一种山羊ACE2的基因克隆和鼠抗羊多克隆抗体的制备的制作方法

一种山羊ace2的基因克隆和鼠抗羊多克隆抗体的制备
技术领域
1.本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种山羊的新基因ace2(angiotensin converting enzyme 2)的克隆，蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体的制备。


背景技术：

2.血管紧张素转换酶2(ace2)是2000年发现的ace同系物中的一员，是肾素-血管紧张素系统的一个重要调节因子。属于i型跨膜糖蛋白，一种含锌离子的单羧基肽糖蛋白酶。广泛存在于动物的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸以及肠道等主要器官中。ace2将血管紧张素ii(angii)降解为具有舒张血管及抗增殖作用血管紧张素(1-7)[ang(1-7)]，也可将血管紧张素i(angi)降解为ang(1-9)。ang(1-7)通过其受体mas(masr)发挥抗氧化、抗纤维化、抗炎等作用，引起了科研工作者的广泛关注。
[0003]
目前ace2的研究集中在以下三个方面：ace2作为ras系统的负调节分子，通过靶向降解angii，发挥抗损伤、抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(sars-cov)主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；ace2协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良、肠道微生态平衡和胃肠道炎症发挥重要作用。
[0004]
人、小鼠、大鼠、猫、猪以及斑马鱼等多种哺乳动物及水生动物的ace2基因鉴定并证实。但在家畜中，ace2基因鲜有报道，尤其是山羊的ace2基因还未曾被注释。
[0005]
在本发明研究中，根据ncbi公布的预测的牛ace2序列，首次通过pcr扩增得到了山羊的ace2基因，利用原核表达系统表达了pet28a-ace2重组蛋白，通过纯化pet28a-ace2重组蛋白制备鼠抗ace2血清多抗。本发明研究填补了genbank上缺乏山羊ace2全长序列的资料空白，为ace2在家畜方面的研究提供了基础资料。
[0006]
有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是根据ace2作为ras系统的负调节分子，通过靶向降解angii，发挥抗损伤、抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(sars-cov)主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良、肠道微生态平衡和胃肠道炎症所发挥的关键作用，以及到目前为止山羊的ace2基因还尚未被注释，克隆得到山羊ace2基因全长，不仅填补了genebank上缺乏山羊ace2全长序列的资料空白，而且通过原核表达ace2蛋白并制备相应的多克隆抗体，还可以为ace2在家畜方面的研究提供基础资料。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
[0009]
一种山羊的ace2蛋白，其氨基酸序列如ahi85757.1所示。
[0010]
一种编码上述山羊的ace2蛋白的基因，所述基因编码如ahi85757.1所示的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如ahi85757.1所示。
[0011]
一种山羊的ace2的连接载体或表达载体，所述连接载体或表达载体含有如
ahi85757.1所示的核苷酸序列。
[0012]
一种山羊的ace2克隆载体或表达载体的制备方法，其包括以下步骤：
[0013]
s1、选取山羊肾脏组织，经生理盐水漂洗后迅速放入液氮速冻。提取组织rna，使用随机引物将rna反转录为cdna。提取组织rna，使用随机引物将rna反转录为cdna。设计ace2的上下游引物用于ace2全长基因扩增，并在ace2基因片段两侧分别加入bamhi和hindiii两个酶切位点，以cdna为模板，扩增获得ace2基因全长，扩增条件为：95℃、3min；95℃、10s；59℃、30s；72℃、1min30s；35个循环；72℃、10min。
[0014]
