咖啡酸用于制备改善心肌肥大的药物的用途的制作方法

1.本发明涉及咖啡酸的用途，尤其是咖啡酸用于制备改善心肌肥大的药物的用途。


背景技术：

2.心肌肥厚以心肌细胞体积增大、蛋白质含量增多、心肌纤维化异常加重为主要特征，是对各种机械应力及刺激因子等的适应性反应，持续的病理性心肌肥厚能够引起心肌肥厚标志基因显著表达，心室扩张、心功能异常，进一步发展为心肌缺血甚至心衰。在细胞层面，心肌肥大是心肌肥厚最直接的表现形式，已成为心力衰竭的重要危险因素，寻求有效的防治措施具有重要的临床意义。
3.咖啡酸存在于许多植物中，如菊科植物一枝黄，蔷薇科植物山里红，以及其他植物如薄荷、杜仲、蒲公英、仙鹤草、柠檬皮等。成品咖啡、山楂、柠檬中咖啡酸含量丰富。cn103381151a公开了咖啡酸在制备抗血栓药物中的应用。cn105708828a公开了咖啡酸在制备治疗肝微循环障碍和肝损伤药物中的应用。cn111067884a公开了一种药物组合物及其应用，该药物组合物包括咖啡酸和阿霉素，该药物组合物用于制备治疗药物性心肌病，该药物性心肌病为阿霉素所引起的心肌病。
4.到目前为止，尚未见有人报道咖啡酸在制备改善心肌肥大的药物方面的应用。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种咖啡酸的新的医药用途。本发明采用如下技术方案实现上述目的。
6.本发明提供咖啡酸用于制备改善心肌肥大的药物的用途。
7.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成改善心肌肥大的药物制剂；所述药物制剂包含所述咖啡酸，还包含药学上可接受的辅料。
8.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物制剂以所述咖啡酸作为唯一活性成分。
9.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于减小异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞表面积的药物制剂。
10.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于降低异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的anp mrna表达水平的药物制剂。
11.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的bnp mrna的表达的药物制剂。
12.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的hif
‑
1αmrna的过表达的药物制剂。
13.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的p
‑
akt蛋白磷酸化以及p
‑
mtor蛋白磷酸化的表达的药物制剂。
14.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于降低异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的hif
‑
1α蛋白的表达水平的药物制剂。
15.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物形成用于对异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的pi3kα蛋白表达水平基本无影响的药物制剂。
16.本发明的咖啡酸用于制备改善心肌肥大的药物的用途。本发明的咖啡酸能够用于减小异丙肾上腺素(iso)诱导的h9c2心肌细胞表面积，抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的anp mrna、bnp mrna、hif
‑
1αmrna的表达水平。
附图说明
17.图1为不同浓度的咖啡酸对h9c2心肌细胞活力的影响。
18.图2为实验例2中咖啡酸对iso诱导的h9c2心肌细胞表面积的影响。
19.图3为咖啡酸改善心肌肥大的可能的作用机制。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
21.心肌肥厚是心脏长期处于压力负荷及交感神经激活状态下的一种适应性反应。众多研究表明，β肾上腺素受体具有参与调控心肌收缩、心脏起搏及心脏能量代谢的作用，此外，在交感神经持续激活的状态下，其对心肌肥厚的形成过程起到关键的作用。
22.异丙肾上腺素(iso)是典型的β1
‑
