一种人工胰腺及其构建方法与流程

1.本发明涉及人工胰腺技术领域，具体涉及一种人工胰腺及其构建方法。


背景技术：

2.糖尿病是慢性代谢类疾病，近年来，糖尿病在全球儿童中的发病率也以每年平均3％的速率增加，而作为糖尿病治疗金标准的胰岛素作为主要治疗手段用于治疗代谢速率高、活动量较大且处于生长发育其的儿童患者人群中的副作用以及风险仍然较高。因此寻求新型糖尿病治疗手段非常必要。
3.胰岛移植是目前治疗严重糖尿病的最佳方案，然而供体短缺与移植物的失活和功能丧失严重制约其临床治疗。胰腺主要由外周胰腺组织(外周胰腺细胞以及细胞外基质物质)、胰岛以及血管、淋巴管和胰腺内神经等等组成。其中胰岛中包含不同种类的细胞，可根据外周葡萄糖变化以及神经递质刺激等分泌包括胰岛素、胰高血糖素等胰岛激素。更重要的是，体内胰岛的血流与神经网络十分丰富，目前的人工胰岛再造无法完成胰岛血管化，导致再造的胰岛功能不稳定。因此，无论是在胰岛移植、人工胰岛/人工胰腺构建中，胰岛/胰腺器官血管化的问题至关重要，不仅直接关系到移植后器官的活力与功能，也是人工器官构建中的一大难点。
4.聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物(plga)是一种被美国food&drug association(fda)认可的可用于人类药用辅料的高分子聚合物。研究发现，plga具有良好的生物降解性和生物相容性，作为生物材料在临床应用中有广泛的用途。利用多孔微球具有低密度特性，常作为吸入式肺部给药研究(science 1997，276，1868)；而利用其多孔结构物质转运特性和细胞负载功能，在可注射细胞载体方面受到关注(biomaterials 2012，33，4069)。同时，利用多孔微球作为组分形成复合凝胶在植入式胰岛素长效缓释方面具有应用前景(专利申请201610493506.x，一种葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物复合凝胶及其制备方法和应用)。此外，也可利用多孔球近似的胰腺“网兜”状结构，特异性负载胰岛细胞构建人工胰岛或人工胰腺(专利申请201910924259.8)。然而以上均未能解决所构建的人工胰岛的血管化、神经化等生理化问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种人工胰腺及其构建方法，该构建方法得到的人工胰腺不仅具有胰岛生理结构的细胞团，还具有天然胰腺中丰富的血管、神经网络结构。
6.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.本发明第一方面提供一种人工胰腺的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
8.(a)将功能细胞置于含有plga微球的培养基中进行培养，得到种植有功能细胞的plga微球，其中，功能细胞选自血管内皮细胞、神经细胞、淋巴管细胞以及可分化为血管内皮细胞、神经细胞或免疫细胞的干细胞中至少一种；
9.(b)将胰岛细胞或可分化为胰岛细胞的干细胞置于含有种植有功能细胞的plga微
球的培养基中进行培养，得到所述人工胰腺。
10.优选地，所述步骤(a)中，plga微球的粒径为50～500μm，孔径为5～50μm。
11.优选地，所述步骤(a)中，功能细胞与plga微球的数量比为(104～107)∶1。
12.优选地，所述步骤(a)中，培养基为cmrl、dmem、rpmi、mem 10％胎牛血清、定制培养基或条件培养基；培养基中plga微球的浓度为100～5000个/ml；
13.培养温度为0℃或37℃，培养时间为2～30天。
14.优选地，所述步骤(a)中，可分化为血管内皮细胞的干细胞为人脐带血干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、骨髓干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞；血管内皮细胞为原代血管内皮细胞或表达一种或多种含cd31、cd34、vwh、alpha
‑
sma、lectin、isolectin和vegf血管标志物的血管内皮细胞；
15.可分化为神经细胞的干细胞为骨髓干细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞或各组织中的神经干细胞；神经细胞为原代神经细胞或表达一种或多种含nestin、sox2、neuronal marker class iiiβ
‑
tubulin(tuj1)、gfap、nf200、phox2b、ach、pgp9.5和tyrosin hydroxylase(th)神经细胞标志物的神经细胞；
16.可分化为免疫细胞的干细胞为造血干细胞或骨髓干细胞；免疫细胞为原代淋巴管细胞或表达lyve
‑
1淋巴管标志物的淋巴管细胞。
17.优选地，所述步骤(b)中胰岛细胞或可分化为胰岛细胞的干细胞与功能细胞的数量比为(1～5000)∶1。
18.优选地，所述步骤(b)中，胰岛细胞为原代胰岛细胞、min6、beta
‑
tc
‑
6、ins
‑
1、nit
‑
1、胰岛素分泌细胞、胰高血糖素分泌细胞、生长抑制素分泌细胞、胰岛激素或多肽分泌细胞、胰腺祖细胞、alpha