s2、切胶纯化目的片段，取0.5ul pmd19-t载体，4.5ul纯化产物，5ulsolutioni于200ulep管中，混匀后在pcr仪器上运行16℃，过夜进行连接。经菌液pcr、酶切、测序验证获得质粒pmd19t-ace2。
[0015]
如上所述的制备方法，优选地，还包括分别用bamhi和hindiii酶切pet28a-ace2和pet32a-ace2质粒，切胶回收目的片段，用t4连接酶将pet28a-ace2和pet32a-ace2载体回收产物和pmd-19t-ace2重组质粒回收产物进行连接，连接体系(10ul)；1ul pet32a/pet28a载体，7ul目的序列，1ult4连接酶，1ul10
×
buffer于200ulep管中，混匀后在pcr仪器上运行16℃，进行过夜连接，经菌液pcr、酶切、测序验证获得质粒pet28a-ace2和pet32a-ace2。
[0016]
一种山羊的ace2蛋白的制备方法，将上述山羊的ace2原核表达载体，转入dh5α、bl21感受态细胞中，经iptg诱导表达后，分别获得pet28a-ace2和pet32a-ace2重组蛋白。
[0017]
如上所述的制备方法，质粒pet28a-ace2和pet32a-ace2转入dh5α、bl21感受态细胞后，诱导表达pet28a-ace2和pet32a-ace2蛋白以包涵体的形式存在，纯化步骤：配制10％分离胶，5％浓缩胶，不插梳子，待胶凝固后加入500ul的经上样缓冲液处理过的包涵体提取液，另按常规方法配胶，加入标准分子量蛋白做参考，按常规方法进行sds-page。
[0018]
电泳毕，将卸下的胶放入一干净大平皿中，在摇床上进行0.25mol/lkcl染色10min，染色完后，用手术刀片切下染成银白色的目的条带，用蒸馏水洗5次后，将胶移入干净的小袋中，加入500ulpbs震荡混匀，-20℃反复冻融3次，12000r/min，离心3min取上清sds-page电泳、western blot检测纯化效果。
[0019]
一种山羊的ace2蛋白多克隆抗体的制备，其包括如下步骤：将获得的山羊pet28a-ace2重组蛋白免疫wistar大鼠，接种方式为颈背部皮下多点注射，首免使用弗氏完全佐剂，分别于第二周进行一免，二免、三免和四免使用弗氏不完全佐剂，于加强免疫后三天取大鼠血清。
[0020]
本发明的有益效果在于：
[0021]
本发明是首次扩增到了山羊的ace2基因，不仅填补了genbank上缺乏山羊ace2全长序列的资料空白，而且为ace2在家畜方面的研究提供了基础资料。
[0022]
本发明中采用了大肠杆菌原核表达系统，构建了pet28a-ace2和pet32a-ace2质粒载体，并进行了蛋白的表达和纯化，不仅能够制备效价较高的多克隆抗体，而且还为之后ace2相关功能的研究奠定了基础。
[0023]
本发明中扩增得到的ace2基因，目前ace2的功能研究只要集中在以下三个方面：ace2作为ras系统的负调节分子，通过靶向降解angii，发挥抗损伤、抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒2(sars-cov-2)主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；ace2协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良、肠道微生态平衡和胃肠道炎
症发挥重要作用。ace2可能为山羊肾脏疾病治疗提供新的思路，为畜牧业的可持续发展奠定基础。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1为本发明实例中利用rt-pcr方法扩增ace2基因鉴定结果(2954bp)；其中，m：dnamaker；泳道1：从山羊肾脏组织通过rt-pcr扩增得到ace2片段；
[0026]
图2a为阳性菌液pcr扩增ace2基因产物结果图；其中，m：dna maker，注：泳道1-7：单克隆菌落pmd-19t-ace2；
[0027]
图2b为pet-28a-ace2重组质粒双酶切鉴定结果图；其中，m：dna maker；泳道1-7：pet-28a-ace2酶切产物；
[0028]
图3a为pet28a质粒双酶切结果图，其中，m：dl5000；泳道1-7：pet28a酶切条带；
[0029]
图3b为pet32a质粒双酶切结果图，其中，m：dl10000；泳道1-8：pet32a酶切条带；
[0030]
图4为pet32a-ace2重组质粒双酶切结果图，其中，m：dl5000；泳道1-10：pet-32a-ace2酶切产物；
[0031]
图5a为pet28a-ace2转化后单克隆菌落结果图；
[0032]
图5b为pet32a-ace2转化后单克隆菌落结果图；