ar激动剂，持续刺激可引起心肌细胞肥大、心肌缺血、心肌坏死和凋亡等多种心脏病理反应，最终引起心肌肥厚和心力衰竭的发生发展。目前，异丙肾上腺素(iso)已被公认为是建立动物心肌肥厚及心肌细胞肥大模型的经典药物，广泛应用于动物及细胞实验。因此，本发明选择安全浓度范围内的iso，进一步将不同浓度的iso分别作用于生长状态良好的h9c2心肌细胞进行诱导造模。本发明采用phalloidin和dapi细胞荧光染料进行双染，细胞骨架被phalloidin染成绿色，细胞核被dapi染成亮蓝色，细胞骨架及细胞核明显清晰，且方便操作，易于对心肌细胞表面积的大小进行观察及后期统计分析。
23.本发明的咖啡酸的结构如下所示：
[0024][0025]
本发明中，所述咖啡酸的分子式为c9h8o4，分子量为180.16。咖啡酸为已知化合物。咖啡酸可以根据现有技术制备得到。例如，可以根据cn111676264a(一种从迷迭香中提取咖啡酸的方法)提取咖啡酸。本发明中，咖啡酸具有改善心肌肥大的作用，可以用于制备改善心肌肥大的药物。根据本发明的一些实施方式，本发明的咖啡酸可以减小异丙肾上腺素(iso)诱导的h9c2心肌细胞表面积、降低异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的anp mrna表达水平、抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的bnp mrna的表达、抑制异丙肾上腺
素诱导的h9c2心肌细胞中的hif
‑
1αmrna的过表达。
[0026]
隐绿原酸是中药化学成分，来源于金银花，杜仲等中药，又称为4
‑
咖啡酰奎宁酸，其结构如下所示：
[0027][0028]
尽管咖啡酸与隐绿原酸的部分化学结构存在相似之处，奎宁酸基团的加入导致二者在整体化学结构上存在较大差异。这导致本领域技术人员无法预期二者具有相近的药物疗效。本技术的实施例已经证明，对于改善心肌肥大而言，咖啡酸优于隐绿原酸。这也作证了二者之间不是可以相互替代的，将咖啡酸用于制备改善心肌肥大的药物不是本领域技术人员的常规选择。实际上，本领域技术人员通常会在隐绿原酸的苯环或羟基增加某些取代基来改善其药物疗效，而不会将隐绿原酸的奎宁酸基团替换为氢来改善其药物疗效。通常认为，结构简单的化合物，药物疗效一般。本发明则克服了这样的技术偏见。
[0029]
根据本发明的另一些实施方式，本发明的咖啡酸可以抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的p
‑
akt蛋白磷酸化的表达、抑制异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的p
‑
mtor蛋白磷酸化的表达、降低异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的hif
‑
1α蛋白的表达水平、且对异丙肾上腺素诱导的h9c2心肌细胞中的pi3kα蛋白表达水平基本无影响。
[0030]
本发明中，所述改善心肌肥大的药物可以咖啡酸作为唯一活性成分；也可以包含其他具有改善心肌肥大作用的活性成分，或者包含本身不具有改善心肌肥大作用、但能够辅助咖啡酸发挥改善心肌肥大作用的活性成分。
[0031]
本发明中，所述改善心肌肥大的药物可以为原料药，也可以为药物制剂。
[0032]
本发明中，所述药物形成具有改善心肌肥大作用的药物制剂。本发明中，所述药物制剂的剂型不限，可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂等。所述药物制剂还可以包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料的种类不做限制。辅料可以为填充剂、矫味剂、润滑剂等。填充剂又称稀释剂，例如小麦淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、微晶纤维素、乳糖等。矫味剂的实例包括但不限于甜菊糖苷、甘草甜素、罗汉果甜苷、安赛蜜、阿斯巴甜、蔗糖素、异麦芽酮糖等。润滑剂实例包括但不限于硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、月桂醇硫酸镁等。
[0033]
下面对实验例中所用实验材料、细胞复苏、细胞培养以及心肌细胞肥大模型的建立进行说明：
[0034]
1.1实验材料
[0035]
1.1.1材料来源
[0036]
咖啡酸(ca)购于上海源叶生物科技有限公司，批号：y09j8c28349，纯度>98％。隐
绿原酸购于成都普思生物科技股份有限公司，批号：ps001110，纯度>98％。
[0037]
