组合hbv疗法
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‑
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背景技术：
3.全球有超过4亿人患有慢性hbv感染(chb)，因此患严重肝病的风险增加，如慢性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌(hcc)，导致估计每人有600,000人死亡。对chb患者的纵向研究表明，发展为肝硬化的5年累积发生率为8％至20％，而肝功能失代偿的5年累积发生率约为20％。hcc的全球发病率有所增加，目前已成为全球癌症相关死亡的第三大原因(el
‑
serag h.b.和rudolph k.l.,gastroenterology 132:2557
–
76(2007))。
4.hbv是一种dna病毒，具有脂质包膜和二十面体核衣壳，其包裹着病毒dna基因组和dna聚合酶。hbv衣壳是在包装rna前基因组复制复合物期间在受感染细胞的胞质溶胶中形成的，由核心蛋白(也称为hbcag)及其切割变体hbeag组成。当病毒dna在进入新细胞时与衣壳分离时，其可以转化为共价闭合环状dna(cccdna)，其可能会在hbv治疗后保留在肝细胞中，并有可能重新激活感染。脂质包膜包含乙型肝炎表面抗原(hbsag)，其指三种不同的蛋白s
‑
hbsag(小抗原)、m
‑
hbsag(中抗原)和l
‑
hbsag(大抗原)，其由相同开放阅读框架编码，但利用不同起始密码子。hbsag是目前可用的乙型肝炎疫苗中存在的抗原。hbv还编码蛋白hbx，其抑制肿瘤抑制因子p53，促进细胞周期进程，并增加活性氧的产生。
5.除了产生病毒粒子外，hbv还会导致产生亚病毒粒子(svp)，其中包含hbv病毒粒子的脂质包膜，但没有复制能力，通常缺乏核衣壳。svp可以产生超过可复制病毒体3
‑
4log的量。svp上预设的高水平hbsag会耗尽hbsag特异性t细胞应答，这可能是导致免疫系统在慢性乙型肝炎期间无法清除hbv感染的重要因素(chisari,f.v.等，pathologie biologie 58:258
‑
66(2010))。
6.chb感染的自然演变包括四个连续的阶段：(1)早期“免疫耐受”阶段，其与高水平的病毒复制和最小肝脏炎症相关；(2)免疫反应性阶段，其与显著的肝脏炎症和血清转氨酶升高相关；一些患者进展至(3)“非复制”或“非活性”阶段，其与以下相关：血清转化为抗hbe；无法检测到或低水平病毒血症(通过基于pcr的测定，低于2000iu/ml)；和肝脏炎症恢复；以及对于一些人，(4)病毒重新激活。hbv感染的重新激活可能与特定病毒突变的出现有关，这些突变阻止hbeag的产生但不妨碍病毒复制，这被称为hbeag阴性慢性乙型肝炎。hbeag阴性慢性乙型肝炎(也称为抗hbe阳性或前核心突变型肝炎)的特征是血清hbv dna和血清转氨酶(alt和ast)水平波动，以及进行性肝病。
7.目前可用的hbv治疗方法的主要目标是永久抑制hbv复制并改善肝病。临床上重要的短期目标包括：实现hbeag血清转换、使血清alt和ast正常化、解决肝脏炎症和预防肝脏失代偿。hbv治疗的最终长期目标是实现持久的免疫应答，以防止肝硬化和肝癌的发展，从而延长生存期。由于ccchbv dna在受感染肝细胞的细胞核中持续存在，目前可用的hbv治疗
不能完全清除病毒。然而，治疗诱导的血清hbsag清除是慢性hbv感染终止的标志物，并且与最佳的长期结局相关。
8.尽管三种主要的hbv蛋白(hbsag、hbeag和hbcag)都具有免疫抑制特性，但hbsag是在hbv感染者的循环中占绝大多数的hbv蛋白。此外，虽然hbeag的去除(通过血清转化)或血清病毒血症的减少与治疗后hbv感染持续控制的发展无关，但是在hbv感染中从血液中去除血清hbsag(和血清转换)是治疗时抗病毒应答的公认预后指标，这将导致治疗后hbv感染得到控制(尽管这仅发生在接受免疫治疗的一小部分患者中)。因此，去除hbsag可能是克服病毒对hbv感染者免疫功能抑制的重要策略。
9.目前治疗hbv的标准方法包括基于干扰素或胸腺素α1的免疫疗法以及通过抑制hbv聚合酶来抑制病毒产生。hbv聚合酶抑制剂可有效减少病毒产生，但对快速降低hbsag几乎没有效果，或者可以在有限数量的患者中通过长期治疗缓慢降低hbsag(如使用富马酸替诺福韦二吡呋酯的情况)。基于干扰素的免疫疗法可以减少病毒产生和从血液中早期清除hbsag，但仅适用于一小部分接受治疗的受试者。hbsag在血液中被普遍接受的作用是隔离抗hbsag抗体并使传染性病毒颗粒逃避免疫检测，这可能是hbv感染仍然是慢性病的原因之一。此外，hbsag、hbeag和hbcag都具有免疫抑制特性，并且这些病毒蛋白在接受任何目前可用的hbv治疗的患者血液中的持续存在可能对阻止患者实现对其hbv感染的免疫控制具有显着影响。
10.目前可用的治疗方法都没有在大部分患者中恢复对hbv的免疫控制。因此，仍然需要能够抑制病毒复制并恢复大多数患者的免疫控制的针对hbv感染的有效治疗方法。
技术实现要素：
11.在一些实施方式中，本公开内容提供了一种用于在对象中治疗慢性hbv感染的hbv基因表达抑制剂，其中随后向所述对象施用抗hbv抗体。
12.本公开内容还提供了一种用于在对象中治疗慢性hbv感染的降低hbv抗原负载的药剂，其中随后向所述对象施用抗hbv抗体。
13.本公开内容还提供了一种用于在对象中治疗慢性hbv感染的组合物，其中(a)所述组合物包含抗hbv抗体，并且所述对象此前已施用基因表达的抑制剂；或者(b)组合物包含抗hbv抗体，并且所述对象此前已施用降低hbv抗原负载的药剂。
14.在一些实施方式中，本公开内容提供了hbv基因表达抑制剂和抗hbv抗体在制备用于治疗慢性hbv感染的药物中的用途。本公开内容还提供了降低hbv抗原负载的药剂和抗hbv抗体在制备用于治疗慢性hbv感染的药物中的用途。
15.在一些实施方式中，本公开内容提供了一种在有需要的对象中治疗慢性hbv感染的方法，其包括：向所述对象施用降低hbv抗原负载的药剂；和向所述对象施用抗hbv抗体。本公开内容还提供了一种在有需要的对象中治疗慢性hbv感染的方法，其包括：向所述对象施用hbv基因表达抑制剂；和向所述对象施用抗hbv抗体。
16.在本文所述的一些方法、组合物或用途中，抗hbv抗体是hbc34或hbc34的非天然变体。
17.在本文所述的一些方法、组合物或用途中，降低hbv抗原负载的药剂或hbv基因表达抑制剂是rnai药剂(例如，sirna，如hbv02)。
18.在一些实施方式中，本公开内容还提供了试剂盒，其包含如本文公开的rnai药剂和抗hbv抗体，以及任选地用于实施本文所述的方法的说明书。
附图说明
19.图1描述了在小鼠hbv模型(aav
‑
hbv模型)中组合疗法研究的给药方案。恩替卡韦每天口服施用一次。在研究开始时皮下注射一次hbv特异性sirna，在研究的第三周和第四周，每周两次腹腔内施用小鼠嵌合抗hbv抗体。在第四周时处死一部分小鼠，在研究第六周时处死另一部分小鼠。
20.图2a描述了以hbv dna拷贝数作为指标在小鼠血清样品中hbv病毒负载的测定结果，使用hbv02 sirna(方块，实线)；小鼠嵌合hbc34抗体(hbc34v7；15mg/kg)(圆圈，实线)；或盐水(三角形，实线)对小鼠进行治疗。
21.图2b描述了以hbv dna拷贝数作为指标在小鼠血清样品中hbv病毒负载的测定结果，使用对照sirna和对照抗体(方块，虚线)；恩替卡韦单用(“etv”，菱形，虚线)；hbv02 sirna和小鼠嵌合hbc34v7抗体(15mg/kg)(圆圈，虚线)；或hbv02 sirna、hbc34v7抗体(15mg/kg)和恩替卡韦(三角形，实线)对小鼠进行治疗。
22.图3a描述了在使用hbv02 sirna(方块，实线)；小鼠嵌合hbc34v7抗体(15mg/kg)(圆圈，实线)；或盐水(三角形，实线)治疗后，从小鼠血清测量的hbsag水平。
23.图3b描述了在使用对照sirna和对照抗体(方块，虚线)；恩替卡韦单用(“etv”，菱形，虚线)；hbv02 sirna和小鼠嵌合hbc34v7抗体(15mg/kg)(圆圈，虚线)；或hbv02 sirna、小鼠嵌合hbc34v7抗体(15mg/kg)和恩替卡韦(三角形，虚线)治疗后，从小鼠血清测量的hbsag水平。