[0033]
图6a为pet28a-ace2重组质粒蛋白表达sds-page电泳结果图，其中，泳道1：空载体pet28a菌体沉淀对照；泳道2：pet28a-ace2菌体沉淀；泳道3：蛋白marker；泳道4：空载体pet28a菌体上清对照；泳道5：pet28a-ace2菌体上清；
[0034]
图6b为pet32a-ace2重组质粒蛋白表达sds-page电泳结果图，其中，泳道1：蛋白marker；泳道2：空载体pet32a菌体沉淀对照；泳道3：pet32a-ace2菌体沉淀；泳道4：空载体pet32a菌体上清对照；泳道5：pet32a-ace2菌体上清；
[0035]
图7a为重组质粒pet28a-ace2表达的蛋白结果图；
[0036]
图7b为kcl切胶纯化pet28a-ace2包涵体蛋白的wb验证结果图，其中，泳道1：变性后蛋白上清；泳道2、3：上样后变性蛋白残留液；泳道4、5：ph4.0洗脱液；泳道6、7：binding buffer洗脱液；泳道8-10：ph6.0洗脱液；泳道11-13：ph5.3洗脱液；
[0037]
图8 pet28a-ace2方阵滴定结果图；
[0038]
图9为鼠抗ace2蛋白多克隆抗体western blot验证结果图；
[0039]
图10为鼠抗ace2蛋白多克隆抗体免疫组化验证结果图；
具体实施方式
[0040]
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0041]
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相
同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0042]
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
[0043]
实施例1 ace2基因的扩增，以及连接载体的构建
[0044]
根据genbank中的牛ace2基因序列(nm_001024502)设计引物，上下游引物分别插入bamhi和hindiii酶切位点由南京擎科生物科技有限公司合成引物。将rna反转录成cdna，以cdna为模板进行pcr扩增，反应体系：cdna模板2ul，反应条件：95℃、3min；95℃、10s；59℃、30s；72℃、1min30s；35个循环；72℃、10min。pcr扩增结果如图1，有单一条带出现(见泳道1)，条带大小3000bp左右，与预期(2954bp)大小一致。
[0045]
利用dna胶回收试剂盒纯化回收pcr产物，具体步骤参照dna胶回收试剂盒试剂盒说明书进行。回收产物和pmd19t载体进行连接(16℃，过夜)，将连接产物转化至感受态细胞dh5α中。将菌体重悬涂布在lb/amp/x-gal/iptg培养基平板上，37℃培养16h。挑取培养皿上的单克隆接种于含有氨苄的液体培养基中，培养过夜。利用质粒小型提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用hindiii单酶切及bamhi、hindiii双酶切(37℃，14h)进行验证，将鉴定的阳性质粒送上海英俊生物技术有限公司测序。菌落pcr验证结果如图2a，2000-3000bp之间出现单一条带(泳道1-7)。pcr鉴定插入载体的片段大小与pcr扩增片段一致。提示阳性菌落中目的片段插入成功。酶切验证结果如图2b和图4所示：pet28a-ace2双酶切2、3号菌落重组质粒，在5kb和2kb处出现了特异性的条带，与载体pet28a和插入的目的基因ace2大小相一致，说明2、3号菌落验证成功；酶切pet32a-ace2重组质粒，阳性菌落(1、2、3、4、5、6、7、9、10号菌落)在6kb和2kb处出现了特异性的条带，也就是载体pet32a和插入的目的基因ace2，大小与载体和目的片段大小一致，说明目的基因插入成功，此结果证实已成功构建pmd-19t-ace2重组载体。
[0046]
引物序列如下：
[0047]
ace2-f(seq id no.3)：gatgggatcttggcgtac
[0048]
ace2-r(seq id no.4)：gactggggagaatcactgg
[0049]
实施例2蛋白的表达实验
[0050]
