl，在4℃富氮环境中避光保存。该化合物被配制在10％乙醇、10％和80％盐
水(0.9％nacl)的载体中。给药制剂制备的方法是首先在设定为大约42℃的水浴中加热所有的载体成分。首先将乙醇加入含有预先称重的bpi
‑
1178粉末的无菌剂量瓶中。然后对混合物进行涡旋，以确保所有粉末完全溶解。接下来，将加入溶液中，并涡旋混合。最后，加入生理盐水，并将最后的混合物涡流搅拌，形成ph值为5.7的无色透明溶液。给药溶液每天都是新鲜制备的。
[0135]
阿贝西利(83.7％母体，mw 506g/mol，fw 603g/mol，99.6％纯度，c
27
h
32
f2n8‑
h3cso3h，从beta pharma获得，为白色片状粉末。收到后，在4℃的富氮环境中避光保存。该化合物被配制在10％的乙醇、10％的和80％的盐水(0.9％nacl)的载体中。给药制剂制备的方法是首先在设定为大约42℃的水浴中加热所有的载体成分。首先将乙醇加入含有预先称重的阿贝西林粉末的无菌剂量瓶中。然后对混合物进行涡旋，以确保所有粉末完全溶解。接下来，将加入到溶液中，并涡旋混合。最后，加入生理盐水，并将最后的混合物涡流搅拌，形成ph值为4.0的无色透明溶液。给药溶液每天都是新鲜制备的。
[0136]
动物和饲养
[0137]
本研究使用了雌性envigo裸鼠(hsd：athymic nude
‑
foxn1nu)。它们在实验的第一天是6
‑
7周大。不限制地给动物喂食经过辐照的harlan 2918.15鼠粮和水。动物被安置在洁净室中的一次性通风笼中，笼中铺有玉米芯垫料，该洁净室以每小时100次完全换气的速度向气泡环境中提供h.e.p.a过滤空气。所有的治疗、体重测定和肿瘤测量都是在气泡环境中进行的。环境被控制在70
°±2°
f的温度范围和30
‑
70％的湿度范围内。
[0138]
所有程序均符合美国国立卫生研究院(nih)的所有法律、法规和指导方针，并获得molecular imaging,inc.的动物护理和使用委员会批准。molecular imaging,inc.是aaalac认可的机构。
[0139]
实施例1a.细胞制备
[0140]
mg
‑
luc细胞从atcc获得。它们在含有earle's salts的最低基本培养基(mem)中生长，该培养基用1％100mm丙酮酸钠、1％100x neaa(非必需氨基酸)、200μg/ml g418修饰，并补充有10％非热灭活胎牛血清(fbs)和1％100x青霉素/链霉素/l
‑
谷氨酰胺(psg)。生长环境保持在37℃、5％co2气氛的培养箱中。当扩增完成后，使用0.25％的胰蛋白酶
‑
edta溶液对细胞进行胰蛋白酶消化。细胞分离后，用完全生长培养基稀释使胰蛋白酶失活，并通过移液分离任何细胞团块。细胞在4℃下以200rcf离心8分钟，吸出上清液，并通过移液将沉淀重新悬浮在冷的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)中。在台盼蓝溶液中稀释均匀的细胞悬液，并使用luna自动细胞计数器进行计数。细胞悬液在4℃下以200rcf离心8分钟。吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于冷的无血清培养基中，生成最终浓度为1.0e 08的无台盼蓝的细胞/ml。在植入过程中将细胞悬浮液保持在湿冰上。植入后，将剩余细胞的等分试样用台盼蓝溶液稀释并计数以确定植入后细胞活力。
[0141][0142][0143]
实施例1b.颅内植入
[0144]
试验小鼠在第0、1和2天以每10μl 1.0e 06细胞进行颅内植入。为了进行无菌手术植入，给小鼠注射0.2mg/kg丁丙诺啡，并在空气中用2％异氟烷进行麻醉。然后使用非破裂的耳棒将小鼠固定在立体定位框架(asi instruments,inc.)中。在小鼠的眼睛上涂抹眼药膏，以防止手术过程中干燥。在植入过程中，使用37℃的循环水加热垫来维持动物的体温。
[0145]
一旦进入立体定位框架，就用氯己定溶液和70％的乙醇饱和的棉签交替擦拭颅骨，对皮肤表面进行消毒，并为切口做准备。使用15号bd手术刀在颅骨前囟门中央做一个1cm的纵向切口。使用小的锯齿状弹簧镊将切口缩回。在轻压下用干棉签去除覆盖在颅骨表面的薄层结缔组织。出血的血管被烧灼以防止血液流失。然后将0.9mm的钻头放在前囟门的中心，向右外侧移动2mm，向冠状缝前方移动1mm，并降低钻头使用立体定向电极操作臂以刻划颅骨表面。将钻头从立体定位框架上取下，用手完成穿过颅骨至硬脑膜表面的钻孔。
[0146]
