Ketoconazole在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途的制作方法

ketoconazole在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途
技术领域
1.本发明属医药技术领域，涉及咪唑类抗真菌药ketoconazole的一种新的药用用途，具体涉及ketoconazole在用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途。


背景技术：

2.现有技术公开了非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease,nafld)是指除外酒精和其他明确的肝损害原因所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪性肝病 (non-alcoholic fatty liver，nafl)、脂肪肝炎((non-alcoholicsteatohepatitis，nash)、脂肪性肝纤维化和肝硬化四大阶段类型。其中脂肪性肝炎是指在肝细胞脂肪变性基础上发生的肝细胞炎症，属于慢性炎症性肝病阶段。调查显示，nafld已成为我国第一大慢性肝病和健康查体肝酶异常的首要原因，目前临床经验甚至是治疗指南上除了建议改变饮食和生活方式外，尚无明确有效的治疗手段，尤其是针对进展到nash及其之后的阶段。研究显示，nash导致肝硬化和死亡的比例高于nafl，因此nash的健康影响更加不容小觑，与诊疗相关的基础研究和临床策略已引起本领域研究人员的关注。
3.nash的一个关键特征是激活肝内常驻的免疫细胞，研究显示，t细胞在肝脏组织损伤修复的过程中促进了慢性炎症的迁延不愈。有报道，与代谢因素相关的 th17细胞释放过量的il-17a，引起nash甚至原发性肝癌。由此可见，nash的免疫细胞募集和激活可进一步加剧脂代谢紊乱和肝脏损伤，但其分子机制仍未见有充分阐明。另外，在nafld进展中，肝脏脂肪变性与胆固醇合成增加以及吸收减少有关。还有报道，nash中氧化型胆固醇desmosterol存在累积，并且可通过控制自身在细胞内的合成、摄取和流出的平衡，影响th17细胞的转录因子 rorrt的表达继而影响细胞本身的分化和激活。上述研究提示了desmosterol可作用于th17细胞，从而在nash进展中发挥关键作用，值得进一步在临床上探索和应用。
4.ketoconazole是一种咪唑类抗真菌药，临床实践中用于预防和治疗多种真菌感染。
5.基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供咪唑类抗真菌药ketoconazole 新的药用用途，具体涉及ketoconazole用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途。