24.图4描述了从处于sirna施用后第14天和第42天之间的小鼠血清测量的游离抗体的水平。描述了下述治疗组：小鼠嵌合hbc34v7抗体单用(圆圈)；hbv02 sirna、小鼠嵌合hbc34v7抗体和恩替卡韦(方块)；和hbv02 sirna和小鼠嵌合hbc34v7抗体(三角形)。
25.图5a描述了在使用sirna、抗体和/或对照治疗后，以hbv dna拷贝数作为指标，在小鼠血清样品中hbv病毒负载的测定结果。在第
‑
28天使用aav/hbv病毒对小鼠进行注射。在第0天向aav/hbv感染的c57bl/6小鼠施用11种不同治疗中的一种：(1)hbv特异性sirna(hbv02，具有seq id no:8的反义链；参见实施例1中的描述)；(2)
‑
(3)抗hbv抗体(全鼠源hbc24)，以两种剂量之一；(4)
‑
(5)一种剂量的hbv02sirna，和两种剂量之一的全鼠源hbc24；(6
‑
9)两种剂量之一的hbv02 sirna，和三种抗体剂量之一的全鼠源抗hbv抗体hbc34(hbc34v35)；(10)对照sirna和对照抗体；或者(11)仅pbs，腹腔内施用。显示了治疗1
‑
5、10和11的结果。
26.图5b描述了使用sirna、抗体和/或对照治疗后，以hbv dna拷贝数作为指标，在小鼠血清样品中hbv病毒负载的测定结果。在第
‑
28天使用aav/hbv病毒对小鼠进行注射。在第0天向aav/hbv感染的c57bl/6小鼠施用11种不同治疗中的一种：(1)hbv特异性sirna(hbv02，具有seq id no:8的反义链；参见实施例1中的描述)；(2)
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(3)抗hbv抗体(全鼠源hbc24)，以两种剂量之一；(4)
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(5)一种剂量的hbv02sirna，和两种剂量之一的全鼠源hbc24；(6
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9)两种剂量之一的hbv02 sirna，和三种抗体剂量之一的全鼠源抗hbv抗体hbc34(hbc34v35)；(10)对照sirna和对照抗体；或者(11)仅pbs，腹腔内施用。显示了治疗1和6
‑
11
的结果。
27.图6a描述了使用sirna、抗体和/或对照治疗后从小鼠血清测量的hbsag水平，如上述图5a中所描述的。
28.图6b描述了使用sirna、抗体和/或对照治疗后从小鼠血清测量的hbsag水平，如上述图5b中所描述的。
29.图7a描述了使用sirna、抗体和/或对照治疗后从小鼠血清测量的hbeag水平，如上述图5a中所描述的。
30.图7b描述了使用sirna、抗体和/或对照治疗后从小鼠血清测量的hbeag水平，如上述图5b中所描述的。
31.图8显示了针对实施例3中所描述的研究的实验设计，包括在用抗hbv抗体和hbv特异性sirna治疗后，用于评估小鼠模型中hbsag的血清清除率和病毒进入抑制的给药方案。对移植了原代人肝细胞的aav/hbv感染scid小鼠(每个治疗组n＝4只小鼠)施用以下七种不同治疗之一：(1)仅pbs；(2
‑
4)三种剂量之一的抗hbv抗体(全鼠源hbc34v35)，在两至三周期间每周腹腔内施用两次；或者(5
‑
7)在研究开始时皮下施用一次hbv特异性sirna(hbv02，具有seq id no:8的反义链；参见实施例1中的描述)，和在两至三周期间每周腹腔内施用两次全鼠源hbc34v35，以三种抗体剂量之一。在第6周时处死小鼠。
32.图9显示了在使用pbs(对照)；hbc34v35抗体；或hbv34v35抗体和hbv02 sirna治疗后，在使用原代人肝细胞移植的scid小鼠中，在小鼠中的血清hbv dna浓度。
33.图10显示了在使用pbs(对照)；hbc34v35抗体；或hbv34v35抗体和hbv02 sirna治疗后，在使用原代人肝细胞移植的scid小鼠中，在小鼠中的血清hbsag浓度。
34.图11显示了在使用pbs(对照)；hbc34v35抗体；或hbv34v35抗体和hbv02 sirna治疗后，在使用原代人肝细胞移植的scid小鼠中，在小鼠中的血清hbeag浓度。
35.图12显示了在使用pbs(对照)；hbc34v35抗体；或hbv34v35抗体和hbv02 sirna治疗后，在使用原代人肝细胞移植的scid小鼠中，在小鼠中的血清hbcrag浓度。
36.图13描述了在用于评价sirna抗体联合疗法在治疗hbv中的有效性的2期研究设计的治疗方案。
具体实施方式
37.本公开内容提供了使用hbv蛋白表达抑制剂和抗hbv抗体用于治疗乙型肝炎病毒(hbv)感染的方法和组合物以及相关试剂盒。可以将联合疗法用于治疗慢性乙型肝炎(chb)。
38.在一些实施方式中，所述方法包括在有需要的对象中治疗hbv感染，通过：(i)向所述对象施用hbv基因表达抑制剂；和(ii)向所述对象施用抗hbv抗体。在特定实施方式中，在施用hbv基因表达抑制剂后，至少一种hbv基因表达降低，并且当至少一种hbv基因的表达降低时，向所述对象施用抗hbv抗体。
39.在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂是抑制hbv转录物表达的rnai药剂。在特定实施方式中，rnai药剂是sirna(在本文中也称为“双链rna”或“dsrna”)，其靶向和抑制由hbv的x基因编码的mrna的表达。
40.在某些实施方式中，抗hbv抗体识别hbv基因型a、b、c、d、e、f、g、h、i和j；和/或是人
抗体。在特定实施方式中，抗hbv抗体选自：hbc34野生型抗体、hbc34抗体的非天然变体，和/或hbc24抗体。
41.在本文所述的一些实施方式中，hbv基因表达抑制剂和抗hbv抗体协同作用以降低病毒载量和循环hbsag。这种联合疗法可以为慢性hbv提供功能性治愈，并且可以允许施用较低剂量的抗体，从而降低抗体诱导毒性的可能性。
42.i.术语表
43.以下部分提供了hbv联合疗法的详细描述，包括：hbv蛋白表达抑制剂；抗hbv抗体；使用hbv蛋白表达抑制剂与抗hbv抗体的组合治疗对象的方法；以及与联合疗法相关的试剂盒。在更详细地阐述本公开内容之前，提供将在本文中使用的某些术语的定义可能有助于对其的理解。本公开内容通篇阐述了另外的定义。
44.在本说明书中，除非另有说明，否则术语“约”是指所示范围、值或结构的
±
20％。
45.术语“包括”是指权利要求中提及的所述特征、整体、步骤或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整体、步骤、组分或其组。术语“基本上由
……
组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤，以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的基础和新颖特征的特定材料或步骤。
46.应当理解，本文所用的术语“一个(a)”和“一种(an)”是指列举的组分中的“一个或多个”。替代方案的使用(例如，“或”)应理解为表示替代方案中的任一个、两个或其任何组合，并且可以与“和/或”同义使用。如本文所用，术语“包括”和“具有”同义使用，这些术语及其变体旨在被解释为非限制性的。
[0047]“基本上”一词不排除“完全”；例如，“基本上不含”y的组合物可能完全不含y。必要时，此处提供的定义中可以省略“基本上”一词。
[0048]
如本文所用，术语“疾病”旨在与术语“病症”和“病况”(如在医学病况中)通常是同义的，并且可以互换使用，因为其都反映了人体或动物体的异常病症或其损害正常功能的部分之一，通常表现为有区别的体征和症状，并导致人类或动物的持续时间或生活质量下降。
[0049]
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”以及这些术语的变体是指分子，特别是肽、寡肽、多肽或蛋白质，包括融合蛋白，分别包含通过正常肽键或通过修饰的肽键相互连接的至少两个氨基酸，例如在等排肽的情况下。例如，肽、多肽或蛋白质可由选自遗传密码定义的20个氨基酸的氨基酸组成，通过正常肽键彼此连接(“经典”多肽)。肽、多肽或蛋白质可以由l
‑
氨基酸和/或d
‑
