一种短乳杆菌菌株及应用的制作方法

1.本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高效生产短乳杆菌γ
‑
氨基丁酸的高产菌株及应用。


背景技术：

2.γ
‑
氨基丁酸(γ
‑
aminobutyric acid，简称gaba)是一种广泛存在于动物、植物以及微生物的天然非蛋白质组成的氨基酸，作为哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经性递质，参与各种生理生化反应，具有利尿、降血压、抗焦虑、健肝利肾、促进脑部回流、营养神经细胞等多种生理功能。
3.目前，gaba的合成方法主要有化学合成、动植物富集和微生物转化三种。其化学合成方法涉及毒性试剂，反应条件剧烈，安全性低；动植物富集方法存在产量低、提取困难等缺陷。微生物转化法具有产量高、安全环保、产品易于分离纯化等潜在优势，因此在未来可能成为规模化制备gaba的替代途径。
4.近二十年来，利用乳酸菌类转化gaba受到广泛关注，尤其短乳杆菌。一方面，最近的研究表明，短乳杆菌对gaba具有高产潜能；另一方面，短乳杆菌作为功能性食品的天然组分，是美国fda评价食品添加剂安全性指标(generally recognized as safe，gras)认为安全的微生物。以短乳杆菌作为发酵菌种，不仅能发挥自身的益生效应，而且能充分利用gaba的生理功能，应用前景广阔，有巨大的社会和经济效益。然而，在常规的发酵菌种及发酵工艺下，gaba产量处于较低水平，不仅直接影响着gaba的制备效率，而且，过低浓度的产物也不利于后期的分离纯化。在这种形势下，如何提升短乳杆菌发酵产gaba的产率，成为了亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种γ
‑
氨基丁酸的高效生产菌株及其生物发酵方法，以解决短乳杆菌发酵产gaba的过程中，以及常规短乳杆菌菌株和常规发酵工艺所得产率有待提升的技术问题。
6.一种短乳杆菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.204065。
7.所述菌株筛选自腌制物表面的混合菌群，将所述混合菌群进行放大培养，分别挑选单菌落以底物为谷氨酸进行培养，筛选出培养液中γ
‑
氨基丁酸产量最多的为起始菌株，经过微生物菌种鉴定，所述起始菌株鉴定结果为短乳杆菌(lactobacillus brevis)。
8.接着将起始菌株利用硫酸二乙脂(des)进行诱变，产生诱变型菌株，其中菌体致死率达60％
‑
75％。
9.挑选出诱变型菌株置于高通量筛选平板中以底物为谷氨酸混合反应，再以起始菌株作为对照，筛选出高产量诱变菌株，即为本发明的短乳杆菌 cgmcc no.20465。
10.所述诱变条件包括物理诱变和/或化学诱变。不同的诱变条件均可以作用于菌株，
用来得到突变菌株，例如x射线、γ
‑
射线，快中子，激光，微波，离子束、紫外线等物理突变手段，烷化剂、天然碱基类似物、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、吖啶等生物化学物质，均可以作为菌株的诱变物质。
11.所述短乳杆菌cgmcc no.204065用于生产γ
‑
氨基丁酸的用途。
12.一种γ
‑
氨基丁酸的生产方法，通过发酵所述的短乳杆菌cgmccno.204065获得γ
‑
氨基丁酸。
13.所述γ
‑
氨基丁酸的生产方法包括以下步骤：a：先将短乳杆菌菌种接入种子培养基中培养；和b：将步骤a的产物接入发酵放大培养基中发酵，发酵后加入l
‑
谷氨酸。
14.其中，所述l
‑
谷氨酸添加量为650
‑
750g/l。
15.作为优选，所述种子培养基包括以下成分：含有培养基总重计10
‑
24
‰
的碳源、35
‑
44
‰
的氮源、2
‑4‰
的无机盐、17
‑
28
‰
的有机盐和1.5
‑
2.5
‰
表面活性剂，ph为6.2
‑
6.6。
16.所述发酵放大培养基包括以下成分：含有培养基总重计53
‑
60
‰
的碳源、 27
‑
33
‰
的氮源、1.5
‑
2.5
‰
的无机盐5
‑9‰
的有机盐和1
‑2‰
表面活性剂，ph 为6.2
‑
6.6。
17.其中，所述种子培养基和/或发酵放大培养基的碳源可选自：葡萄糖和/ 或蔗糖；氮源可选自：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母蛋白胨和/或玉米浆干粉；有机盐可选自：柠檬酸铵、l
