一种检测九种病原体的试剂盒、用途及使用方法与流程

1.本发明属于基因检测领域，涉及一种检测九种病原体的试剂盒、用途及这种试剂盒的使用方法。


背景技术：

2.呼吸道感染在临床上极为常见，但由于引起呼吸道感染的病原体种类多种多样，特别是如何快速区分出是病毒感染还是细菌感染，快速准确对病原体进行鉴定对于临床诊疗以及防止药物滥用具有重要意义。传统的细菌培养分离鉴定方法是目前常规的细菌分离鉴定的检测方法，是基于细菌生长形态学以及细菌所特有的酶对营养基质分解能力的不同，利用其代谢产物核酸、产气等生化特性进行鉴定的一种方法，是细菌分离的金标准，但该方法需要培养分离，耗时长，一般需要24-48小时；鉴定生化试验繁杂，对于培养条件苛刻的细菌不但所需时间更长而且检出率低；细菌自动化鉴定系统虽然简化了手工操作，但仪器中数据库还不完善，模式军中数量有限，对于结果有疑问的仍然需要手工鉴定；细菌血清学抗体的检测是一种快速检测方法，但不同的抗体产生的时间是不同的；。基于taqman探针的荧光定量pcr技术能够特异性对病原体核酸分子进行大量扩增，同时利用荧光信号的积累实现阴阳性结果判读，相比于以上方法，分子诊断灵敏度极高，能够基于不同病原体基因序列的差异性实现病原体种类鉴定以及亚型区分，在疾病的诊疗中具有明显优势。
3.目前，很多检测呼吸道细菌的pcr试剂盒都是单重的，多重的检测很多流行性的细菌比较少，因此如何让加入的引物不互相干扰、检测灵敏度、检测速度快也不低于单项pcr检测灵敏度并且避免假阴性成为一大技术难点，因此，开发一种检测速度快、灵敏度高、特异性好并且能够避免假阴性的检测呼吸道病原体的pcr试剂盒具有明显的临床意义以及潜在应用价值。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、特异性好以及能够避免假阴性的检测九种病原体的试剂盒。
5.本发明提供了一种检测九种病原体试剂盒，所述九种病原体为以下九种，肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，所述试剂盒中包括检测九种病原体的正向引物、反向引物和探针。
6.进一步的，试剂盒中的正向引物和反向引物如下所示：
7.检测所述肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；
8.检测所述肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；
9.检测金黄色葡萄球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:7和seq id no:8
所示，探针序列如seq id no:9所示；
10.检测肺炎链球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示；
11.检测流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:13和seq id no:14所示，探针序列如seq id no:15所示；
12.检测肺炎克雷伯氏菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:16和seq id no:17所示，探针序列如seq id no:18所示；
13.检测鲍曼不动杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:19和seq id no:20所示，探针序列如seq id no:21所示；
14.检测铜绿假单胞菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:22和seq id no:23所示，探针序列如seq id no:24所示；
15.检测大肠杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:25和seq id no:26所示，探针序列如seq id no:27所示。
16.进一步的，所述试剂盒还包括内标，所示内标的正向引物和反向引物序列如seq id no:28和seq id no:29所示，探针序列如seq id no:30所示。
17.进一步的，所述探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为fam、rox、vic、tet和cy5中的一种，所述猝灭基团为bhq1、bhq2、bhq3和mgbnfq中的一种。
18.进一步的，所述试剂盒还包括pcr反应液，所述pcr反应液包括如下组分：tris-hcl ph＝8.5 10-100mm，kcl 1-50mm，mgcl
2 6-12mm，datp 0.5-2mm，dctp0.5-2mm，dgtp 0.5-2mm，dutp 2-4mm，ssb 0.5-3.0mg/ml。
19.进一步的，所述试剂盒pcr反应液包括如下组分：tris-hcl ph＝8.5 50mm，kcl 30mm，mgcl
2 7.5mm，datp 1mm，dctp 1mm，dgtp 1mm，dutp 2.5mm，ssb 2.0mg/ml。
20.进一步的，所述试剂盒还包括pcr酶液，所述pcr酶液包括如下组分：hot start taq 4u/test，ung 2u/test，anti taq 4u/test，dtt 0.5mg/ml。
21.进一步的，本发明中的anti taq为东洋纺生产的。