h9c2心肌细胞购于北京协和细胞资源中心。高糖dmem培养基、胰蛋白酶、pbs溶液(即pbs缓冲液)、96孔板、48孔板、细胞培养皿、50ml离心管、1.5mlep管均购于美国corning公司。胎牛血清、青链霉素混合液(双抗)购于美国gibco公司。mtt粉末、dapi荧光染料均购于北京拜尔迪生物技术有限公司。异丙肾上腺素(iso)、fitc标记的鬼笔环肽(phalloidin)粉末购于美国sigma公司。strandcdna synthesis supermix、sybr qpcr supermix plus购于美国roche公司。
[0038]
1.1.2溶液配制
[0039]
高糖dmem完全培养液：由高糖dmem培养基89ml、胎牛血清10ml、双抗1ml配制而得。
[0040]
mtt溶液：由mtt粉末50mg和pbs溶液10ml配制而得。
[0041]
细胞冻存液：高糖dmem培养基720μl、胎牛血清200μl、dmso 80μl配制而得。
[0042]
1.1.3细胞复苏
[0043]
细胞复苏应采用快速融化法，该操作是为了防止缓慢融化时产生的冰晶进入细胞，对其造成机械性损害。具体操作为：开启水浴锅，并将温度设定至37℃，准备5ml预热的高糖dmem完全培养液，随后从
‑
80℃冰箱或液氮罐取出冻存的细胞放入水浴锅，快速摇晃冻存管1～2min，待细胞完全融化，迅速转移至高糖dmem完全培养液中，以1000rpm转速离心5min，吸弃上清液，加入1ml高糖dmem完全培养液，反复吹打为单细胞悬液后，转移至10cm细胞培养皿中，置于二氧化碳细胞培养箱中培养，培养箱温度设定为37℃，co2的体积分数设定为5％。
[0044]
1.1.4细胞冻存
[0045]
当细胞生长状态良好且细胞密度达到80％～90％时，可进行细胞冻存。细胞冻存时应注意采用梯度降温的方式缓慢逐步进行，最大限度保证细胞活力。梯度降温可以使细胞缓慢脱水，以防细胞内形成大的冰晶导致细胞机械损伤及破裂。具体操作过程如下：将配制好的细胞冻存液置于4℃冰箱预冷；弃去培养皿中原培养基，先用无菌的pbs溶液清洗细胞2遍，吸弃pbs溶液；加入含0.25％edta胰酶消化细胞1～2min，加入4ml高糖dmem完全培养液终止消化，反复吹打细胞并将其收集转移至15ml离心管，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入预冷的冻存液重悬细胞，吹打细胞成单细胞混悬液，分装于冻存管，进行标记。在4℃冰箱内放置30min，随后转移至
‑
20℃冰箱放置2h，最后转移至
‑
80℃冰箱。长期保存的细胞应及时转移至液氮罐中。
[0046]
1.1.5细胞培养与传代
[0047]
h9c2心肌细胞培养于二氧化碳细胞培养箱中，并在显微镜下观察细胞的生长状态，待细胞生长密度达到80％～90％时，进行传代培养。弃去原培养基，pbs缓冲液清洗细胞2遍，加入含0.25％edta胰酶1ml，置于37℃细胞培养箱消化1min，快速吸弃胰蛋白酶溶液，加入4ml高糖dmem完全培养液用于终止消化，用一次性吸管多次吹打培养皿底部细胞，随后按1:3的比例传代至新的培养皿，每皿加入完全培养液7ml左右，按十字摇匀法摇匀细胞，小心移入37℃，5％co2培养箱培养。
[0048]
1.2 h9c2心肌细胞肥大模型的建立
[0049]
1.2.1细胞处理与给药
[0050]
收集h9c2心肌细胞，用高糖dmem完全培养液稀释成0.6
×
105个细胞/ml的细胞稀
释液，均匀接种于48孔培养板中，每孔预先加入100μl高糖dmem完全培养液，后加入100μl细胞稀释液，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜；吸弃48孔细胞培养板中培养液，加入含1％胎牛血清的高糖dmem培养基饥饿处理18h；用含1％胎牛血清高糖dmem培养基稀释iso，按照实验设计，每孔加入不同浓度iso稀释液，置于培养箱中继续培养48h；于培养24h时更换给药液。
[0051]
1.2.2 f
‑
actin染色
[0052]
弃去48孔细胞培养板上清液，每孔加入预温的pbs缓冲液清洗细胞，每次300μl，清洗2次；快速吸弃pbs溶液，每孔加入4％多聚甲醛300μl进行固定细胞，室温静置20min；吸弃多聚甲醛后，用pbs缓冲溶液清洗细胞，每孔300μl，每次置于摇床振摇5min，共清洗3次；每孔加入100μl fitc标记的鬼笔环肽(5μg/ml)，室温下避光染色20min后，pbs缓冲液清洗细胞3次，每次置于摇床振摇5min；每孔加入100μl的dapi溶液，静置染核5min，pbs缓冲溶液清洗2次后，于每孔加入200μl pbs缓冲液，置于倒置荧光显微镜下观察，进行图像采集拍照。
[0053]
1.2.3数据处理
[0054]
实验数据采用spss 22.0软件进行统计分析，以均值
±
标准差(x
±
