搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法与流程

1.本发明属于生物材料组织修复制剂领域，具体涉及一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.间充质干细胞外泌体是由间充质干细胞分泌的一类细胞外囊泡，其粒径约60
‑
150nm，通常携带蛋白质、mrna、mirna和脂质等生物活性分子，可促进组织细胞生长、分化及组织修复。因此，间充质干细胞外泌体已在组织修复领域获得广泛研究。
3.细胞外基质是由细胞分泌的多糖、蛋白、蛋白聚糖等生物大分子，组成复杂的结构网络，支持细胞生长并调节细胞的生物行为。细胞外基质已被广泛应用于组织修复领域。
4.甲基丙烯酰化凝胶(gelma)是由甲基丙烯酸酐(ma)和明胶(gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶，具有十分优异的生物相容性，可由紫外光固化并形成适于细胞生长的三维结构。
5.目前对于外泌体和生物凝胶的研究通常停留于单独的运用，缺少同时具有外泌体生物活性及生物凝胶支架结构的复合结构化修复材料。申请号为cn108642004a的专利公布了一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂，流程化了外泌体制备过程，但仅限于细胞学效果，而未进行支架搭载以实现更佳的组织修复。申请号为cn201811029396.7的专利公布了一种一种脱细胞支架溶液
‑
gelma水凝胶复合材料及制备方法，但仅限于药物混合，而未实现外泌体之类天然细胞来源的修复材料搭载，使其治疗安全性保障不足。
6.因此，需要一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶，使其同时具有间充质干细胞的组织修复活性和生物凝胶的组织支撑性。从而达到更好的组织修复效果。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法。通过提取间充质干细胞来源的外泌体并混合细胞外基质及甲基丙烯酰化凝胶，使其具有均一性和成形性，并保留间充质干细胞的生物活性。
8.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：将间充质干细胞外泌体与细胞外基质、甲基丙烯酰化凝胶混合，加入0.25％lap后，经紫外光固化。
9.作为优选，所述的间充质干细胞外泌体提取方式包括差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法。
10.作为优选，所述细胞外基质包括软骨细胞外基质、骨膜细胞外基质、肌腱细胞外基质。
11.作为优选，所述的间充质干细胞外泌体提取方式为采用差速离心 超滤法。
12.作为优选，所述细胞外基质采用软骨细胞外基质。
13.作为优选，所述细胞外基质、甲基丙烯酰化凝胶混合浓度为细胞外基质1
‑
10％，甲
基丙烯酰化凝胶8
‑
15％，单位皆为w/v。
14.作为优选，细胞外基质浓度为1
‑
3％，甲基丙烯酰化凝胶浓度为10％，单位皆为w/v。
15.搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
16.步骤一：当骨髓间充质干细胞融合度达到50
‑
60％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时；
17.步骤二：收集培养基，通过差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法中的多种进行处理；
18.步骤三：将沉淀用pbs重悬，进行外泌体蛋白定量；
19.步骤四：将骨膜、软骨或肌腱进行3次反复冻融，并使用1％triton x
‑
100洗脱24小时；
20.步骤五：将洗脱后骨膜、软骨或肌腱经1％sds洗脱24小时，并使用dnase i处理12h小时；
21.步骤六：将脱细胞后的骨膜、软骨或肌腱冻干后磨粉，并经蛋白酶消化至透亮；
22.步骤七：将骨膜、软骨或肌腱的细胞外基质、gelma、外泌体蛋白按1
‑
10％：8
‑
15％：0.1％
‑
2.0％混合，外泌体蛋白来源于间充质干细胞外泌体，实际加入为间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化，单位皆为w/v。
23.本发明的有益效果：
24.搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶通过提取间充质干细胞来源的外泌体并混合细胞外基质及甲基丙烯酰化凝胶，使其具有均一性和成形性，并保留间充质干细胞的生物活性
25.相比现有外泌体及细胞外基质来源修复材料，本发明显著的进步在于：
26.1)使用细胞外基质及甲基丙烯酰化凝胶搭载间充质干细胞外泌体，同时具有生物活性及细胞支撑性。
27.2)具有可光固化性，可采用缺损填获3d打印技术进行损伤组织的形状贴合化支架形成。
28.因此，搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶可在同时具有间充质干细胞外泌体生物活性基础上进行组织缺损定制化支架形成，更好地进行组织修复。
附图说明
29.图1间充质干细胞外泌体透射电镜表征，粒径水平为100nm级别。
30.图2间充质干细胞外泌体粒径测定，平均粒径约90nm。
31.图3间充质干细胞外泌体蛋白印迹验证，含有tsg101、cd9、cd63等外泌体蛋白marker。
32.图4间充质干细胞外泌体促进软骨细胞表达修复相关蛋白。
33.图5细胞外基质/gelma凝胶的光交联可凝性及电镜表征。
34.图6搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶对膝关节软骨缺损的micro
‑
ct验证
具体实施方式：
35.下面结合实施例对本发明提供的一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