22.本发明还提供一种采用上述任意一种试剂盒用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌九种病原体的用途。
23.本发明还提供使用以上任意一种试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：
24.1)病原体提取；
25.2)pcr扩增：pcr反应体系如下：pcr反应液8μl；pcr酶液2μl；每种病原体和内标的正向引物和反向引物浓度分别为400nm；探针浓度分别为200nm；病原体提取产物10μl。
26.进一步的，所述pcr扩增中，采用三个检测孔，三个检测孔分别检测不同的病原体。
27.进一步的，本发明中pcr扩增步骤具体为：在检测仪器中使用三个检测孔，第一孔中加入肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌正反引物对和内标，第二孔中加入肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯氏菌正反引物对和内标，第三孔中加入鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌正反引物对和内标。
28.与现有技术相比，本发明具有如下优点：采用本发明中的试剂盒，通过试剂盒中的引物探针、pcr反应液、pcr酶液以及其他成分的结合、协同，最后得到一种快速、灵敏度高、
特异性好以及避免假阴性的检测九种病原体试剂盒；在使用本发明中试剂盒时，提取时加入内标，并且在检测时在检测的三个孔中都加入与检测病原体相互协同的内标，保证了提取的精准性以及很好的避免了检测的假阴性；本发明中的anti taq是从一百多家厂家中筛选出来的，将该厂家生产的anti taq与试剂盒中的其他成分结合、配合使用，最后达到本发明检测试剂盒的灵敏度为其他试剂盒的2倍，精密度为其他试剂盒的3倍左右。
29.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术属于本发明的内容。
具体实施方式
30.说明：本发明中核酸提取试剂采用重庆中元汇吉生物技术有限公司生产的产品。
31.实施例1一种检测九种病原体试剂盒及使用方法
32.1、pcr反应液：tris-hcl ph＝8.5 10mm，kcl 1mm，mgcl
2 6mm，datp
33.0.5mm，dctp 0.5mm，dgtp 0.5mm，dutp 2mm，ssb 0.5mm。
34.2、pcr酶液：hot start taq 4u/test，ung 2u/test，anti taq 4u/test，dtt0.5mg/ml其中为anti taq为东洋纺生产的。
35.3、病原体和内标正向引物、反向引物以及探针序列如下：
36.检测肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；
37.检测肺炎衣原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示；
38.检测金黄色葡萄球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示；
39.检测肺炎链球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示；
40.检测流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:13和seq id no:14所示，探针序列如seq id no:15所示；
41.检测肺炎克雷伯氏菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:16和seq id no:17所示，探针序列如seq id no:18所示；
42.检测鲍曼不动杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:19和seq id no:20所示，探针序列如seq id no:21所示；
43.检测铜绿假单胞菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:22和seq id no:23所示，探针序列如seq id no:24所示；
44.检测大肠杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:25和seq id no:26所示，探针序列如seq id no:27所示；
45.内标的正向引物和反向引物序列如seq id no:28和seq id no:29所示，探针序列如seq id no:30所示。
46.其中肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和内标分别对应的荧光基团为fam、
tet、rox、fam、tet、rox、fam、tet、rox、cy5。
47.本发明上述试剂盒的使用方法：
48.1)病原体提取：采用商品化核酸提取试剂盒，如中元生物细菌样本核酸提取试剂盒进行提取，提取前向每份样本中各加入2μl浓度为1.0e6 copies/ml的内标质粒。提取完成后，产物备用。