s)表示，采用anova分析和非参数检验进行组间分析。
[0055]
1.2.4确定iso最佳造模浓度
[0056]
不同浓度的iso(10、20、30、40、50、60、70、80、90μm)分别作用于h9c2心肌细胞，测定其对心肌细胞活力的影响。结果表明，iso给药浓度为10～40μm时，与对照组相比，无统计学差异(p>0.05)。这表明iso给药浓度在0～40μm的范围内，对h9c2心肌细胞没有产生明显的毒性作用。当iso给药浓度大于40μm时，对h9c2心肌细胞产生较为明显的细胞毒性。
[0057]
根据mtt的实验结果以及根据数据统计分析表明，iso浓度为40μm时，其诱导的h9c2心肌细胞表面积最大。因此，选取iso浓度为40μm作为最佳造模浓度，并确定造模成功。
[0058]
实验例1
‑
咖啡酸对h9c2心肌细胞活力的影响
[0059]
1.1实验方法
[0060]
1.1.1细胞处理与给药
[0061]
收集h9c2心肌细胞，用高糖dmem完全培养液分散细胞，接种于5个10cm培养皿中，置于37℃，含5％二氧化碳培养箱中培养过夜；次日，弃去原培养液，加入含1％胎牛血清的高糖dmem培养基饥饿处理细胞18h；用含1％胎牛血清高糖dmem培养基稀释咖啡酸为25μm，并设置对照组和iso组，置于37℃，含5％二氧化碳培养箱中孵育30min，除对照组外，其余组加入iso稀释液，使得各皿iso终浓度为40μm，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养48h，于细胞培养24h更换给药液。
[0062]
1.1.2 mtt染色
[0063]
待细胞培养结束后，弃去细胞培养板上清液，每孔加入100μl高糖dmem培养基，再加入5mg/ml mtt溶液10μl，置于37℃培养箱中孵育4h；弃去孔内液体，每孔加入150μldmso，置于摇床上充分振摇10min，待结晶充分溶解后，用酶标仪测定490nm下各孔的od值，并计算细胞存活率。
[0064]
1.2实验结果
[0065]
不同浓度咖啡酸(1、5、10、25、50、100和200μm)分别作用于h9c2心肌细胞，测定咖啡酸对心肌细胞活力的影响。如图1，结果显示不同浓度的咖啡酸与对照组相比较，无统计
学差异(p>0.05)。这表明200μm以下是咖啡酸作用于h9c2心肌细胞的无毒浓度范围。
[0066]
实验例2
‑
咖啡酸对iso诱导的h9c2心肌细胞表面积的影响
[0067]
2.1实验方法
[0068]
2.1.1细胞处理与给药：先于48孔板中加入100μl高糖dmem完全培养液，随后收集h9c2心肌细胞，用高糖dmem完全培养液稀释成0.6
×
105个细胞/ml的细胞稀释液，均匀接种于48孔板中，每孔加入100μl细胞稀释液，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜；弃去细胞培养板中上清液，加入含1％胎牛血清的高糖dmem培养基饥饿处理18h；用含1％胎牛血清的高糖dmem培养基分别稀释咖啡酸、隐绿原酸，使其终浓度分别为25μm。每孔加入iso稀释液200μl。置于37℃、5％co2培养箱中继续培养48h；次日更换给药液。
[0069]
2.1.2 f
‑
actin染色
[0070]
弃去48孔细胞培养板上清液，每孔加入预温的pbs缓冲液清洗细胞，每次300μl，清洗2次；快速吸弃pbs溶液，每孔加入4％多聚甲醛300μl进行固定细胞，室温静置20min；吸弃多聚甲醛后，用pbs缓冲溶液清洗细胞，每孔300μl，每次置于摇床振摇5min，共清洗3次；每孔加入100μl fitc标记的鬼笔环肽(5μg/ml)，室温下避光染色20min后，pbs缓冲液清洗细胞3次，每次置于摇床振摇5min；每孔加入100μl的dapi溶液，静置染核5min，pbs缓冲溶液清洗2次后，于每孔加入200μl pbs缓冲溶液，置于倒置荧光显微镜下观察，进行图像采集拍照。
[0071]
2.2实验结果
[0072]
将浓度为25μm的咖啡酸、隐绿原酸以及10μm的普萘洛尔分别作用于iso诱导后的h9c2心肌细胞，测得各组心肌细胞表面积见表1，部分见图2，发现其对心肌细胞表面积的增加均有一定的改善作用。咖啡酸、隐绿原酸、普萘洛尔组心肌细胞表面积相对模型组均变小，差异具有统计学差异(p<0.01)。图2中，与con.组(即对照组，也即未进行iso诱导的空白组)相比，
**
p<0.01；与iso组(即iso诱导的模型组)相比，
##
p<0.01；pro指的是普萘洛尔组，ca指的是咖啡酸组。
[0073]
表1各组对心肌细胞表面积的影响(μm2)(n＝6)
[0074]
组别心肌细胞表面积(μm2)对照组1786.09
±
211.04iso组2754.84
±