36.本发明中的搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶的优选案例为采用差速离心 超滤法提取间充质干细胞外泌体，混合2％(w/v)软骨细胞外基质及10％(w/v)gelma并搭载0.2％(w/v)间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化。具体步骤如实施例1。
37.本发明还可以使用其他上述的外泌体制备方案、其他上述的细胞外基质、其他上述的细胞外基质、gelma及外泌体的混合比例，均可获得相同的技术效果。
38.实施例1、差速离心 超滤法制备间充质干细胞外泌体与软骨细胞外基质凝胶/gelma混合光固化凝胶
39.1、当骨髓间充质干细胞(bmsc)融合度达到50％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
40.2、收集培养基，梯度离心，200
×
g离心15min，2500
×
g离心15min。
41.3、取上清，使用0.22μm过滤器过滤上清液，以去除残留的细胞和碎片。
42.4、用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000
×
g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μl。
43.5、用磷酸盐缓冲液洗涤超滤溶液，并重复离心3次。
44.6、将洗涤后的含有外泌体的超滤液体超速离心1小时。将沉淀重悬于pbs中，并以4,000
×
g离心以将体积浓缩至约200μl，进行外泌体蛋白定量。
45.7、将软骨进行3次反复冻融，并使用1％triton x
‑
100洗脱24小时。
46.8、将洗脱后软骨经1％sds洗脱24小时，并使用dnase i处理12h小时。
47.9、将脱细胞软骨冻干后磨粉，并经蛋白酶消化至透亮。
48.10、将软骨细胞外基质、gelma、外泌体蛋白按2％：10％：0.2％(w/v)混合，外泌体蛋白来源于间充质干细胞外泌体，实际加入为间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化。
49.实施例2、密度梯度法制备间充质干细胞外泌体与骨膜细胞外基质凝胶/gelma混合光固化凝胶
50.1、当骨髓间充质干细胞(bmsc)融合度达到55％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
51.2、收集培养基，使用percoll密度梯度离心液1000
×
g，20min离心。
52.3、吸取上层交界面的外泌体层液体，加入2倍体积pbs混匀。
53.4、使用0.22μm过滤器过滤，以去除残留的细胞和碎片，用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000
×
g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μl。
54.5、用磷酸盐缓冲液洗涤，并重复离心3次。
55.6、将沉淀用200μl pbs重悬，进行外泌体蛋白定量。
56.7、将骨膜进行3次反复冻融，并使用1％triton x
‑
100洗脱24小时。
57.8、将洗脱后骨膜经1％sds洗脱24小时，并使用dnase i处理12h小时。
58.9、将脱细胞骨膜冻干后磨粉，并经蛋白酶消化至透亮。
59.10、将骨膜细胞外基质、gelma、外泌体蛋白按1％：10％：0.2％(w/v)混合，外泌体蛋白来源于间充质干细胞外泌体，实际加入为间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化。
60.实施例3、差速离心法制备间充质干细胞外泌体与肌腱细胞外基质凝胶/gelma混合光固化凝胶
61.1、当骨髓间充质干细胞(bmsc)融合度达到60％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
62.2、收集培养基，梯度离心，以300
×
g离心10分钟，取上清。
63.3、以2000
×
g离心10分钟，取上清。
64.4、10,000
×
g离心30分钟，取上清。
65.5、100,000
×
g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀pbs重悬后，再次以100,000
×
g离心90分钟。
66.6、将沉淀用200μl pbs重悬，进行外泌体蛋白定量。
67.7、将肌腱进行3次反复冻融，并使用1％triton x
‑
100洗脱24小时。
68.8、将洗脱后肌腱经1％sds洗脱24小时，并使用dnase i处理12h小时。
69.9、将脱细胞肌腱冻干后磨粉，并经蛋白酶消化至透亮。
70.10、将肌腱细胞外基质、gelma、外泌体蛋白按3％：10％：0.2％(w/v)混合，外泌体蛋白来源于间充质干细胞外泌体，实际加入为间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化。
71.实施例4、差速离心法制备间充质干细胞外泌体与肌腱细胞外基质凝胶/gelma混合光固化凝胶
72.1、当骨髓间充质干细胞(bmsc)融合度达到60％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
73.2、收集培养基，梯度离心，以300
×
g离心10分钟，取上清。
74.3、以2000
×
g离心10分钟，取上清。
75.4、10,000
×
g离心30分钟，取上清。
76.5、100,000
×
g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀pbs重悬后，再次以100,000
×
g离心90分钟。
77.6、将沉淀用200μl pbs重悬，进行外泌体蛋白定量。