49.2)pcr扩增：按照8μl反应液1/2/3 2μl酶液的比例，配制工作液1/2/3，然后分装到反应孔中，每孔10μl。取每份提取产物，向反应孔1/2/3中各加入10μl提取产物，盖上盖子后进行pcr扩增。第1孔中提前加入了肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌正反引物对和内标，第2孔中提前加入了肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯氏菌正反引物对和内标，第3孔中提前加入了鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌正反引物对和内标。扩增程序见表1。
50.表1 pcr扩增程序
[0051][0052]
3)结果判断
[0053]
实施例2一种检测九种病原体试剂盒及使用方法
[0054]
1、pcr反应液：tris-hcl ph＝8.5 100mm，kcl 50mm，mgcl
2 12mm，datp2mm，dctp 2mm，dgtp 2mm，dutp 4mm，ssb 3.0mg/ml。
[0055]
2、pcr酶液：hot start taq 4u/tes，ung 2u/test，anti taq 4u/test，dtt0.5mg/ml其中anti taq为东洋纺生产的。
[0056]
3、病原体和内标正向引物、反向引物以及探针序列如下：
[0057]
检测肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；
[0058]
检测肺炎衣原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示；
[0059]
检测金黄色葡萄球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示；
[0060]
检测肺炎链球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示；
[0061]
检测流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:13和seq id no:14所示，探针序列如seq id no:15所示；
[0062]
检测肺炎克雷伯氏菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:16和seq id no:
17所示，探针序列如seq id no:18所示；
[0063]
检测鲍曼不动杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:19和seq id no:20所示，探针序列如seq id no:21所示；
[0064]
检测铜绿假单胞菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:22和seq id no:23所示，探针序列如seq id no:24所示；
[0065]
检测大肠杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:25和seq id no:26所示，探针序列如seq id no:27所示；
[0066]
内标的正向引物和反向引物序列如seq id no:28和seq id no:29所示，探针序列如seq id no:30所示。
[0067]
其中肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和内标分别对应的荧光基团为rox、vic、fam、rox、vic、fam、rox、vic、fam、cy5。
[0068]
本发明上述试剂盒的使用方法：
[0069]
1)九种病原体提取：采用商品化核酸提取试剂盒，如中元生物细菌样本核酸提取试剂盒进行提取，提取前向每份样本中各加入2μl浓度为1.0e6copies/ml的内标质粒。提取完成后，产物备用。
[0070]
2)pcr扩增：按照8μl反应液1/2/3 2μl酶液的比例，配制工作液1/2/3，然后分装到反应孔中，每孔10μl。取每份提取产物，向反应孔1/2/3中各加入10μl提取产物，盖上盖子后进行pcr扩增。第1孔中提前加入了肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌正反引物对和内标，第2孔中提前加入了肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯氏菌正反引物对和内标，第3孔中提前加入了鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌正反引物对和内标。扩增程序见表1。
[0071]
3)结果判断
[0072]
实施例3一种新型冠状病毒检测试剂盒
[0073]
1、pcr反应液：tris-hcl ph＝8.5 50mm，kcl 30mm，mgcl
2 7.5mm，datp1mm，dctp 1mm，dgtp 1mm，dutp 2.5mm，ssb 2.0mg/ml。
[0074]
2、pcr酶液：hot start taq 4u/test，ung 2u/test，anti taq 4u/test，dtt0.5mg/ml其中anti taq为东洋纺生产的。
[0075]
3、病原体和内标正向引物、反向引物以及探针序列如下：
[0076]
检测肺炎支原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；
[0077]
检测肺炎衣原体的正向引物和反向引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示；
[0078]