‑
tc细胞；可分化为胰岛细胞的干细胞为间充质干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞或骨髓干细胞。
19.优选地，所述步骤(b)中，培养温度为0℃或37℃；培养时间为2～30天。
20.本发明第二方面提供一种上述构建方法构建得到的人工胰腺。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
22.本发明人工胰腺的构建方法以多孔微球作为支撑，使可形成血管/神经网络的细胞以及胰岛细胞或可分化成为胰岛细胞的干细胞在微球内程序化种植生长，构建得到的人工胰腺即具有胰岛生理结构的细胞团，又具有天然胰腺中丰富的血管神经网络结构。
23.本发明构建得到的人工胰腺稳定，细胞存活率高，形态完好，可在高糖刺激下释放胰岛素并形成血管网络；此外，本发明构建方法可程序化灌注多种细胞，以达到所构建人工胰腺的血管化与神经化等生理要求。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
25.图1为本发明实施例1制备得到人工胰腺的显微镜观察结果；
26.图2为本发明实施例1制备得到人工胰腺的明场显微镜观察结果；
27.图3为本发明对比例1制备得到人工胰腺的显微镜观察结果；
28.图4为本发明对比例2制备得到人工胰腺的显微镜观察结果；
29.图5为本发明实施例1制备得到的人工胰腺的在糖刺激下分泌胰岛素情况。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
31.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
32.以下各实施例采用的原料如下：
33.plga微球：按照专利申请号为201910924259.8中的制备方法进行制备得到，具体制备方法如下：
34.将200毫克plga(分子量为10000
‑
100000)充分溶解在8毫升的二氯甲烷中制备成油相，在搅拌条件下滴加1％的nh4hco3溶液(致孔剂)形成初乳；
35.将初乳转移至0.1％的pva水溶液中，形成复乳，搅拌3小时；收集plga多孔微球。
36.去离子水洗涤3次，使用0.1m的naoh溶液洗涤20分钟后去离子水洗涤3次后分装。
37.冷冻干燥后得到plga多孔微球固体粉末。
38.上述得到的plga多孔微球的平均粒径范围为50
‑
500μm，多孔微球结构中孔的直径为5
‑
50μm。
39.实施例1
40.本发明实施例提供一种人工胰腺的构建方法，该构建方法包括如下步骤：
41.(a)重悬plga多孔微球，除去悬浮液，备用；采用胰酶消化人脐带血干细胞并计数，取4
×
107个人脐带血干细胞置于20ml注射器中，定容至4ml，负压抽打50次，然后，置于添加有plga微球的培养基中在37℃下培养10天，得到种植有人脐带血干细胞的plga微球，其中，培养基为rpmi；培养基中plga微球的浓度为800个/ml；人脐带血干细胞与plga微球的数量比为1x106:1；
42.(b)将1
×
109个min6细胞置于20ml注射器中，定容至4ml，负压抽打50次，然后，置于含有种植有人脐带血干细胞的plga微球的培养基中在37℃下培养8天，得到上述人工胰腺。
43.对上述实施例得到的人工胰腺在光学显微镜下进行观察，观察结果如图1、图2所示；
44.由图1、图2可知：
45.通过镜下观察，程序化种植并培养人脐带血干细胞(血管内皮细胞)及胰岛细胞后，在多孔微球表面形成细胞分泌基质，使附近多孔微球相连，其中每个微球内有胰岛素分泌细胞且细胞形态良好；整体形貌及尺寸与正常小鼠胰岛类似；进一步培养后发现，程序化种植并培养人脐带血干细胞(血管内皮细胞)及胰岛细胞后，可形成类似血管网络的结构，证明以此构建具有生理完整性(血管化)的人工胰腺。
46.对比例1
47.本对比例为一种人工胰腺的构建方法，该构建方法与实施例1中的构建方法基本
相同，区别仅在于步骤(a)中胰岛细胞与plga微球的数量比为1x103:1。
48.对上述制备得到的人工胰腺在光学显微镜下进行观察，观察结果如图3所示；
49.由图3可知：
50.上述人工胰腺可见负载细胞的多孔球附近零星细胞，并不能形成任何“整体”组织结构。
51.对比例2
52.本对比例为一种人工胰腺的构建方法，该构建方法与实施例1中的构建方法基本相同，区别仅在于步骤(a)中人脐带血干细胞与plga微球的数量比为1x103:1，人脐带血干细胞与胰岛细胞数量比为1:105。
53.对上述制备得到的人工胰腺在光学显微镜下进行观察，观察结果如图4所示；
54.由图4可知：
55.负载功能细胞和胰岛细胞的多孔球周围观察不到成型的血管网络。
56.实施例2
57.本实施例1得到的人工胰腺进行胰岛素释放试验：即在人工胰腺中分别加入20mmol/l的高浓度葡萄糖溶液和2mmol/l的低浓度葡萄糖溶液，再检测体系中胰岛素含量；检测结果如图5所示；
58.由图5可知：
59.本发明制备得到的人工胰腺可在20mmol/l的高浓度葡萄糖溶液刺激下释放胰岛素，并形成具有血管网络的结构，表面其可作为构建血管化人工胰腺。
60.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。