氨基酸组成。特别地，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”还包括“肽模拟物”，其被定义为含有非肽结构元件的肽类似物，这些肽能够模拟或拮抗天然亲本肽的生物作用。肽模拟物缺乏经典的肽特征，如酶促裂解肽键。特别地，除了这些氨基酸之外，肽、多肽或蛋白质可以包含除了由遗传密码定义的20个氨基酸之外的氨基酸，或者其可以由除遗传密码定义的20个氨基酸以外的氨基酸组成。特别地，在本公开内容的上下文中的肽、多肽或蛋白质同样可以由通过天然过程修饰的氨基酸组成，如翻译后成熟过程或化学过程，其是本领域技术人员众所周知的。此类修饰在文献中有详细描述。这些修饰可以出现在多肽的任何地方：肽骨架、氨基酸链，甚至羧基或氨基末端。特别地，肽或多肽可以在泛素化之后分支或者是带有或不带有分支的环状。这种类型的修饰可以是本领域技术人员公知的天然或合成的翻译后过程的结果。在本公开内容的上下文中，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”尤其
还包括修饰的肽、多肽和蛋白质。例如，肽、多肽或蛋白质修饰可包括乙酰化、酰化、adp
‑
核糖基化、酰胺化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、去甲基化、糖基化包括聚乙二醇化、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、seneloylation、硫酸化、氨基酸加成如精氨酸化，或泛素化。在文献中充分地描述了此类修饰(proteins structure and molecular properties,2nd ed.,t.e.creighton,new york(1993)；post
‑
translational covalent modifications of proteins,b.c.johnson,ed.,academic press,new york(1983)；seifter等，analysis for protein modifications and nonprotein cofactors,meth.enzymol.182:626
‑
46(1990)；和rattan等，protein synthesis:post
‑
translational modifications andaging,ann ny acad sci 663:48
‑
62(1992))。因此，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”包括例如脂肽、脂蛋白、糖肽、糖蛋白等。
[0050]
如本文所用，“(多)肽”包含由如上所述的肽键连接的氨基酸单体的单链。如本文所用，“蛋白”包含一种或多种，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种(多)肽，即，如上文所解释的通过肽键连接的一个或多个氨基酸单体的链。在特定实施方式中，根据本公开内容的蛋白包含1、2、3或4个多肽。
[0051]
如本文所用，术语“重组”(例如，重组抗体、重组蛋白、重组核酸等)指通过重组方式制备、表达、形成或分离，并且不是天然存在的任何分子(抗体、蛋白、核酸、sirna等)。如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”可以互换使用，旨在包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的。在特定实施方式中，核酸分子是双链rna。
[0052]
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用，所有这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的dna含量可能并不完全相同。包括与在最初转化的细胞中筛选出的具有相同功能或生物活性的变体后代。在打算使用不同名称的地方，从上下文中会很清楚。
[0053]
如本文所用，术语“序列变体”是指与参考序列相比具有一个或多个改变的任何序列，其中参考序列是序列表中列出的任何序列，即seq id no：1至seq id no：104。因此，术语“序列变体”包括核苷酸序列变体和氨基酸序列变体。对于核苷酸序列上下文中的序列变体，参考序列也是核苷酸序列，而对于氨基酸序列上下文中的序列变体，参考序列也是氨基酸序列。如本文所用，“序列变体”与参考序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。除非另有说明，否则通常根据参考序列(即申请中所述的序列)的全长计算序列同一性。如本文所指的百分比同一性可以，例如，使用blast使用ncbi指定的默认参数确定(国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[blosum 62矩阵；缺口开放罚分＝11和缺口延长罚分＝1]。核酸(核苷酸)序列上下文中的“序列变体”具有改变的序列，其中参考序列中的一个或多个核苷酸被删除或取代，或者一个或多个核苷酸插入到参考核苷酸序列的序列中。核苷酸在本文中由标准的单字母名称(a、c、g或t)指代。由于遗传密码的简并性，核苷酸序列的“序列变体”可以导致相应参考氨基酸序列的改变，即氨基酸“序列变体”或不改变。在某些实施方式中，核苷酸序列变体是不会导致产生氨基酸序列变体的变体(即，沉默突变)。然而，导致“非沉默”突变的核苷酸序列
变体也在范围内，特别是此类核苷酸序列变体，其产生与参考氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。氨基酸序列上下文中的“序列变体”具有改变的序列，其中与参考氨基酸序列相比，一个或多个氨基酸被删除、取代或插入。作为改变的结果，此类序列变体具有与参考氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。例如，对于参考序列的每100个氨基酸，变体序列具有不超过10个改变(即，缺失、插入或取代的任何组合)是与参考序列具有“至少90％同一性”。
[0054]
在某些实施方式中，虽然可能有非保守性氨基酸取代，但取代是保守性氨基酸取代，其中取代的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸具有相似的结构或化学特性。举例来说，保守性氨基酸取代涉及用另一种取代一种脂肪族或疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；使用另一种取代一种含有羟基的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)；使用另一种取代一种酸性残基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)；使用另一种替代一种含有酰胺的残基(例如，天冬酰胺和谷氨酰胺)；使用另一种替代芳香族残基(例如，苯丙氨酸和酪氨酸)；使用另一种替代一种碱性残基(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；和使用另一种替代一种小氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸)。
[0055]
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括将氨基酸序列的n末端或c末端与报告分子或酶融合。
[0056]
除非另有说明，否则在序列变体中的改变不会消除相应参考序列的功能，例如，在本案中，抗hbv抗体或hbv基因表达抑制剂(例如，sirna)的序列的功能足以分别中和hbv感染或减少hbv蛋白表达。通过使用本领域公知的计算机程序，可以找到确定哪些核苷酸和氨基酸残基分别可以被取代、插入或缺失而不消除这种功能的指导。
[0057]
如本文所用，“源自”指定核酸、肽、多肽或蛋白的核酸序列或氨基酸序列指核酸、肽、多肽或蛋白的来源。在一些实施方式中，源自特定序列的核酸序列或氨基酸序列具有与源自其的序列或其部分基本相同的氨基酸序列，其中“基本相同”包括如上定义的序列变体。在某些实施方式中，源自特定肽或蛋白的核酸序列或氨基酸序列源自特定肽或蛋白中的相应结构域。因此，“对应于”特别是指相同的功能。例如，“胞外域”对应于另一(另一蛋白)的另一“胞外域”，或“跨膜结构域”对应于(另一蛋白)的另一“跨膜结构域”。因此，“对应于”肽、蛋白和核酸的部分是本领域普通技术人员可鉴定的。同样地，“源自”其他序列的序列对于本领域普通技术人员而言通常是可鉴定的，因为在序列中具有其来源。