‑
谷氨酸钠和/或乙酸钠；无机盐可选自：k2hpo4、 mgso4.7h2o和/或mnso4·
h2o；表面活性剂可选自：吐温80。
18.作为优选，所述种子培养基包括以下成分：酵母浸粉5
‑
20g/l，蛋白胨 5
‑
15g/l，葡萄糖5
‑
20g/l，柠檬酸铵1
‑
3g，吐温80 1
‑
2g/l，乙酸钠3
‑
7.0g， k2hpo4 1
‑
3g，mgso4.7h2o 0.1
‑
0.3g，l
‑
谷氨酸钠5
‑
25g/l，mnso4
·
h2o0.1
‑
0.5mm。
19.作为优选，所述种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
20.作为优选，所述发酵放大培养基包括以下成分：乙酸钠3
‑
7.0g，酵母浸粉5
‑
25g/l，玉米浆干粉15
‑
40g/l，葡萄糖20
‑
50g/l，柠檬酸铵1
‑
3g，吐温 80 1
‑
2g/l，k2hpo4 1
‑
3g，mgso4.7h2o 0.1
‑
0.3g，mnso4
·
h2o 0.3
‑
0.5mm，所述发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6，以30～37℃的温度培养24～48h。
21.作为优选，种子培养的产物以3
‑
5％的接种量接入发酵放大培养基中进行发酵培养。产生浓度为420
‑
650g/l的γ
‑
氨基丁酸,转化率为98.5
‰
以上。
22.本发明所采用的短乳杆菌cgmcc no.20465，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的保藏编号为cgmcc no.20465。其分类命名为lactobacillus breis(短乳杆菌)；其保藏日期为2020年7月29 日。
23.本发明提供了一种高效生产γ
‑
氨基丁酸的生物发酵方法。该技术方案以前期选育的短乳杆菌cgmcc no.20465为发酵菌株，通过菌株选育、培养基优化、培养工艺优化三方面的协同配合达到了异常高水平的gaba产量。具体来看，本发明首先将短乳杆菌cgmcc no.20465接种于特定成分的种子培养基中，以30～37℃的温度摇床培养12～24h，使培养液浓度od600 值达5～10之间，得到种子培养液；而后以3
‑
5％的接种量接入特定成分的发酵放大培养基中，以30～37℃的温度静置培养24～48h，即累积了高含量的gaba。
24.实验验证表明，本发明所得的短乳杆菌终产物中gaba含量高达450～650g/l，为目前报道的最高水平。本发明所涉及的培养基均通过了前期优化，不仅培养效果良好，而且具有效率高的技术优势。本发明从特定的菌株出发，采用创新性的培养基及工艺条件使gaba产量得到显著提升，为短乳杆菌发酵产gaba的规模化应用奠定了良好的基础。
具体实施方式
25.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
26.实施例1
27.高产γ
‑
氨基丁酸的菌株筛选方法，步骤如下：
28.步骤1、本发明的样品筛选自腌制物表面的混合菌群，将所述菌群涂布于lb固体培养基上，37℃培养24h，进行放大。本发明所选用的腌制物为咸菜。
29.步骤2、挑选上述放大后的单菌落，分别以底物为谷氨酸进行培养及发酵，筛选出发酵液中γ
‑
氨基丁酸产量最多的为起始菌株。
30.步骤3、所述起始菌株采用微生物菌种鉴定biology仪鉴定，鉴定结果为短乳杆菌(lactobacillus breis)。
31.步骤4、将所述起始菌株培养至对数生长期，然后进行诱变处理。诱变步骤如下：
32.步骤4
‑
1、利用浓度为0.1
‑
0.2％的硫酸二乙脂(des)诱变剂加入经过5
‑
10h 培养后的起始菌液中，处理1
‑
1.5小时进行化学诱变，产生诱变型菌株，其中菌体致死率达60％
‑
75％。
33.步骤4
‑
2、将诱变型菌株稀释处理(od600＝20)，置于高通量筛选平板中以底物为谷氨酸(150g/l)混合反应20h，37℃。再以起始菌株作为对照，基于berthelot显色原理测定od值，筛选出γ
‑
氨基丁酸产量最高的诱变菌株，即为本发明的短乳杆菌cgmcc no.20465。
34.起始菌株γ
‑
氨基丁酸生产量为200