220.11
**
隐绿原酸组2111.59
±
146.03
##
咖啡酸组2105.54
±
198.58
##
普萘洛尔组2240.34
±
234.16
##
[0075]
与对照组相比，
**
p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01。
[0076]
实验例3
‑
咖啡酸对iso诱导的h9c2心肌细胞anp、bnp、hif
‑
1αmrna表达的影响
[0077]
3.1实验方法
[0078]
3.1.1细胞处理与给药：收集生长期的细胞，用高糖dmem完全培养液稀释成1.0
×
105个细胞/ml的细胞稀释液，接种于6孔培养板中，每孔加入1ml该细胞稀释液，置于二氧化碳培养箱中培养过夜；弃去原培养液，用含1％胎牛血清高糖dmem培养基饥饿处理18h，用含1％胎牛血清高糖dmem培养基分别稀释咖啡酸、隐绿原酸为25μm。每孔加入1ml药物稀释液，
每个浓度4个复孔。药物预处理0.5h后，加入iso使得终浓度为40μm，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养48h，于细胞培养24h更换给药液。
[0079]
3.1.2 rna提取
[0080]
(1)用预冷的pbs缓冲液清洗细胞2遍，每孔加入0.5ml trizol溶液，反复吹打后，收集细胞并转移至无rna酶的1.5ml ep管中，室温静置5min；
[0081]
(2)每个ep管中加入氯仿100μl(氯仿:trizol＝1:5)，涡旋振荡10s，室温放置3min后，4℃，12000rpm离心15min；样品共3层：上层为水层，中间为蛋白层，下层为有机层；
[0082]
(3)小心吸取上层溶液200μl至1.5ml ep管中，加入200μl异丙醇，上下颠倒，充分混匀管内液体，待室温静置10min后，4℃，12000rpm离心10min；
[0083]
(4)小心倒去上层液体，加入1ml depc水配制的75％乙醇，上下颠倒，使白色沉淀悬浮，充分洗涤，4℃，8000rpm离心5min，重复该操作2次；
[0084]
(5)弃去75％乙醇洗涤液，将ep管倒扣滤纸上，待液体挥干后；视具体情况，加入8～12μl depc水吹打沉淀，使rna悬浮溶解。
[0085]
3.1.3 rna浓度和纯度测定
[0086]
用depc水对紫外分光光度计进行清洗并进行校准，取1μl总rna用于测定，记录其浓度及纯度值，其中od
260
/od
280
比值代表rna纯度，当比值介于1.8～2.0之间，表明所提取的rna可用于下一步实验。
[0087]
3.1.4逆转录反应
[0088]
依据测定的浓度，以2μg总rna为模板进行逆转录反应，逆转录总体系为20μl(见表2.8)。具体操作为：在0.2ml离心管中分别加入gdna purge、总rna、2
×
plus 1st strand cdna synthesis supermix及depc水。以25℃5min、50℃15min、75℃5min的反转录条件进行反应，得到cdna样品。cdna样品可储存于
‑
20℃冰箱进行短暂保存，长期保存需放置于
‑
80℃冰箱。
[0089]
表2逆转录反应体系
[0090]
试剂体积gdna purge1μl总rna2μgcdna synthesis supermix10μldepc水至20μl
[0091]
3.1.5引物合成与配制
[0092]
经pubmed查找anp、bnp、hif
‑
1α、β
‑
actin基因的mrna序列，交由上海生工生物工程有限公司设计合成特异性引物。引物合成序列见表3以及见序列表。
[0093]
表3引物合成序列
[0094]
引物名称引物序列(5
′
to 3
′
)anp
‑
fccactgagaggtggtgaatacanp
‑
rgagaggtaaggcctcactaaacbnp
‑
fcagaagctgctggagctgataagbnp
‑
rtgtagggccttggtcctttg
hif
‑
1α
‑
fgaagttagagtcaagcccagaghif
‑
1α
‑
rctcaggtgagctttgtctagtgβ
‑
actin
‑
fccagatcatgtttgagaccttcaaβ
‑
actin
‑
rgtggtacgaccagaggcataca
[0095]
合成的引物可放置于4℃进行保存。使用前，先将其离心30～60s(12000rpm)，充分涡旋振荡，混匀。参照合成报告单加入适量的depc水，配制成浓度为10μm的引物溶液，分别分装各个基因的上游引物、下游引物于200μl ep管中。
[0096]
3.1.6 pcr反应
[0097]