将细胞悬液(储存在湿冰上)充分混合，并吸入到一个50μl气密的hamilton注射器中。用一个标准的27g针头填充细胞悬液以消除气泡，并将注射器的鲁尔尖端插入针头接口。注射器被固定在一个定制的注射器支架上(asi instruments,inc.)，并连接到立体定位框架操作臂上。将注射器针头对准钻孔的中心，并将其降低，直到斜面尖端与硬脑膜表面的颅骨下侧齐平。然后将针头降低3mm进入大脑并缩回1mm以形成用于沉积细胞悬液的“储库”。然后将10μl的细胞悬液(1x106细胞/小鼠)缓慢注入脑组织，任何轻微的渗漏(典型的ic植入物)都用干棉签吸收。
[0147]
注射后，拔出针头，立即用骨蜡密封钻孔，以尽量减少植入细胞的损失。然后用干棉签和70％乙醇饱和棉签交替清洁颅骨表面，以去除外来细胞并阻止颅外肿瘤的生长。将小鼠从立体定位框架中取出，并使用不锈钢伤口夹闭合切口。一旦小鼠恢复了意识和背位，它就被放回笼中。小鼠于2017年2月20日至22日被植入。
[0148]
实施例1c.治疗
[0149]
根据肿瘤负荷的生物发光成像(bli)估计，将所有小鼠分为研究组。小鼠的分配是为了确保所有组的平均肿瘤负荷在研究人群的总体平均肿瘤负荷的10％以内。由于植入发生在三天内，第0天被定义为中间植入日期(2017年2月21日)。无论初始植入日期如何，所有
组均在第21天开始治疗。
[0150]
第1组：载体对照(10％etoh、10％80％生理盐水(0.9％nacl))、0.2ml/20g、po、qdx21(第21
‑
41天)
[0151]
第2组：替莫唑胺，6mg/kg，po，qdx5(第21
‑
25天)
[0152]
第3组：化合物1，100mg/kg，po，qdx21(第21
‑
41天)
[0153]
第4组：阿贝西利，100mg/kg，po，qdx21(第21
‑
41天)
[0154]
第5组：替莫唑胺，6mg/kg，po，qdx5(第21
‑
25天) 化合物1，100mg/kg，口服给药，qdx21(第21
‑
41天)
[0155]
第6组：替莫唑胺，6mg/kg，po，qdx5(第21
‑
25天) 阿贝西利，100mg/kg，po，qdx21(第21
‑
41天)
[0156]
实施例1d.体内生物发光成像(bli)
[0157]
体内生物发光成像(bli)是使用ivis spectrum(caliper life sciences,hopkinton,ma)进行的。在约1
‑
2％的异氟醚气体麻醉下，一次最多对5只动物进行成像。每只小鼠皮下注射150mg/kg(15mg/ml)d
‑
荧光素，注射后10分钟以俯卧位进行成像。使用ccd芯片的大分档，并调整曝光时间(2秒至2分钟)，以获得每个图像至少数百个计数，并避免ccd芯片的饱和。bli图像在第21、28、35、42、49、56和64天收集。
[0158]
使用matlab r2015a软件分析图像。在每只动物的俯卧图像上放置初级大脑固定体积roi，以估计脑肿瘤负荷。计算并导出所有roi的总通量(光子/秒)以方便组间分析。
[0159]
实施例1e.副作用的评估
[0160]
所有动物每天至少观察一次临床症状。在治疗的每一天都对动物进行称重。每周记录3次个体体重。
[0161]
与治疗有关的体重下降超过20％，通常被认为是不可接受的毒性。在本研究中，如果与治疗有关的体重减轻(治疗期间和治疗后两周)<20％，并且在此期间在没有潜在的致命肿瘤负荷的情况下死亡率≤10％，则该剂量水平被描述为耐受。
[0162]
在死亡或安乐死后，所有的动物都被解剖，以提供对潜在死因和可能的毒性靶器官的一般评估。还记录是否有转移。对临床症状和解剖结果的显著观察进行了记录，并对个体和组的毒性结果进行了总结。
[0163]
实施例2.化合物1的细胞渗透性研究
[0164]
总结
[0165]
测试样品p
‑
gp底物分类1阴性
[0166]
测试样品通过了荧光素黄单层完整性测试标准(≤0.8
×
10
‑6cm/s)。
[0167]
目的
[0168]
本研究的目的是利用mdr1
‑
mdck单层确定一种测试样品的p
‑
gp底物电位。
[0169]
实验步骤
[0170]
mdr1
‑
mdck细胞单层在12孔检测板的胶原涂层的微孔膜上生长至汇合。板子的详细说明及其认证见下文。渗透性检测缓冲液是hanks平衡盐溶液(hbss)，含有10mm hepes和15mm葡萄糖，ph值为7.4。接收隔室中的缓冲液还含有1％的牛血清白蛋白。给药溶液的浓度为检测缓冲液中的5μm测试样品 /
‑
1μm戊司泊达。首先将细胞与含有 /
‑
1μm戊司泊达的
hbss预孵育30分钟。细胞单层在顶端(a
‑
b)或基底外侧(b
‑
a)投药，并在37℃和5％的co2下在加湿培养箱中孵育。在120分钟时从供体隔室和接收隔室中取样。每次测定一式两份进行。每个单层的荧光素黄的通量也在实验后测量，以确保在通量期间没有对细胞单层造成损害。所有样品都使用电喷雾电离通过lc
‑
ms/ms进行分析。分析条件在附录1中概述。表观渗透率(p