[0058]
在一些实施方式中，源自另一核酸、肽、多肽或蛋白的核酸序列或氨基酸序列可以与初始核酸、肽、多肽或蛋白(其所来源于的)是相同的。然而，源自另一核酸、肽、多肽或蛋白的核酸序列或氨基酸序列也可以具有相对于(其所来源于的)初始核酸、肽、多肽或蛋白的一个或多个突变，特别地，来源于另一核酸、肽、多肽或蛋白的核酸序列或氨基酸序列可以是(其所来源于)的初始核酸、肽、多肽或蛋白的如上所述的功能序列的变体。例如，在肽/蛋白中，一个或多个氨基酸残基可以被其他氨基酸残基取代或者一个或多个氨基酸残基可以发生插入或缺失。
[0059]
如本文所用，术语“突变”指与参考序列(例如，相应基因组序列)相比，核酸序列和/或氨基酸序列中的改变。例如，与基因组序列相比，突变可以是例如(天然存在的)体细
胞突变、自发突变、诱发突变(例如，通过酶、化学物质或辐射所诱导)、或通过定点诱变(用于在核酸序列和/或氨基酸序列中制备特异性和刻意的改变的分子生物学方法)所获得的突变。因此，术语“突变(mutation)”或“突变(mutating)”应理解为还包括例如在核酸序列或氨基酸序列中物理地制造突变。突变包括一个或多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失和插入，以及若干连续的核苷酸或氨基酸的颠倒(inversion)。为实现在氨基酸序列中的突变，可以将突变引入编码该氨基酸序列的核苷酸序列中以表达(重组)突变的多肽。突变可以通过例如通过改变(例如，通过定点诱变)编码一种氨基酸的核酸分子的密码子以产生编码不同氨基酸的密码子，或在无需使核酸分子的一个或多个核苷酸突变的情况下，通过合成序列变体(例如，通过了解编码多肽的核酸分子的核苷酸序列，并通过设计包含编码该多肽变体的核酸序列的核酸分子的合成)来实现。
[0060]
如本文所用，术语“编码序列”旨在指多核苷酸分子，其编码蛋白产物的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框架来判定，其通常以atg起始密码子开始。
[0061]
如本文所用，术语“表达”指涉及生产多肽的任何步骤，包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。
[0062]
在一些方面中，本公开内容涉及hbv基因表达抑制剂的用途。如本文所用，“hbv基因表达抑制剂”是导致hbv基因表达至少部分降低的任何药剂，如通过可从第一细胞或细胞群(其中hbv基因是经转录并已用hbv基因表达抑制剂处理使得所述hbv基因的表达已被一直)中分离或检测到的hbv mrna量与第二细胞或细胞群(与第一细胞或细胞群实质上相同但未经过这样的处理(对照细胞))相比的降低来实现。在一些实施方式中，hbv基因表达抑制剂是rnai药剂(例如，sirna)。可以通过本领域公知的方法测量hbv基因表达。除非另有说明，否则如本文中所使用的“hbv基因表达”指使用rtpcr或通过使用酶联免疫吸附测定(elisa)或免疫组织化学测量蛋白表达来判定。
[0063]
在一些方面中，本公开内容涉及降低hbv抗原负载的药剂的用途。如本文所用，“降低hbv抗原负载的药剂”指导致可从第一细胞或细胞群(已用所述药剂处理)中分离或检测到的hbv抗原量与第二细胞或细胞群(与第一细胞或细胞群实质上相同但未经过这样的处理(对照细胞))相比降低的任何药剂。在一些实施方式中，降低hbv抗原负载的药剂是rnai药剂(例如，sirna)。抗原负载可通过本领域公知的方法来测量。除非另有说明，否则如本文中所使用的“hbv抗原复杂”指通过使用elisa测量抗原(例如，hbsag)的量来判定。
[0064]
本公开内容提供了治疗hbv的联合疗法，其包括抗hbv抗体。在某些实施方式中，抗hbv抗体或其抗原结合片段结合至hbsag的抗原环区域并中和乙型肝炎病毒的感染。
[0065]
如本文所用，术语“抗体”涵盖各种形式的抗体，包括但不限于全长抗体、抗体片段、抗原结合片段、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体和基因工程化抗体(变体或突变抗体)，只要保留所述抗体的特征性质即可。在一些实施方式中，抗体是人抗体和/或单克隆抗体。在特定实施方式中，抗体是人单克隆抗体。在某些特定实施方式中，抗体是重组人单克隆抗体。如本文所用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可以互换使用，指联合疗法的抗体的任何片段，其保留抗体的抗原结合活性。抗体片段的实例包括但不限于单链抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv或scfv。更进一步地，如本文所用，术语“抗体”包括抗体及其抗原结合片段两者。
[0066]
如本文所用，“中和抗体”是能够中和，即预防、抑制、降低、阻碍或干扰病原体在宿
主中引发和/或持续感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和
……
的抗体(antibody that neutralizes)”或“中和
……
的抗体(antibodies that neutralize)”在本文中可互换使用。这些抗体可以单独或组合使用，在适当制剂后作为预防剂或治疗剂，与主动疫苗接种联合，作为诊断工具或作为本文中所述的生产工具。
[0067]
人抗体是现有所属技术领域中熟知的(van dijk,m.a.和van de winkel,j.c,curr.opin.chem.biol.5:368
‑
74(2001))。人抗体亦可在转基因动物(例如，小鼠)中生产，所述转基因动物能够在免疫后，在没有内源性免疫球蛋白产生的前提下产生全库(repertoire)或选择的人抗体。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体(参见，例如，jakobovits,a.等，proc.natl.acad.sci.usa 90:2551
‑
55(1993)；jakobovits,a.等，nature 362:255
‑
258(1993)；bruggemann,m.等，year immunol.7:3340(1993))。人抗体亦可在噬菌体展示文库中生产(hoogenboom,h.r.和winter,g.,mol.biol.227:381
‑
88(1992)；marks,j.d.等，mol biol.222:581
–
97(1991))。cole等和boerner等的技术亦可用于制备人单克隆抗体(cole等，monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,p.77(1985)；boerner,p.等，immunol.147:86
‑
95(1991))。在一些实施方式中，人单克隆抗体是通过使用如在traggiai,e.等(nat med.10(8):871
‑
5(2004))中所述改良的ebv
‑
b细胞永生化来制备。如本文所用，术语“人抗体”亦包含例如在可变区域中被修饰以产生如本文中所述的性质的此类抗体。
[0068]
联合疗法的抗体可以是任何同种型(例如，iga、igg、igm，即，κ、γ或μ重链)，但在某些特定实施方式中，抗体是igg。在igg同种型内，抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚类。在特定实施方式中，抗体是igg1。联合疗法的抗体可以具有κ或λ轻链。基于igg通过fcrn
‑
igg受体进入肝细胞的抗原非依赖性摄取，igg类型的hbsag特异性抗体亦可有利地阻断hbv和hbsag自受感染的细胞的释放。因此，igg类型的hbsag特异性抗体可细胞内结合，从而阻断hbv病毒粒子和hbsag的释放。
[0069]
如本文所用，术语“可变区”(轻链可变区(v
l
)、重链可变区(v
h
))表示抗体轻链(lc)或重链(hc)的部分(一般约在成熟抗体重链或轻链的105
‑