78.7、将肌腱进行3次反复冻融，并使用1％triton x
‑
100洗脱24小时。
79.8、将洗脱后肌腱经1％sds洗脱24小时，并使用dnase i处理12h小时。
80.9、将脱细胞肌腱冻干后磨粉，并经蛋白酶消化至透亮。
81.10、将肌腱细胞外基质、gelma、外泌体蛋白按1％：8％：0.1％(w/v)混合，外泌体蛋白来源于间充质干细胞外泌体，实际加入为间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化。
82.实施例5、密度梯度法制备间充质干细胞外泌体与骨膜细胞外基质凝胶/gelma混合光固化凝胶
83.1、当骨髓间充质干细胞(bmsc)融合度达到55％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
84.2、收集培养基，使用percoll密度梯度离心液1000
×
g，20min离心。
85.3、吸取上层交界面的外泌体层液体，加入2倍体积pbs混匀。
86.4、使用0.22μm过滤器过滤，以去除残留的细胞和碎片，用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000
×
g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μl。
87.5、用磷酸盐缓冲液洗涤，并重复离心3次。
88.6、将沉淀用200μl pbs重悬，进行外泌体蛋白定量。
89.7、将骨膜进行3次反复冻融，并使用1％triton x
‑
100洗脱24小时。
90.8、将洗脱后骨膜经1％sds洗脱24小时，并使用dnase i处理12h小时。
91.9、将脱细胞骨膜冻干后磨粉，并经蛋白酶消化至透亮。
92.10、将骨膜细胞外基质、gelma、外泌体蛋白按10％：15％：2％(w/v)混合，外泌体蛋白来源于间充质干细胞外泌体，实际加入为间充质干细胞外泌体，加入0.25％lap后经405nm紫外光固化。
93.实施例1中间充质干细胞外泌体透射电镜表征
94.1、将提取的间充质干细胞外泌体进行浓缩，并进行透射电镜制样。
95.2、拍摄间充质干细胞外泌体透射电镜图，可见呈经典的碗状，粒径水平约100nm，如图1。
96.实施例1中间充质干细胞外泌体粒径测定
97.1、将提取的间充质干细胞外泌体稀释至合适浓度，使用马尔文粒径电位测定仪测定粒径。
98.2、测得间充质干细胞外泌体粒径分布相对较宽，平均粒径约90nm，如图2。
99.实施例1中间充质干细胞外泌体蛋白印迹验证
100.1、使用lysis buffer裂解间充质干细胞外泌体，并进行wb蛋白印迹实验。
101.2、根据相应蛋白分子量裁取条带，分别孵育一抗、二抗。
102.3、化学发光曝光后可见含有tsg101、cd9、cd63等外泌体蛋白marker，如图3.
103.实施例1中间充质干细胞外泌体促进软骨细胞表达修复相关蛋白
104.1、将软骨细胞分别设置正常组(control)、炎症组(il1β)、治疗组(il1β exosomes)，分别加入pbs、il1β及il1β exosomes。
105.2、分别使用mmp13、col ii、adamts
‑
5、aggrecan抗体进行细胞蛋白标记并使用荧光二抗示踪。
106.3、荧光显微镜下可见治疗组相对于炎症组而言，mmp13、adamts
‑
5炎症相关蛋白显著下降，col ii、aggrecan修复相关蛋白显著上升。如图4.
107.实施例1中细胞外基质/gelma凝胶的光交联可凝性及电镜表征
108.1、使用10％gelma及分别与1％、2％、3％细胞外基质分别混合后光交联，发现均能成胶凝固，倒置后不脱离离心管底部。
109.2、对4种凝胶进行固定、切片，并经锇酸制样后置于扫描电镜下观察，发现均具有固定支架样结构，且孔径较为均一稳定。如图5.
110.实施例1中搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶对膝关节软骨缺损的micro
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ct验证
111.1、将关节缺损模型兔分为四组，分别为不治疗组、gelma治疗组、ecm/gelma治疗
组、ecm/gelma exosomes治疗组。分别于关节缺损处填充相应凝胶。
112.2、治疗后6周及12周可发现ecm/gelma exosomes治疗组效果显著优于不治疗组、gelma治疗组、ecm/gelma治疗组，关节面软骨质缺失不明显且关节面较为光滑。如图6.
113.对实施例2、3所得的搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶分别进行外泌体透射电镜、粒径、蛋白印迹、促进软骨细胞表达修复相关蛋白、光交联可凝性及电镜表征、对膝关节软骨缺损的micro
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ct验证，与实施例1中差速离心 超滤法制备间充质干细胞外泌体与软骨细胞外基质凝胶/gelma混合光固化凝胶结果相似，这表明可通过上述其他外泌体制备方案、其他上述的细胞外基质、其他上述的细胞外基质、gelma及外泌体的混合比例，实现效果类似的搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶的制备。
114.由上述实施例可知，本发明提供的搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法，在同时具有间充质干细胞外泌体生物活性基础上进行组织缺损定制化支架形成，更好地进行组织修复。
115.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本技术领域的技术人员来应当理解，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，不偏离本发明权利要求书所限定的范围。