根据表2.10对pcr反应体系进行配制，点样结束后离心2min后置于荧光定量pcr仪进行扩增，反应循环条件为：95℃10min，然后按照95℃20s、60℃60s的条件循环40次，最后反应的条件为95℃15s、60℃60s。实时荧光定量pcr反应结束后，根据获得的扩增曲线分析结果的可靠性，输出ct值。无酶水为depc处理水。
[0098]
表4 pcr反应体系
[0099]
试剂体积supermix plus10μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlcdna2μl无酶水7μl总体积20μl
[0100]
3.2实验结果
[0101]
本发明采用qpcr技术对其心肌肥厚标志基因anp、bnp及缺氧诱导因子hif
‑
1α基因的表达进行检测。
[0102]
3.2.1咖啡酸对iso诱导的anp mrna表达的影响
[0103]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中anp mrna表达影响的测定数据结果见表5。与对照组相比，iso组能够显著上调心肌细胞中anp mrna的表达水平，且差异具有显著性(p<0.01)，咖啡酸给药作用于h9c2心肌细胞后，与iso组相比较，anp mrna表达水平明显下降，差异具有显著性(p<0.01)。以上结果表明25μm的咖啡酸预给药处理后可以改善iso诱导的心肌细胞中anp mrna的过表达。
[0104]
表5各组对iso诱导的anp mrna表达的影响(n＝3)
[0105]
组别anp mrna相对表达量对照组1.05
±
0.31iso组1.98
±
0.21
**
咖啡酸组1.02
±
0.06
##
普萘洛尔组1.60
±
0.15
[0106]
与对照组相比，**p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01。
[0107]
3.2.2咖啡酸对iso诱导的bnp mrna表达的影响
[0108]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中bnp mrna表达影响的测定数据结果见表6。与对
照组相比，iso模型组能够显著上调h9c2心肌细胞中bnp mrna表达水平，咖啡酸给药作用于h9c2心肌细胞后，与iso组相比较，咖啡酸能够显著抑制iso诱导的心肌细胞中bnp基因的表达。咖啡酸与隐绿原酸组相比，虽降低bnp mrna的作用略优于隐绿原酸，但在统计学上，未呈现出显著性差异(p>0.05)。
[0109]
表6各组对iso诱导的bnp mrna表达的影响(n＝3)
[0110]
组别bnp mrna相对表达量对照组1.04
±
0.30iso组2.14
±
0.47
**
隐绿原酸组1.50
±
0.09
#
咖啡酸组1.12
±
0.08
##
普萘洛尔组1.45
±
0.26
#
[0111]
与对照组相比，**p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01，
#
p<0.05。
[0112]
3.2.3咖啡酸对iso诱导的hif
‑
1αmrna表达的影响
[0113]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中hif
‑
1αmrna表达影响的测定数据结果见表7。与对照组相比，iso模型组能够显著上调h9c2心肌细胞中hif
‑
1αmrna表达水平，咖啡酸给药作用于iso刺激的h9c2心肌细胞后，与iso组相比较，咖啡酸能抑制iso诱导的hif
‑
1αmrna的过表达，差异具有显著性(p<0.01)。
[0114]
表7各组对iso诱导的hif
‑
1αmrna表达的影响(n＝3)
[0115]
组别hif
‑
1αmrna相对表达量对照组1.01
±
0.14iso组2.32
±
0.10
**
咖啡酸组1.27
±
0.10
##
普萘洛尔组1.72
±
0.06
##
[0116]
与对照组相比，**p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01。
[0117]
实验例4
‑
咖啡酸对iso诱导的h9c2心肌细胞蛋白表达的影响
[0118]
4.1实验方法
[0119]
4.1.1细胞处理与给药：收集h9c2心肌细胞，用高糖dmem完全培养液分散细胞，接种于5个10cm培养皿中，置于37℃，含5％二氧化碳培养箱中培养过夜；次日，弃去原培养液，加入含1％胎牛血清的高糖dmem培养基饥饿处理细胞18h；用含1％胎牛血清高糖dmem培养基稀释咖啡酸为25μm，并设置对照组和iso组，置于37℃，含5％二氧化碳培养箱中孵育30min，除对照组外，其余各组加入iso稀释液，使得各皿iso终浓度为40μm，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养48h，于细胞培养24h更换给药液。