120个氨基末端氨基酸附近)，其包含互补性决定区(“cdr”)和框架区(“fr”)，并直接参与抗体与抗原的结合。术语“互补性决定区”和“cdr”与“高变区”或“hvr”同义，并且指本领域公知指抗体可变区内的氨基酸的非相邻序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和性。通常，在免疫球蛋白结合蛋白的各个可变区中有三个cdr；例如，对于抗体，v
h
和v
l
区通常包含六个cdr(cdrh1、cdrh2、cdrh3；cdrl1、cdrl2、cdrl3)。可将免疫球蛋白序列与编号方案(例如，kabat，eu，国际免疫遗传学信息系统(imgt)和aho)进行比对，其可以允许使用抗原受体编号和受体分类(anarci)软件工具(bioinformatics 15:298
‑
300(2016))标注等效位置和对不同分子进行比较。应当理解的是，在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段可以包含全部或部分重链(hc)、轻链(lc)或者这两者。例如，全长完整igg抗体单体通常包含v
h
、ch1、ch2、ch3、vl和cl。
[0070]
在某些实施方式中，根据本公开内容的联合疗法的抗hbv抗体，或其抗原结合片段是纯化的抗体、单链抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv或scfv。因此，联合疗法的抗体可以是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、重组抗体和/或纯化的抗体。本公开内容还提供了抗体的片段，特别是保留抗体的抗原结合活性的片段。此类片段的实例包括但不限于单链抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv或scfv。尽管在一些地方，本公开内容可明确指抗体的一个或多个抗原结
合片段、一个或多个抗体片段、一个或多个变体和/或一个或多个衍生物，但如本文中所使用的，术语“抗体”或“联合疗法的抗体”包括所有类别的抗体，即，抗体的一个或多个抗原结合片段、一个或多个抗体片段、一个或多个变体和一个或多个衍生物。
[0071]
抗体的片段可以从抗体通过包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过化学还原切割二硫键的方法来获得。或者，抗体的片段可以通过重链或轻链的部分序列的克隆和表达来获得。本公开内容还涵盖来源于本公开内容的抗体的重链和轻链的单链fv片段(scfv)。例如，本公开内容包括scfv，其包含来自本公开内容的抗体的cdr。还包括的是重链或轻链单体和二聚体、单域重链抗体、单域轻链抗体以及单链抗体，例如，单链fv，在该单链fv中的重链和轻链可变结构域是通过肽接头接合。
[0072]
本公开内容的抗体片段可以赋予单价或多价相互作用并包含在如上所述的各种结构中。例如，可以合成scfv分子以产生三价的“三体”或四价的“四体”。scfv分子可包含导致产生二价微型抗体的fc区的结构域。此外，抗体/抗体片段的序列可以是多特异性分子的组分，其中所述序列靶向如本文中所述的表达，并且所述多特异性分子的其他区域与其他靶点结合。示例性多特异性分子包括但不限于双特异性fab2、三特异性fab3、双特异性scfv和双体(holliger和hudson,nature biotechnology 9:1126
‑
36(2005))。
[0073]
根据本公开内容的抗体可以纯化形式提供。通常，抗体将存在于实质上不含其他多肽的组合物中，例如其中少于90％(以重量计)、通常少于60％，且更通常少于50％的组合物是由其他多肽构成。
[0074]
在实施方式中，本公开内容的抗体和抗原结合片段可以是多特异性的(例如，双特异性、三特异性、四特异性等)，并且可如本文中所公开的以任何多特异性形式提供。在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段是多特异性抗体，如双特异性或三特异性抗体。双特异性抗体的形式公开在，例如，spiess等(mol.immunol.67(2):95(2015))，以及brinkmann和kontermann(mabs 9(2):182
‑
212(2017))中，所述双特异性形式以及制备其的方法是以引用方式并入本文的，并且包括，例如，双特异性t细胞接合子(bite)、dart、杵臼(knobs
‑
into
‑
holes)(kih)组装、scfv
‑
ch3
‑
kih组装、kih共同轻链抗体、tandab、三重体、tribi微型体、fab
‑
scfv、scfv
‑
ch
‑
cl
‑
scfv、f(ab’)2
‑
scfv2、四价hcab、内体、crossmab、双重作用fab(daf)(二合一或四合一)、dutamab、dt
‑
igg、电荷配对、fab臂交换、seed体、triomab、luz
‑
y组装、fcab、κλ体、正交fab、dvd
‑
igg、igg(h)
‑
scfv、scfv
‑
(h)igg、igg(l)
‑
scfv、scfv
‑
(l)igg、igg(l,h)
‑
fv、igg(h)
‑
v、v(h)
‑
igg、igg(l)
‑
v、v(l)
‑
igg、kih igg
‑
scfab、2scfv
‑
igg、igg
‑
2scfv、scfv4
‑
ig、zybody和dvi
‑
igg(四合一)。双特异性或多特异性抗体可以包含本公开内容的hbv和/或hdv特异性结合结构域与本公开内容的另一种此类结合结构域的组合，或与hbv和/或hdv(例如，在相同或不同表位处)特异性结合的不同结合结构域的组合，或与不同抗原特异性结合的结合结构域的组合。
[0075]
如本文所用，术语“疫苗”一般理解为预防性或治疗性物质，其提供至少一种抗原或免疫原。抗原或免疫原可来源于适用于疫苗接种的任何物质。例如，抗原或免疫原可来源于病原体，如来自细菌或病毒粒子等，或来自肿瘤或癌性组织。抗原或免疫原刺激机体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。特别地，“抗原”或“免疫原”通常指可被免疫系统(例如，适应性免疫系统)识别，且其能够触发抗原特异性免疫应答(例如，通过形成抗体和/或抗原特异性t细胞作为适应性免疫系统的一部分)的物质。通常，抗原可以是或可以包含由
mhc呈递至t细胞的肽或蛋白。
[0076]
剂量通常以相对于体重的方式表示。因此，以[g、mg或其他单位]/kg(或g、mg等)表示的剂量通常是指[g、mg或其他单位]“每kg(或g、mg等)体重”，即使术语“体重”未明确提及。
[0077]
如本文所用，与术语“hbv”可互换使用的“乙型肝炎病毒”是指术语肝病毒科的熟知的非细胞病变、肝向性dna病毒。hbv基因组是部分双链，具有下列四个重叠阅读框架(其在本文中可称为“基因”、“开放阅读框架”或“转录物”)的环状dna：c、x、p和s。核心蛋白(hbcag)是由基因c编码。乙型肝炎e抗原(hbeag)是通过前核心(pre
‑
c)蛋白的蛋白水解处理来产生。dna聚合物是由基因p所编码。基因s是编码表面抗原(hbsag)的基因。hbsag基因是一个长的开放阅读框架，其在框内含有三个“起始”(atg)密码子，产生三种不同大小的多肽，称为大的、中的和小的s抗原(pre
‑
s1 pre
‑
s2 s、pre
‑
s2 s或s)。表面抗原除了装饰hbv的包膜以外，还是亚病毒粒子的一部分，所述亚病毒粒子与病毒粒子相比呈现出过量产生，并在免疫耐受和螯合抗hbsag抗体中发挥作用，从而允许感染性粒子逃避免疫检测。由基因x编码的非结构蛋白的功能并未完全了解，但其在转录转活化和复制中发挥作用，并与肝癌的发展相关。已确定了hbv的八个基因型(指定为a至h)并提出另外两个基因型i和j，其各自具有不同地理分布。术语“hbv”包括hbv的任何基因型(a至j)。hbv基因组的参考序列的完整编码序列可在例如genbank基因登录号gi:21326584和gi:3582357中找到。c、x、p和s蛋白的氨基酸序列可参见例如ncbi登录号yp_009173857.1(c蛋白)；yp_009173867.1和baa32912.1(x蛋白)；yp_009173866.1和baa32913.1(p蛋白)；和yp_009173869.1、yp_009173870.1、yp_009173871.1和baa32914.1(s蛋白)。hbv mrna序列的另外的实例可以使用公开可得的数据库容易地获得，例如，genbank、uniprot和omim。可在http://www.hpa
‑