利用hindiii/bamhi双酶切经测序鉴定正确的pmd19t-ace2重组质粒和pet32a原核表达载体，pet28a质粒双酶切结果图如图3a，pet28a质粒经bamhi、hindiii双酶切进行验证，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，发现在5kb和2kb处出现了特异性的条带，证明酶切成功。pet32a-ace2重组质粒双酶切结果如图4，pet32a-ace2重组质粒bamhi、hindiii双酶切可见6kb和2kb处出现了特异性的条带，也就是载体pet32a和插入的目的基因ace2，大小与载体和目的片段大小一致，证明酶切成功。
[0051]
回收ace2基因片段连接到pet28a和pet32a原核表达载体，连接产物转化dh5α感受态细胞，dh5α感受态细胞的单克隆菌落结果如图5a和图5b，白斑表明重组质粒成功转入，形成了单克隆菌落。经菌液pcr及hindiii/bamhi双酶切鉴定得到阳性重组表达载体pet28a-ace2和pet32a-ace2，ace2基因菌液pcr扩增产物结果如图1，泳道2出现单一条带，条带大小与预期(2954bp)一致。pet28a-ace2重组双酶切鉴定结果如图2b，在5kb和2kb处出现了特异性的条带，与载体pet28a和插入的目的基因ace2大小相一致。pet32a-ace2重组双酶切鉴定结果如图4，在6kb和2kb处出现了特异性的条带，也就是载体pet32a和插入的目的基因ace2，大小与载体和目的片段大小一致，说明目的基因插入成功，此结果证实已成功构建
pet28a-ace2和pet32a-ace2重组载体。将质粒送上海英俊生物技术有限公司测序。
[0052]
将测序鉴定正确的pet28a-ace2重组质粒转化bl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落，挑取白色菌落接种于20mllb培养基，37℃震荡培养至od600为0.6-0.8，取1ml菌液作为诱导前对照，取1ml剩余菌液分别加入20mg/mliptg至终浓度为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125mmol/l。在28℃诱导6h后收集1ml菌液，8000rpm/min离心15min，收集菌液沉淀，100ulpbs重悬沉淀，经sds-page电泳确定iptg最佳诱导浓度；挑取白色菌落至加有20mllb培养基，37℃震荡培养至od600为0.6-0.8，取1ml菌液作为诱导前对照，取1ml剩余菌液分别加入20mg/mliptg至终浓度为1mmol/l。在28℃诱导2、4、6、8、10h后收集1ml菌液，8000rpm/min离心15min，收集菌液沉淀，100ulpbs重悬沉淀，经sds-page电泳确定iptg最佳诱导时间。pet28a-ace2和pet32a-ace2重组蛋白诱导条件的优化结果如图6a和图6b，iptg确实可以诱导目的蛋白的表达，在iptg终浓度为0.5、1、2、4mmol/l，目的蛋白表达量较高，因此，筛选的iptg诱导浓度为1mmol/l。随着诱导时间的增加，重组蛋白表达量增加，但到诱导8h后，再增加诱导时间后，重组蛋白表达量没有显著增加，因此确定诱导时间为10h。
[0053]
选取表达量高的iptg诱导浓度及时间，进行pet32a-ace2重组蛋白大量诱导表达，在28℃诱导10h后收集菌液，8000rpm/min离心15min，收集菌液沉淀，pbs洗涤2次后，利用超声波裂解菌体，超声波裂解5s，间隔10s，sds-page分析，鉴定目的蛋白的表达形式。pet28a-ace2重组蛋白表达形式的鉴定结果如图6a可知，与空白载体pet28a相比(泳道1、4)，样品pet28a-ace2菌体沉淀(泳道2)在相对分子质量约90kda处有一条特异性表达带，而在pet28a-ace2菌体上清中(泳道5)没有出现明显的条带。说明重组质粒成功的表达ace2胞外区19-738aa之间的蛋白，蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体沉淀中。pet32a-ace2重组蛋白表达形式的鉴定结果如图6b可知，与对照组空载体的菌体沉淀(泳道2)和上清(泳道4)相比，重组质粒pet32a-ace 2菌体沉淀(泳道3)中在100kda处有一条特异性表达带，而上清(泳道5)中并没有特异性的条带。说明pet32a-ace 2成功的表达ace2蛋白19-738aa蛋白，主要以包涵体的形式存在。
[0054]
实施例3蛋白纯化实验
[0055]
配制10％分离胶，5％浓缩胶，不插梳子，待胶凝固后加入500ul的经上样缓冲液处理过的包涵体提取液，另按常规方法配胶，加入标准分子量蛋白做参考，按常规方法进行sds-page。
[0056]