‑
300g/l，转化率40
‑
60
‰
，诱变菌株(短乳杆菌cgmcc no.20465)γ
‑
氨基丁酸产量为420
‑
650g/l，转化率达到98
‰
以上，参考下表。
35.表、诱变前后γ
‑
氨基丁酸产量比对 生产量(g/l)转化率(％)起始菌株(短乳杆菌)200
‑
30040
‑
60诱变菌株(短乳杆菌cgmccno.20465)420
‑
65098
36.实施例2
37.短乳杆菌cgmcc no.20465活化后，转接于液体种子培养基，以3％的接种量接种于发酵放大培养基，于37℃静置培养48h。
38.种子培养基(g/l)包括：酵母浸粉5g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖5g/l，柠檬酸铵1.0g，吐温80 1g/l，乙酸钠3.0g，k2hpo4 1.0g，mgso4.7h2o 0.1g， l
‑
谷氨酸钠5g/l，mnso4
·
h2o 0.1mm，培养基ph为6.2
‑
6.6。种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
39.发酵放大培养基(g/l)包括：乙酸钠3.0g，酵母浸粉5g/l，玉米浆干粉15g/l，葡萄糖20g/l，柠檬酸铵1.0g，吐温80 1g/l，k2hpo4 1.0g，mgso4.7h2o0.1g，mnso4
·
h2o 0.3mm，发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6。发酵培养条件为：以30～37℃的温度培养24～48h。
40.发酵结束后添加底液l
‑
谷氨酸650g/l至发酵后的发酵放大培养基中,35
‑
37℃条件下反应24
‑
48小时，得到的gaba含量达420g/l。
41.实施例3
42.短乳杆菌cgmcc no.20465活化后，转接于液体种子培养基，以3％的接种量接种于发酵放大培养基，于30℃静置培养30h。
43.种子培养基(g/l)包括：酵母浸粉10g/l，蛋白胨15g/l，葡萄糖15g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 1.5g/l，乙酸钠5.0g，k2hpo4 2.0g，mgso4.7h2o 0.2g， l
‑
谷氨酸钠10g/l，mnso4
·
h2o 0.3mm，培养基ph为6.2
‑
6.6。种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
44.发酵放大培养基(g/l)包括：乙酸钠5.0g，酵母浸粉20g/l，玉米浆干粉25g/l，葡萄糖30g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 2g/l，k2hpo4 2.0g， mgso4.7h2o 0.2g，mnso4
·
h2o 0.3mm，发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6。发酵培养条件为：以30～37℃的温度培养24～48h。
45.发酵结束后添加底液l
‑
谷氨酸650g/l,35
‑
37℃条件下培养24
‑
48小时，得到的gaba含量达450g/l。
46.实施例4
47.短乳杆菌cgmcc no.20465活化后，转接于液体种子培养基，以4％的接种量接种于发酵放大培养基，于33℃静置培养30h。
48.种子培养基(g/l)包括：酵母浸粉12g/l，蛋白胨13g/l，葡萄糖15g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 1.5g/l，乙酸钠5.0g，k2hpo4 2.0g，mgso4.7h2o 0.2g， l
‑
谷氨酸钠10g/l，mnso4
·
h2o 0.3mm，培养基ph为6.2
‑
6.6。种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
49.发酵放大培养基(g/l)包括：乙酸钠5.0g，酵母浸粉25g/l，玉米浆干粉 35g/l，葡萄糖35g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温802g/l，k2hpo4 2.0g， mgso4.7h2o 0.2g，mnso4
·