bioinformatics.org.uk/hepseq/main.php进入国际乙型肝炎病毒株数据库。如本文所用，术语“hbv”亦指hbv基因组的天然存在的dna序列变体，即，基因型a至j及其变体。
[0078]
ii.hbv蛋白表达抑制剂和递送系统
[0079]
本公开内容提供了用于治疗hbv的联合疗法的hbv蛋白表达抑制剂。在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂是rnai药剂。如本文所用，术语“rna干扰剂”或“rnai药剂”指含有本文中所定义的术语的包含rna的药剂，且其通过rna诱导沉默复合物(risc)途径介导rna转录物的靶向切割。在一些实施方式中，本文中所述的rnai药剂影响hbv基因表达的抑制。
[0080]
在一个方面中，rna干扰剂包括单链rna，其与靶rna序列相互作用以定向该靶rna的切割。不希望受到特定理论的束缚，引入至植物和无脊椎动物细胞中的长双链rna(dsrna)是通过iii型核酸内切酶(称为dicer)而断裂成sirna(sharp等，genes dev.15:485(2001))。dicer是一种核糖核酸酶iii样酶，其将dsrna处理成具有特征性两个碱基3’悬突的19至23个碱基对的短干扰rna(sirna)(bernstein等，nature 409:363(2001))。然后，将该sirna引入至rna诱导沉默复合物(risc)中，在此处一个或多个解旋酶将该sirna双螺旋解开，而使该互补的反义链能够引导靶点的识别(nykanen等，cell 107:309(2001))。当结合至适合的靶mrna时，risc内的一个或多个核酸内切酶会切割该靶点以诱导沉默(elbashir等，genes dev.15:188(2001))。因此，在一个方面中，本文所述的技术涉及一种单链rna，其促进risc复合物的形成以影响靶基因的沉默。
[0081]
只要其指hbv基因，术语“沉默”、“抑制其表达”、“下调其表达”、“压制其表达”等在
nacl、40mm pipes ph 6.4、1mm edta、50℃或70℃，持续12
‑
16小时，随后洗涤。可应用其他条件，如在生物体内可能发生的生理上相关的条件。本领域技术人员将能够根据所述杂交核苷酸的最终应用来判定两条序列的互补性测试的最适条件的设定。
[0086]
rnai药剂内的互补序列(例如，如本文中所述的sirna内)包括在一个或两个核苷酸序列的整体长度上，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。此类序列在本文中可以称为相对于彼此“完全互补”。然而，当本文中第一序列相对于第二序列被称为“实质上互补”时，两条序列可以是完全互补，或其可与多达30个碱基对的双螺旋杂交后形成一个或多个，但通常不超过5个、4个、3个或2个错配碱基对，同时保留在对其最终应用(例如，通过risc通路的基因表达的抑制)最相关的条件下的杂交能力。然而，当两个寡核苷酸被设计为在杂交后形成一个或多个单链悬突时，对于测定互补性而言，不应认为此类悬突是错配。例如，包含一个21个核苷酸长度的寡核苷酸和另一个23个核苷酸长度的寡核苷酸的sirna，其中，该较长的寡核苷酸包含与该较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，对于本文中所述的目的，该sirna仍可称为“完全互补”。
[0087]
如本文所用，“互补”序列还可以包括，或完全形成自非沃森
‑
克里克碱基对和/或形成自非天然和经修饰的核苷酸的碱基对，只要满足以上关于其杂交能力的要求即可。此类非沃森
‑
克里克碱基对包括但不限于g:u wobble或hoogstein配对。
[0088]
术语“互补”、“完全互补”和“实质上互补”在本文中可用于关于sirna的有意义链与反义链之间的碱基配对，或rnai药剂的反义链与靶序列之间的碱基配对，由其使用的上下文中将可以理解。
[0089]
如本文所用，与信使rna(mrna)的至少部分“实质上互补”的多核苷酸是指与所关注的mrna(例如，编码hbv蛋白的mrna)的一段相邻部分实质上互补的多核苷酸。例如，如果序列是与hbv mrna的不中断部分实质上互补，则多核苷酸是与hbv mrna的至少一部分互补。
[0090]
a.sirna
[0091]
在一些实施方式中，rnai药剂包含sirna。如本文所用，术语“sirna”指包括具有杂交双螺旋区的rna分子或分子复合物的rnai，所述杂交双螺旋区包含两个反向平行且实质上互补的核酸链，其将被称为相对于靶rna具有“正义”和“反义”方向。双螺旋区可以是任何长度，只要允许通过risc途径特异性降解所需的靶rna即可，但是通常范围将是9至36个碱基对的长度，例如，15
‑
30个剪接对的长度。考虑到双螺旋在9至36个剪接对之间，双螺旋可以是在该范围内的任何长度，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个以及其间任何子范围，包括但不限于15
‑
30个碱基对、15
‑
26个碱基对、15
‑
23个碱基对、15
‑
22个碱基对、15
‑
21个碱基对、15
‑
20个碱基对、15
‑
19个碱基对、15
‑
18个碱基对、15
‑
17个碱基对、18
‑
30个碱基对、18
‑
26个碱基对、18
‑
23个碱基对、18
‑
22个碱基对、18
‑
21个碱基对、18
‑
20个碱基对、19
‑
30个碱基对、19
‑
26个碱基对、19
‑
23个碱基对、19
‑
22个碱基对、19
‑
21个碱基对、19
‑
20个碱基对、20
‑
30个碱基对、20
‑
26个碱基对、20
‑
25个碱基对、20
‑
24个碱基对、20
‑
23个碱基对、20
‑
22个碱基对、20
‑
21个碱基对、21
‑
30个碱基对、21
‑
26个碱基对、21
‑
25个碱基对、21
‑
24个碱基对、21
‑
23个碱基对和21
‑
22个碱基对。在细胞中通过用dicer和类似酶处理所产生的sirna通常是在19至22个碱基对长
度的范围内。术语“双链rna”或“dsrna”在本文中亦同义地用于指如上所述的sirna。
[0092]
sirna的双螺旋区的一条链包含与靶rna的区域实质上互补的序列。形成双螺旋结构的两条链可以是来自具有至少一个自身互补区的单一rna分子，或可形成自两个或更多个不同的rna分子。当双螺旋结构区是形成自单一分子的双链时，该分子可具有被单一核苷酸链(本文中称为“发夹环”)所分隔的双螺旋区，该单一核苷酸链在一条链的3’端与形成双螺旋结构的相应另一条链的5’端之间。该发夹环可以包含至少一个未配对核苷酸，在一些实施方式中，该发夹环可以包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对核苷酸。当sirna的两条实质上互补的链是由不同rna分子组成时，这些分子不需要，但可以是共价连接的。当这两条链是以除发夹环以外的方式共价连接时，则该连接结构被称为“接头”。
[0093]
术语“反义链”或“向导链”指rnai药剂中的链，例如，sirna，其包括与靶序列实质上互补的区域。如本文所用，术语“互补性区域”指在反义链上与如本文中所定义的序列(例如，靶序列)实质上互补的区域。当互补性区域与靶序列不完全互补时，错配可在分子的内部区域或末端区域中。
[0094]
通常，最大可容忍的错配是在末端区域中，例如，在5’和/或3’末端的5、4、3或2个核苷酸内。
[0095]
如本文所用，术语“正义链”或“随从链”指rnai的链，其包括与反义链(如该术语在本文中所定义)的区域实质上互补的区域。
[0096]
在另一个方面中，药剂是单链反义rna分子。该反义rna分子可以具有与靶点互补的15至30个核苷酸。例如，该反义rna分子可以具有来自本文中所公开的反义序列中的一个至少15、16、17、18、19、20、21或更多个相邻核苷酸的序列。
[0097]
本领域技术人员将认识到的是，术语“rna分子”或“核糖核酸分子”不仅涵盖在自然界中表达或发现的rna分子，亦涵盖rna的类似物和衍生物，其包含一种或多种如本文中所述或如本领域中公知的核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，而“核糖核苷酸”指具有一个、两个或三个磷酸酯部分的核糖核苷。然而，如本文中所使用的术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可被认为是相等的。可在核碱基结构中或在核糖磷酸酯骨架结构中修饰rna，例如下文更详细的描述的。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的sirna分子保留形成双螺旋的能力。作为非限制性实例，rna分子亦可包括至少一个经修饰的核糖核苷，包括但不限于2'