app
)和回收率的计算方法如下：
[0171]
p
app
＝(dc
r
/dt)
×
v
r
/(a
×
c
a
)
ꢀꢀꢀ
(1)
[0172]
回收率＝100
×
((v
r
×
c
rfinal
) (v
d
×
c
dfinal
))/(v
d
×
c
n
)
ꢀꢀꢀ
(2)
[0173]
其中
[0174]
dc
r
/dt是接收隔室中累积浓度随时间的斜率，单位为μm s
‑1；
[0175]
v
r
为接收隔室体积，单位为cm3；
[0176]
v
d
是供体隔室的体积，单位为cm3；
[0177]
a是插入物的面积(12孔为1.13cm2)；
[0178]
c
a
是标称的给药浓度和测量的120分钟给药浓度的平均值，单位为μm；
[0179]
c
n
是给药溶液的标称浓度，单位为μm；
[0180]
c
rfinal
是在培养期结束时以μm为单位的累积接收浓度；
[0181]
c
dfinal
是在培养期结束时以μm为单位的供体浓度。
[0182]
流出率(er)定义为p
app
(b
‑
a)/p
app
(a
‑
b)。
[0183]
细胞批次质量控制结果
[0184][0185]
实验结果
[0186][0187]
p
‑
gp底物分类标准：
[0188]
不使用戊司泊达时er≥2.0，使用戊司泊达时减少≥50％：阳性
[0189]
不使用戊司泊达时er≥2.0，使用戊司泊达时减少<50％：阴性
[0190]
不使用和使用戊司泊达时er<2.0：阴性
[0191]
基于上述结果，化合物1不是p
‑
gp的底物。
[0192]
分析方法
[0193]
液相色谱法
[0194]
柱子：watersbeh苯基柱30
×
2.1mm,1.7μm
[0195]
m.p.缓冲液：25mm甲酸铵缓冲液，ph 3.5
[0196]
水溶液容器(a)：90％水，10％缓冲液
[0197]
有机物容器(b)：90％乙腈，10％缓冲液
[0198]
流速：0.7ml/min
[0199]
梯度洗脱：
[0200]
时间(分钟)％a％b0.009910.651990.751990.809911.00991
[0201]
总运行时间：1.0min
[0202]
自动进样器：5μl进样量
[0203]
冲洗1：水/甲醇/2
‑
丙醇:1/1/1；含0.2％甲酸
[0204]
冲洗2：0.1％甲酸水溶液
[0205]
质谱分析法
[0206]
仪器：pe sciex api 4000
[0207]
接口：涡轮离子喷雾器
[0208]
模式：多反应监测
[0209]
方法：持续1.0min
[0210]
设置：
[0211]
测试样品 /
‑
q1q3dpepcecxpisbpi
‑
1178
‑
7 489.4375.3121028125500
[0212]
tem：500；cad：7；cur：30；gs1：50；gs2：50
[0213]
实施例3.小鼠的脑浓度和脑/血浆比率
[0214]
小鼠以10mg/kg p.o。如表1和表2所示，观察到化合物1的脑浓度比阿贝西利高约3倍，并且化合物1的脑/血浆(b/p)比率为1.43，而阿贝西利仅为0.43。
[0215]
本公开提供了一些数值的范围。应当理解的是，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每一个介于下限单位的十分之一的中间值。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且在较小范围内包括任何一个、两个或两个限度的每个范围也包括在本发明内，但须遵守所述范围内任何具体排除的限度。当所述范围包括一个或两个限度时，排除这些被包括的限度中的一个或两个的范围也包括在本发明中。术语“约”一般包括所标示数字的正负10％以内。例如，“约10％”可表示9％至11％的范围，而“约20”可指18至22。优选地是“约”最多包括示值的正负6％。或者，“约”包括不超过示值的正负5％。从上下文中可以看出“约”的其他含义，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可以指0.5到1.4。
[0216]
出于所有目的，本文引用的所有出版物通过引用整体并入。应当理解的是，本文所述的实施方案应当被认为仅是说明性的，而不限制本发明的范围。每个实施方案中的特征或方面的描述通常应被视为可用于其他实施方案中的其他类似特征或方面。
[0217]
虽然在上述实施例中已经描述了几个实施方案，但本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离以下权利要求书所定义的本公开的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。