检测金黄色葡萄球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示；
[0079]
检测肺炎链球菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示；
[0080]
检测流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:13和seq id no:14所示，探针序列如seq id no:15所示；
[0081]
检测肺炎克雷伯氏菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:16和seq id no:17所示，探针序列如seq id no:18所示；
[0082]
检测鲍曼不动杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:19和seq id no:20所示，探针序列如seq id no:21所示；
[0083]
检测铜绿假单胞菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:22和seq id no:23所示，探针序列如seq id no:24所示；
[0084]
检测大肠杆菌的正向引物和反向引物序列如seq id no:25和seq id no:26所示，探针序列如seq id no:27所示；
[0085]
内标的正向引物和反向引物序列如seq id no:28和seq id no:29所示，探针序列如seq id no:30所示。
[0086]
其中肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和内标分别对应的荧光基团为cy5、rox、fam、cy5、rox、fam、cy5、rox、fam、vic。
[0087]
本发明上述试剂盒的使用方法：
[0088]
1)病原体提取：采用商品化核酸提取试剂盒，如中元生物细菌样本核酸提取试剂盒进行提取，提取前向每份样本中各加入2μl浓度为1.0e6 copies/ml的内标质粒。提取完成后，产物备用。
[0089]
2)pcr扩增：按照8μl反应液1/2/3 2μl酶液的比例，配制工作液1/2/3，然后分装到反应孔中，每孔10μl。取每份提取产物，向反应孔1/2/3中各加入10μl提取产物，盖上盖子后进行pcr扩增。第1孔中提前加入了肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌正反引物对和内标，第2孔中提前加入了肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯氏菌正反引物对和内标，第3孔中提前加入了鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌正反引物对和内标。扩增程序见表1。
[0090]
3)结果判断
[0091]
实施例4pcr反应液中mgcl2浓度的筛选
[0092]
1)实验过程：其他组分采用实施例3中的组分，设置mgcl2浓度4.5、6、7.5、9、10.5、12、13.5mm共7个浓度梯度，每个浓度梯度同时检测精密度参考品各10个复孔，计算平均ct值。
[0093]
2)实验结果见下表2
[0094]
表2 mgcl2浓度筛选数据
[0095]
[0096][0097]
分析：从上表中看出，mgcl2浓度在6-12mm范围内，检测结果才是准确的。
[0098]
实施例5本发明试剂盒的灵敏度、精密度以及特异性
[0099]
1、基本实验过程：采用实施例3中的试剂盒以及提取和扩增的步骤
[0100]
2、灵敏度：
[0101]
1)实验过程：与市面上销售较好的a公司竞品同时检测提取后的灵敏度企业参考品，每组做20个复孔，计算并比较成功检出率。
[0102]
2)实验结果：见表3
[0103]
表3 本发明试剂盒与a公司试剂盒灵敏度数据
[0104][0105]
分析：从上表中看出，采用本发明试剂盒对九种病原体进行检测，检测灵敏度企业参考品的检出率为100％,而其他公司检出率只有一半左右。
[0106]
3、精密度：
[0107]
1)实验过程：与市面上销售较好的a公司竞品同时检测提取后的精密度企业参考品，每组做10个复孔，计算并比较平均ct值和cv值。
[0108]
2)实验结果：见下表4
[0109]
表4 本发明试剂盒与a公司试剂盒精密度数据
[0110] 本发明a公司复孔132.8933.18复孔232.8033.96复孔332.7034.15复孔432.8133.03复孔532.7334.04复孔632.7934.25复孔732.7932.97复孔832.5833.54复孔932.5434.36复孔1032.8234.34ct均值32.7433.78cv值0.34％1.64％
[0111]
分析：从上表中看出，采用本发明试剂盒的精密度cv值大约是a公司试剂盒的1/5，并且ct均值比对方提前了1个循环，达到了预想不到的技术效果。
[0112]
4、特异性：
[0113]
1)实验过程：对制备好的阳性企业参考品和阴性企业参考品进行提取和检测，考察试剂盒的特异性。
[0114]
2)实验结果：见下表5、表6和表7。
[0115]
表5 第1检测孔检测试剂盒特异性的数据
[0116][0117][0118]
表6 第2检测孔检测试剂盒特异性的数据
[0119][0120]
表7 第3检测孔检测试剂盒特异性的数据
[0121][0122][0123]
分析：从上表5-7看出，本发明试剂盒具有很好的检测特异性。