‑
o
‑
甲基修饰的核苷、包含5’硫代磷酸酯基团的核苷、连接至胆固醇基衍生物或十二酸双癸酰胺基团的末端核苷、锁定核苷、无碱基核苷、2'
‑
脱氧
‑
2'
‑
氟修饰的核苷、2'
‑
氨基
‑
修饰的核苷、2'
‑
烷基
‑
修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯、或包含核苷的非天然碱基，或其任何组合。或者，rna分子可以包含至少两个经修饰的核糖核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、或更多个、直到该sirna分子的整个长度。对于rna分子中此类多个经修饰的核糖核苷的每一个而言，修饰不需要是相同的。在一些实施方式中，考虑供用于本文中所述的方法和组合物中的经修饰的rna是肽核酸(pna)，其具有形成所需双螺旋结构的能力且其允许或介导靶rna通过risc途径的特异性降解。
[0098]
在一些实施方式中，经修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。例如，rnai药剂可以包含一个或多个脱氧核糖核苷，包括例如，一个或多个脱氧核糖核苷悬突，或在sirna的双链
部分内的一个或多个脱氧核糖核苷。然而，如本文所使用，术语“rnai药剂”不包括完全dna分子。
[0099]
如本文所用，术语“核苷酸悬突”指从rnai药剂(例如，sirna)的双螺旋结构凸出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当sirna中的一条链的3’端延伸超过另一条链的5’端或反之亦然时，则存在核苷酸悬突。sirna可以包含至少一个核苷酸的悬突，替代地，该悬突可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或者更多个。核苷酸悬突可以包含核苷酸/核苷类似物或由其所组成，该核苷酸/核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。一个或多个悬突可以位于正义链、反义链或其任何组合上。另外，悬突的一个或多个核苷酸可以存在于sirna的反义链或正义链的5’端、3’端或这两端上。
[0100]
在一些实施方式中，sirna的反义链在3’端和/或5’端处具有1
‑
10个核苷酸的悬突。在一些实施方式中，sirna的正义链在3’端和/或5’端处具有1至10个核苷酸酸的悬突。在一些其他实施方式中，在悬突中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
[0101]
在一些实施方式中，sirna的至少一个末端具有1至4个单链核苷酸的悬突，通常是1或2个核苷酸。具有至少一个核苷酸的悬突的sirna相对于其平末端对应物可以具有出乎意料的优越抑制性质。
[0102]
如本文中参照sirna所使用的，术语“平端”或“平末端”意指在sirna的给定末端无未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即无核苷酸悬突。sirna的一个或两个末端可以是平端。当sirna的两个末端均是平端时，则该sirna被称为“平末端”。“平末端”sirna是在两个末端均是平端的sirna，即在该分子的任一端均无核苷酸悬突。最常见的是这种分子在其整体长度上将均是双链的。
[0103]
在某些实施方式中，本文中所述的联合疗法包括一种或多种抑制hbv基因表达的rnai药剂。在一些实施方式中，将包括短干扰核糖核酸(sirna)的rnai药剂用于抑制哺乳动物(例如，受hbv感染的人)的hbv基因的表达，其中该sirna包括具有互补性区域的反义链，该互补性区域与hbv基因表达中所形成的mrna的至少一部分互补，且其中该互补性区域是30个核苷酸长或更少，通常是19至24个核苷酸长，且如通过例如pcr或基于分支dna(bdna)的方法，或通过基于蛋白的方法如通过western印迹来检测，当该sirna与表达该hbv基因的细胞接触后，抑制该hbv基因的表达至少10％。hbv基因在细胞培养中表达或作为hbv基因表达替代物(例如，smc5/6)的细胞基因的表达(如在cos细胞中、hela细胞中、原代肝细胞中、hepg2细胞中、原代培养的细胞中或来自对象的生物样品中)可通过测量hbv mrna水平(如通过bdna或taqman测定)或通过测量蛋白水平(如通过免疫荧光分析，使用例如western印迹或流式细胞术)来测量。
[0104]
sirna包括两个rna链，其是互补的且在使用该sirna的条件下杂交以形成双螺旋结构。sirna的一条链(反义链)包括互补性区域，该区域与靶序列实质上互补，且通常是完全互补。靶序列可来源于在hbv基因的表达期间所形成的mrna的序列。另一条链(正义链)包括与该反义链互补的区域，使得当在适宜的条件下合并这两条链时，两条链杂交并形成双螺旋结构。通常，双螺旋结构是在15至30个之间(包括端值)、更通常在18至25个之间(包括端值)、另外更通常在19至24个之间(包括端值)，且通常在19至21个碱基对长度之间(包括端值)。类似地，靶序列的互补性区域是在15至30个之间(包括端值)、更通常在18至25个之间(包括端值)、另外更通常在19至24个之间(包括端值)，且通常在19至21个核苷酸长度之
间(包括端值)。在一些实施方式中，sirna是在15至20个核苷酸之间的长度(包括端值)，且在其他实施方式中，sirna是在25至30个核苷酸之间的长度(包括端值)。如本领域普通技术人员将意识到的是，靶向切割的rna的靶向区域最常见是较大rna分子(通常是mrna分子)的一部分。相关地，mrna靶点的“一部分”是具有足够长度以成为用于rnai定向切割(即，通过risc途径的切割)的底物的mrna靶点的相邻序列。具有短至9个碱基对的双螺旋的sirna在一些环境下可介导rnai定向的rna切割。最常见的靶点将是至少15个核苷酸的长度。在某些实施方式中，靶点是15
‑
30个核苷酸的长度。
[0105]
本领域技术人员将意识到的是，该双螺旋区是sirna的主要功能性部分，例如，9至36个(例如，15
‑
30个)碱基对的双螺旋区。因此，在一些实施方式中，为了达到经处理成靶向所需rna切割的功能性双螺旋(例如，15至30个碱基对)的程度，所以具有大于30个碱基对的双螺旋区的rna分子或rna分子的复合物是sirna。因此，那么，本领域普通技术人员将意识到的是，在一些实施方式中，mirna是sirna。在一些其他实施方式中，sirna不是天然存在的mirna。在一些实施方式中，可用于靶向hbv基因表达的rnai药剂不是在靶细胞中通过切割较大双链rna来产生。
[0106]
本文中所述的sirna可通过本领域中公知的标准方法合成，例如，通过使用自动dna合成仪，如从例如biosearch,applied biosystems,inc商购获得。
[0107]
在一些实施方式中，rnai药剂包含靶向并抑制hbv mrna表达的sirna。在一些实施方式中，rnai药剂包含靶向且抑制由根据ncbi参考序列nc_003977.2(genbank登录号gi:21326584)(seq id no:1)的hbv基因组所编码的mrna表达的sirna。hbv基因组的转录产生多顺反子、重叠的rna，因此，在一些实施方式中，靶向单一hbv基因的组合疗法的sirna可导致大多数或所有hbv转录物表达的显著抑制。在一些实施方式中，sirna的mrna靶点可以是由以下基因编码的mrna：p基因、nc_003977.1的核苷酸2309
‑
3182和1
‑
1625；s基因(编码l、m和s蛋白)、nc_003977的核苷酸2850
‑
3182和1
‑
837；x蛋白，nc_003977的核苷酸1376
‑
1840；和/或c基因，nc_003977的核苷酸1816
‑
2454。
[0108]