电泳毕，将卸下的胶放入一干净大平皿中，在摇床上进行0.25mol/lkcl染色10min，染色完后，用手术刀片切下染成银白色的目的条带，用蒸馏水洗5次后，将胶移入干净的小袋中，加入500ulpbs震荡混匀，-20℃反复冻融3次，12000r/min，离心3min取上清sds-page电泳、westernblot检验纯度。ace2重组蛋白的westernblot鉴定具体操作：将纯化的ace2重组蛋白和pet32a载体诱导表达菌经sds-page电泳后，采用湿转法将凝胶上的相应条带转印至pvdf膜上，转印条件为恒流100v，90min。1∶3000稀释的ace2一抗，1∶5000稀释的辣根酶标记的山羊抗兔igg。切胶纯化重组蛋白鉴定结果如图7a和图7b，通过ni柱的离子吸附和交换作用纯化ace2蛋白，由图中泳道4、5可以看出，ni结合部分ace2蛋白经过ph4.0洗脱液洗脱，蛋白条带较为单一。
[0057]
实施例4 ace2多克隆抗体的制备
[0058]
1、wistar大鼠的免疫。
[0059]
10只spf级wistar雄性大鼠(5周龄)购自扬州大学实验动物中心(实验动物许可证：scxk(苏)201404739)，饲养于逸夫楼实验动物中心屏障环境动物房(使用许可证：syxk(苏)201404739)。大鼠，随机分为对照组5只和实验组5只，分别称重后，断尾采血(作阴性对照)，然后按如下程序进行免疫。
[0060]
首次免疫：将纯化好的重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1∶1(v/v)的体积比混匀，乳化制成油乳剂，对大鼠进行皮下多点注射，剂量为0.8ml/只。阴性对照组，以同样剂量的弗氏完全佐剂作为对照。同时取健康雄性大鼠少量免疫前血清作为空白对照。二免、三免和四免使用弗氏不完全佐剂，免疫周期为28天，共免疫4次。4次免疫后的第7天，大鼠眼眶采血，收集血液置于37℃灭活2h后，4℃过夜使其凝结释放血清，将凝结好的血液10000r/min，10min；收集上清，即为血清。
[0061]
2、elisa测定血清效价
[0062]
使用间接elisa方法测定血清效价。方阵滴定结果显示如图8。由图8看出，当血清的稀释倍数介于1∶150-1∶200之间时，抗原的最佳稀释浓度为0.6μg/ml时，阳性血清od值接近1.0，阳性od450值比阴性od450值(p/n值)最大。因此，选择最佳包被浓度为0.6μg/ml，最佳血清稀释度为1∶200。
[0063]
实施例5多克隆抗体的鉴定
[0064]
1、纯化的重组蛋白western blot鉴定
[0065]
将纯化的ace2重组蛋白蛋白经sds-page凝胶电泳后电转至pvdf膜上，转印条件为恒流100v，90min。用5％脱脂乳室温封闭2h，用pbst洗涤3次；使用大鼠阳性(1∶5000)，阴性(1∶5000)和ace2单抗(1∶3000)作为一抗，室温孵育2h，pbst洗涤三次，每次10min；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠igg作为二抗(1∶5000)，常温孵育1h，pbst洗涤三次，每次10min，最后用ecl发光液曝光。
[0066]
结果如图9所示，表明，免疫大鼠的阳性血清作为一抗检测pet28a-ace2重组质粒表达蛋白，反向检测出了ace2阳性蛋白表达条带，且条带单一，说明制备的抗体具有抗性和良好的特异性。
[0067]
2、免疫组化验证多克隆抗体
[0068]
采用abc法，将石蜡切片取出，室温放置30min；三蒸水洗5min/次，共2次。用3％h2o2，在37℃下，孵育15min；三蒸水洗3次，每次2min。5％bsa封闭，37℃湿盒内孵育30min。后取制备的鼠抗ace2抗体，1∶200稀释，4℃湿盒内孵育过夜，同时用阴性血清做对照。取出孵育好切片，pbs洗3次，每次5min。加兔抗鼠二抗37℃湿盒内孵育1h；pbs洗3次，每次5min。再加入sabc，37℃湿盒内孵育，20min；pbs洗4次，每次5min。最后，加入dab显色，显微镜下控制显色时间，避光显色3-5min，ddh2o终止显色。苏木精复染1-5s，蒸馏水洗3次，每次5min；75％乙醇，2min；85％乙醇，2min；95％乙醇，2min；100％乙醇，2min；100％乙醇，2min；二甲苯i，7min；二甲苯ii，7min；封片，干燥，拍照。确定ace2在山羊胃肠道的定位情况。
[0069]
结果如图10所示，阳性ace2在组织中显棕色，ace2蛋白在山羊胃及肠道组织中均有阳性表达，与本组在山羊中mrna上的结果一致。该结果也进一步证实了本实验所制备的鼠抗山羊ace2多克隆抗体具有良好的特异性。
[0070]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。