[0120]
4.1.2总蛋白提取
[0121]
(1)细胞培养结束后，弃去原培养基，用预冷的pbs缓冲溶液清洗3次，用1ml枪头吸尽多余的pbs溶液；
[0122]
(2)每皿加入蛋白裂解液200μl(ripa裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂的比例为100:2:1)，刮下细胞培养皿底部的蛋白，将其收集于1.5ml ep管中，置于冰上，充分裂解30min；
[0123]
(3)待裂解结束后，将1.5ml离心管置于4℃低温离心机，以12000rpm转速离心10min，吸取上清液。
[0124]
4.13bca法测定蛋白浓度
[0125]
(1)用去离子水对bsa对照品溶液进行稀释，使得bsa标准品溶液浓度为800、400、200、100、50、25μg/ml，每孔25μl，平行设置2个复孔；
[0126]
(2)取蛋白样品5μl，加入去离子水95μl进行稀释；
[0127]
(3)计算对照品和样品溶液总数量，将试剂a与试剂b按50:1的体积进行混合，制成工作液，充分振荡混匀；
[0128]
(4)蛋白样品分别取25μl，平行设置3个复孔，随后于每孔中加入200μl工作液，置于恒温箱中反应30min，温度设置为37℃。
[0129]
(5)30min后，在562nm波长下，用酶标仪测定各孔的od值，根据标准曲线计算各样品的蛋白浓度。
[0130]
4.1.4蛋白质变性
[0131]
根据测定的蛋白浓度，分别计算所需蛋白样品、5
×
loading buffer、去离子水的体积，并依次加入至ep管中，配制上样体系结束后，置于沸水中煮3～5min，待变性后的蛋白溶液冷却至室温，置于
‑
20℃进行保存。
[0132]
4.1.5电泳
[0133]
根据待测蛋白分子量，配制不同浓度的分离胶；将配制好的分离胶缓缓加入玻璃板之间至高度约为4.5cm，后将去离子水缓缓的加至分离胶上层进行水封，室温静置；待分离胶与水层有明显的分界线后(约30min)，弃掉水层并用滤纸吸净残留液体；将配制好的浓缩胶加入至分离胶的上层，垂直插入梳子；待浓缩胶凝固后(30min)，置于电泳槽中，从两块玻璃板中间缓缓加入提前配制的电泳缓冲液，垂直向上拔掉梳子，使得电泳缓冲液充满上样孔；取出蛋白样品，置于室温解冻，待完全融化后，涡旋混匀样品，离心5s，将marker溶液及蛋白样品按顺序分别加入泳道中，电压设置为80v，电泳大约30min后，样品电泳进入分离胶，即可将电压加大至100v，继续电泳1h左右。
[0134]
4.1.6电转
[0135]
提前配制1000ml电转液，并置于冰中预冷2h。转膜前用甲醇活化pvdf膜3min，同时用电转液浸泡海绵及滤纸，按海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜的顺序依次进行放置，赶尽气泡后，再依次放滤纸、海绵，赶走气泡，夹紧塑料支架；将塑料支架置于电转槽中，倒入电转液，于电转槽另一侧放入冰袋，盖好盖子，置于盛满冰的泡沫盒中。待测蛋白分子量低于120kda，用100v的电压转膜1.5h即可；当待测蛋白分子量为289kda，则以100v的电压转膜5h。
[0136]
4.1.7封闭
[0137]
转膜结束后，将pvdf膜转移至孵育盒中，用tbst溶液清洗2次，后加入新配制的5％脱脂奶粉封闭液，置于摇床上，室温封闭2h。
[0138]
4.1.8一抗孵育
[0139]
tbst溶液冲洗pvdf膜2次除去残留的脱脂奶粉，配制一抗稀释液并剪切目的蛋白条带，加入适量一抗稀释液，置于4℃冰箱孵育过夜。
[0140]
4.1.9二抗孵育
[0141]
孵育结束后，回收一抗，将pvdf膜置于tbst中，摇床上漂洗5次，每次5min；加入5％
脱脂奶粉稀释的二抗(稀释比例1:5000)，室温孵育1.5h。
[0142]
4.1.10 elc显色
[0143]
二抗孵育结束后，回收二抗，将pvdf膜置于tbst中，摇床上漂洗5次，每次5min。配制elc发光液，将发光液滴加至条带，将膜置于曝光机暗室中，待反应1min，用曝光机进行曝光显色。
[0144]
4.1.11图像分子处理及数据分析
[0145]
通过image j软件对蛋白条带进行灰度值统计，计算目的蛋白与内参蛋白的比值。
[0146]
4.1.12数据处理
[0147]
实验数据结果采用spss 22.0软件和graphpad prism 6.0软件进行统计分析和图形绘制，实验结果采用均值
±