h2o 0.3mm，发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6。发酵培养条件为：以30～37℃的温度培养24～48h。
50.发酵结束后添加底液l
‑
谷氨酸690g/l,35
‑
37℃条件下培养24
‑
48小时，得到的gaba含量达488g/l。
51.实施例5
52.短乳杆菌cgmcc no.20465活化后，转接于液体种子培养基，以4％的接种量接种于发酵放大培养基，于35℃静置培养36h。
53.种子培养基(g/l)包括：酵母浸粉12g/l，蛋白胨13g/l，葡萄糖15g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 1.5g/l，乙酸钠5.0g，k2hpo4 2.0g，mgso4.7h2o 0.2g， l
‑
谷氨酸钠20g/l，mnso4
·
h2o 0.3mm，培养基ph为6.2
‑
6.6。种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
54.发酵放大培养基(g/l)包括：乙酸钠5.0g，酵母浸粉30g/l，玉米浆干粉 40g/l，葡萄糖40g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 2g/l，k2hpo4 2.0g， mgso4.7h2o 0.2g，mnso4
·
h2o 0.4mm，发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6。发酵培养条件为：以30～37℃的温度培养24～48h。
55.发酵结束后添加底液l
‑
谷氨酸700g/l,35
‑
37℃条件下培养24
‑
48小时，得到的gaba含量达513g/l。
56.实施例6
57.短乳杆菌cgmcc no.20465活化后，转接于液体种子培养基，以4％的接种量接种于发酵放大培养基，于37℃静置培养48h。
58.种子培养基(g/l)包括：酵母浸粉20g/l，蛋白胨15g/l，葡萄糖20g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 1.5g/l，乙酸钠5.0g，k2hpo4 2.0g，mgso4.7h2o 0.2g， l
‑
谷氨酸钠20g/l，mnso4
·
h2o 0.3mm，培养基ph为6.2
‑
6.6。种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
59.发酵放大培养基(g/l)包括：乙酸钠5.0g，酵母浸粉25g/l，玉米浆干粉 40g/l，葡萄糖50g/l，柠檬酸铵2.0g，吐温80 1.5g/l，k2hpo4 2.0g， mgso4.7h2o 0.2g，mnso4
·
h2o 0.5mm，发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6。发酵培养条件为：以30～37℃的温度培养24～48h。
60.发酵结束后添加底液l
‑
谷氨酸720g/l,35
‑
37℃条件下培养24
‑
48小时，得到的gaba含量达586g/l。
61.实施例7
62.短乳杆菌cgmcc no.20465活化后，转接于液体种子培养基，以5％的接种量接种于发酵放大培养基，于37℃静置培养48h。
63.种子培养基(g/l)包括：酵母浸粉20g/l，蛋白胨15g/l，葡萄糖20g/l，柠檬酸铵3.0g，吐温80 2g/l，乙酸钠7.0g，k2hpo4 3.0g，mgso4.7h2o 0.3g， l
‑
谷氨酸钠25g/l，mnso4
·
h2o 0.5mm，培养基ph为6.2
‑
6.6。种子培养的条件为：以30～37℃的温度摇床培养12～24h。培养结束时，种子培养液的浓度od600值为5～10。
64.发酵放大培养基(g/l)包括：乙酸钠7.0g，酵母浸粉25g/l，玉米浆干粉 40g/l，葡萄糖50g/l，柠檬酸铵3.0g，吐温80 2g/l，k2hpo4 3.0g， mgso4.7h2o 0.3g，mnso4
·
h2o 0.5mm，发酵放大培养基的ph为6.2
‑
6.6。发酵培养条件为：以30～37℃的温度培养24～48h。
65.发酵结束后添加底液l
‑
谷氨酸750g/l,35
‑
37℃条件下培养24
‑
48小时，得到的gaba含量达650g/l。