技术实现要素：

6.本发明的目的是基于现有技术的现状，针对临床治疗实践中的不足，提供一种治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，具体涉及咪唑类抗真菌药ketoconazole的一种新的药用用途，尤其涉及ketoconazole在用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途。
7.本发明还提供了一种简便的用于研究nash治疗的灌胃动物模型的药物 ketoconazole的使用方法。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
9.本发明采用ketoconazole通过nash小鼠模型试验，ketoconazole灌胃：溶剂为
dmso，20mg/kg/只，每隔一天,以小鼠灌胃针经食管灌胃，持续4周；结果显示，所述ketoconazole作为desmosterol抑制剂，能够明显减轻nash 小鼠肝脏中的脂肪堆积和炎症细胞浸润，从而起到逆转和治疗nash的作用。
10.本发明所使用的动物模型为基于spf级c56bl/6的6-8周龄小鼠，其体重为 20-25g左右，饲养环境为ivc级动物培养室，温度在20～26℃，相对湿度40～ 70％，噪音60分贝以下，氨浓度14/(mg/m3)以下.通风换气大于等于15次/ 小时，光照循环条件是是12小时明/12小时暗。
11.本发明中，由于肝脏脂肪堆积和炎症浸润会导致营养吸收的障碍和免疫力的下降，因此，造模小鼠应该保持环境清洁，应勤换垫料，以免发生感染死亡，影响造模成功率；本发明中，造模小鼠垫料更换周期为：每周2次。
12.本发明中，nash小鼠模型造模中：小鼠的所投食物为灭菌的符合国家标准 gb 14924.3-2001的啮齿类动物标准饲料作为对照饲料，d09100301的高脂高胆固醇高果糖饲料作为实验饲料；饲料投放无时间限制，自由给食，持续24周；该模型方法可造成小鼠非酒精性脂肪性肝炎，造模过程中需要密切观察小鼠的活动情况、体重、进食和粪便等情况。
13.本发明提供了一种治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，尤其涉及ketoconazole 在用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途；所述ketoconazole可通过代谢免疫治疗方向治疗非酒精性脂肪性肝炎。
14.本发明优点在于：
15.1，提供了一种治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，尤其是ketoconazole可用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，所述ketoconazole可以有效缓解非酒精性脂肪性肝炎。
16.2、提供了一个新的治疗非酒精性脂肪性肝炎的方向，即代谢免疫治疗方向。
17.3、提供了一种简便的用于研究nash治疗的灌胃动物模型的药物 ketoconazole的使用方法。
附图说明
18.图1，显示了三组试验动物的全肝脏肝重。
19.图2，显示了试验动物的肝脏大体。
20.图3，是th17细胞浸润流式统计图。
21.图4，是肝脏组织油红染色。
22.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
具体实施方式
23.实施例1
24.实验方法：
25.(一)试剂
26.ketoconazole购自selleck公司(货号：s1353)，使用dmso溶解，ketoconazole在使用前需要新鲜配置；pecy7 anti-mouse cd4(invitrogen，25-0041-28),apc anti-mouse il-17a(invitrogen，17-7177-81)；
27.(二)动物实验
28.spf级c57bl/6小鼠，6-8周龄(体重22g左右)，雄性，购自江苏集萃药康生物科技有限责任公司，许可证号：scxk(苏)2018-0008；小鼠饲养和动物实验在复旦大学实验动物科学部进行，其实验动物使用许可证号： syxk(沪)2014-0029；
29.动物入驻动物房后，先剪趾编号和称首次体重，并记录数据；待实验动物适应动物房环境一周后，随机分为三组，分别为对照组 dmso组：nash组 dmso组； nash组 ketoconazole组；nash模型造模24周后，ketoconazole灌胃，dmso 配制，20mg/kg，每隔一天灌胃，持续4周；
30.实验期间，每天观察小鼠的大体情况如，活动情况、精神状态等，每两周称量并记录体重。
31.(三)动物肝脏组织样本的收集及肝脏免疫细胞分离
32.常规处死小鼠，打开胸腹腔，摘除胆囊，于右心房用注射器针头戳孔，左心室扎入输液针固定，连接装满pbs的20ml注射器，匀速推净pbs至肝脏泛白；摘取肝脏放置于加有pbs的六孔板中，用pbs再洗涤2次；全肝脏称重及大体观拍照，记录数据；留存部分肝组织，投入4％的多聚甲醛，4度过夜备用；
33.向六孔板中剩余的肝组织加入新的pbs，将肝脏置于40um过滤器中用针管外粗端充分研磨后，转移至15ml离心管，加入pbs至15ml，1000g，4℃，7min，离心，弃上清，沉淀重悬于4ml 40％percol,轻吹混匀，40um过滤器再次过滤后贴紧管内壁缓缓将细胞悬液加到预先准备好的铺有70％percol的15ml离心管上层，此时可见分离液交界分层，750g,15℃，升降速调为0，22min离心，取出离心管，吸取分离液交界处形成的一条白色的带，此即为淋巴细胞，先将上层细胞碎片去除，勿使中间层扰动，然后吸取中间层细胞至新15ml管，加满pbs，上下混匀，1100g，4℃，升降速调回9，7min离心。
34.(四)流式分析
35.按照1：200比例，用pecy7 anti-mouse cd4对细胞先进行表面染色，室温避光孵育15min,；pbs洗一遍，再用apc anti-mouse il-17a对细胞进行胞内染色，4℃避光过夜，次日，上机进行流式分析。
36.(五)he染色和组织病理学评分
37.将4％多聚甲醛固定4度固定24h的肝脏样本送检，进行后续的包埋、固定和he染色；(本发明中肝脏样本送检武汉塞维尔生物科技有限公司)，对肝脏组织病理进行非酒精性脂肪性肝病nas评分。
38.表1是对肝脏组织病理进行非酒精性脂肪性肝病nas评分标准。
39.表1
[0040][0041]
实验结果采用三次独立实验的平均值和标准差表示，采用t检验比较差异， p<0.05认为有统计学差异。统计采用spss20.0软件。