标准差表示。采用anova分析和非参数检验进行组间分析。将3次western blot条带的对照组归为1(即将对照组进行归一化处理)，继而各组与对照组进行比较。
[0148]
4.2实验结果
[0149]
4.2.1咖啡酸对iso诱导的pi3kα蛋白表达水平的影响
[0150]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中pi3kα蛋白表达影响的测定数据结果见表8。与对照组相比，iso组中pi3kα蛋白表达水平变化不明显，无统计学差异(p>0.05)。咖啡酸作用于iso诱导的h9c2心肌细胞后，与iso组相比，亦没有显著的变化趋势(p>0.05)。
[0151]
表8各组对iso诱导的pi3kα蛋白表达水平的影响(n＝3)
[0152]
组别pi3kα/gapdh对照组1.00iso组1.01
±
0.14咖啡酸组1.10
±
0.13普萘洛尔组1.12
±
0.26
[0153]
4.2.2咖啡酸对iso诱导的p
‑
akt表达水平的影响
[0154]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中akt蛋白磷酸化表达水平影响的测定数据结果见表9。与对照组相比，iso组能够显著诱导细胞中akt蛋白的磷酸化，使其磷酸化的表达水平显著升高。与iso组相比，咖啡酸作用于h9c2心肌细胞后，其能抑制akt蛋白磷酸化的表达水平，且差异均具有显著性(p<0.05)。
[0155]
表9各组对iso诱导的p
‑
akt表达水平的影响(n＝3)
[0156]
组别p
‑
akt/akt对照组1.00iso组1.54
±
0.14
**
咖啡酸组1.08
±
0.04
##
普萘洛尔组1.05
±
0.18
##
[0157]
与对照组相比，**p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01。
[0158]
4.2.3咖啡酸对iso诱导的p
‑
mtor表达水平的影响
[0159]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中mtor蛋白磷酸化表达水平影响的测定数据结果见表10。与对照组相比，iso组能够显著诱导细胞中mtor蛋白磷酸化，使其磷酸化的表达水
平显著升高。与iso组相比较，咖啡酸作用于h9c2心肌细胞后，其能显著抑制mtor蛋白磷酸化的表达，且差异具有统计学意义(p<0.01)。
[0160]
表10各组对iso诱导的p
‑
mtor表达水平的影响(n＝3)
[0161]
组别p
‑
mtor/mtor对照组1.00iso组1.43
±
0.20
**
咖啡酸组0.98
±
0.11
##
普萘洛尔组0.99
±
0.05
##
[0162]
与对照组相比，**p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01。
[0163]
4.2.4咖啡酸对hif
‑
1α蛋白表达水平的影响
[0164]
各处理组对iso刺激的h9c2细胞中hif
‑
1α蛋白表达水平影响的测定数据结果见表11。与对照组相比，iso组能够显著升高细胞中hif
‑
1α蛋白表达水平(p<0.01)。咖啡酸作用于iso诱导的h9c2心肌细胞，与iso组相比较，hif
‑
1α蛋白的表达水平下降，且具有显著性差异(p<0.01)。
[0165]
表11各组对iso诱导hif
‑
1α蛋白表达水平的影响(n＝3)
[0166]
组别hif
‑
1α/gapdh对照组1.00iso组1.94
±
0.11
**
咖啡酸组0.85
±
0.05
##
普萘洛尔组1.15
±
0.09
##
[0167]
与对照组相比，**p<0.01；与iso组相比，
##
p<0.01。
[0168]
实验结论：
[0169]
本发明通过iso诱导h9c2心肌细胞，检测咖啡酸对心肌细胞表面积及心肌肥厚标志基因anp、bnp、缺氧诱导因子hif
‑
1α基因的表达，结果显示咖啡酸能够显著降低iso诱导的anp、bnp、hif
‑
1α基因的过表达。
[0170]
本发明基于pi3k/akt/mtor/hif
‑
1α信号通路，对通路相关蛋白的表达水平进行检测。以上实验结果表明，咖啡酸可以一定程度上抑制iso诱导的h9c2心肌细胞p
‑
akt、p
‑
mtor蛋白的磷酸化及hif
‑
1α蛋白水平的表达，表明其发挥改善心肌细胞肥大可能是通过抑制akt/mtor/hif
‑
1α信号通路的活化。咖啡酸改善心肌细胞肥大可能的作用机制见图3。
[0171]
由上述实验可知，咖啡酸具有改善心肌细胞肥大的作用，可用于制备改善心肌肥大的药物。
[0172]
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。