在一些实施方式中，sirna靶向且抑制由hbv的x基因所编码的mrna的表达。在一些实施方式中，rnai药剂或sirna靶向由hbv基因组的一部分所编码的mrna，该hbv基因组包含序列gtgtgcacttcgcttcac(seq id no:2)，其对应于nc_003977.2(genbank登录号gi:21326584)(seq id no:1)的核苷酸1579
‑
1597。
[0109]
在又一个实施方式中，sirna具有包含5'
‑
gugugcacuucgcuucaca
‑
3'(seq id no:3)的正义链和包含5'
‑
ugugaagcgaagugcacacuu
‑
3'(seq id no:4)的反义链。
[0110]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含含有正义链和反义链的sirna，其中该正义链包含seq id no:3，或与seq id no:3差异不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个核苷酸的序列；且其中该反义链包含seq id no:4，或与seq id no:4差异不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个核苷酸的序列。
[0111]
在一个方面中，sirna将包括至少两条核苷酸序列，正义和反义序列，籍此：正义序列包含seq id no:3，且对应的反义序列包含seq id no:4。在该方面中，两条序列中的一个是与这两条序列中的另一个互补的，且该序列中的一个是与hbv基因表达中所产生的mrna的序列实质上互补。因此，在该方面中，sirna将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述正义链，而第二个寡核苷酸被描述为正义链的对应反义链。如本文中其他地方所描述的
和如本领域公知的，与位于单独的寡核苷酸上相反，sirna的互补序列还可以包含作为单一核酸分子的自身互补区域。
[0112]
在又一个实施方式中，sirna具有正义链，其包含5'
‑
gguggacuucucucaauuuua
‑
3'(seq id no:106)，和反义链，其包含5'
‑
uaaaauugagagaaguccaccac
‑
3'(seq id no:107)。
[0113]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含含有正义链和反义链的sirna，其中该正义链包含seq id no:106，或与seq id no:106差异不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个核苷酸的序列；且其中该反义链包含seq id no:107，或与seq id no:107差异不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个核苷酸的序列。
[0114]
在一个方面中，sirna将包括至少两条核苷酸序列，正义和反义序列，籍此：正义序列包含seq id no:106，且对应的反义序列包含seq id no:107。在该方面中，两条序列中的一个是与这两条序列中的另一个互补的，且该序列中的一个是与hbv基因表达中所产生的mrna的序列实质上互补。因此，在该方面中，sirna将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述正义链，而第二个寡核苷酸被描述为正义链的对应反义链。如本文中其他地方所描述的和如本领域公知的，与位于单独的寡核苷酸上相反，sirna的互补序列还可以包含作为单一核酸分子的自身互补区域。
[0115]
本领域技术人员将了解的是，具有在约20至23个之间，但特别是21个碱基对的双螺旋结构的sirna已被誉为在诱发rna干扰中特别有效(elbashir等，embo 20:6877
‑
88(2001))。然而，其他人已发现更短或更长的rna双螺旋结构也可能是有效的。在上文所述的实施方式中，本文所述的sirna可以包括至少一个长度最短为21个核苷酸的链。在一些实施方式中，具有seq id no:3、seq id no:4、seq id no:106或seq id no:107中的一个序列，在一端或两端上仅减去几个核苷酸的更短双螺旋如与上述sirna相比是类似地有效。因此，sirna具有来自seq id no:3或seq id no:4中的一个或两个至少15、16、17、18、19、20个或更多个相邻核苷酸的部分序列，且根据本文中所述的技术，预期其抑制hbv基因表达的能力与包含全长序列的sirna的抑制差异不超过5、10、15、20、25或30％。亦在本公开内容中的是具有来自seq id no:106和seq id no:107中的一个或两个的至少15、16、17、18、19、20个或更多个相邻核苷酸的部分序列的sirna，且根据本文中所述的技术，预期其抑制hbv基因表达的能力与包含全长序列的sirna的抑制差异不超过5、10、15、20、25或30％。
[0116]
此外，本文中提供的sirna鉴别出在hbv基因转录物中易受risc接到的切割影响的位点。这样，本文中所述的技术进一步表征靶向此类序列中的一个内的rnai药剂。如本文所用，如果rnai促进转录物在特定位点内任何地方的切割，则称rnai药剂靶向rna转录物内的特定位点。在一些实施方式中，rnai药剂包括来自seq id no:3和seq id no:4的序列中的一个或两个至少15个相邻核苷酸，所述相邻核苷酸与从hbv基因中的所选序列相邻的区域取得的另外的核苷酸序列偶联。在一些实施方式中，rnai药剂包括来自seq id no:106和seq id no:107的序列中的一个或两个至少15个相邻核苷酸，所述相邻核苷酸与从hbv基因中的所选序列相邻的区域取得的另外的核苷酸序列偶联。
[0117]
尽管靶序列通常是15
‑
30个核苷酸长度，但是在此范围内的特定序列对定向切割任何给定靶rna的适用性存在广泛改变。本文中列出不同软件包以及指导原则提供针对任何给定基因靶点的鉴别最佳靶序列的指导，但亦可采用经验方法，其中将给定大小(作为非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“罩”被照字面地或象征性地(包括例如，电脑模拟)放
置在靶rna序列上，以鉴别可作为靶序列的大小范围内的序列。通过将序列“窗口”逐渐移动到初始靶序列位置上游或下游的一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到针对所选的任何给定靶尺寸鉴定出完整的可能序列集。该过程，再加上所鉴定序列的系统性合成和测试(使用如本文中所述或如本领域中公知的检测)以鉴定出最佳执行的那些序列，可鉴定出当用rnai药剂靶向时接到靶点基因表达的最佳抑制的那些rna序列。预期的是，抑制效率的进一步最佳化可通过沿给定序列的上游或下游逐步地“窗口步移”一个核苷酸以鉴定出具有相等或更好抑制性质的序列来实现。
[0118]
此外，可以预期的是，对于鉴定的任何序列(例如，seq id no:3、seq id no:4、seq id no:106或seq id no:107)可通过系统地添加或移除核苷酸以产生更长或更短的序列，并测试这些以及通过从这点开始沿靶rna向上或向下步移动更长或更短序列窗口所产生的那些序列，以实现进一步最佳化。再次，将此产生新候选靶点的方法与在本领域中公知的或如本文所述的抑制检测中基于那些靶序列进行的rnai药剂的有效性测试结合，可导致进一步改善抑制的效率。更进一步地，此类最佳化的序列可通过例如引入如本文中所述或如本领域中公知的经修饰的核苷酸，添加或改变悬突，或如本领域中公知的和/或本文中所讨论的其他修饰来调整，以进一步最佳化作为表达抑制剂的该分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体的释放等)。
[0119]
如本文所述的rnai药剂可以包含一个或多个与靶序列的错配。在一些实施方式中，如本文所述的rnai药剂包含不超过3个错配。在一些实施方式中，如果rnai药剂的反义链包含与靶序列的错配，则错配区域不会位于互补性区域的中心。在特定实施方式中，如果rnai药剂的反义链包含与靶序列的错配，则该错配被局限于在距互补性区域的5’或3’端的最后5个核苷酸内。例如，对于与hbv基因的区域互补的23个核苷酸rnai药剂的rna链而言，rna链在中央13个核苷酸内不可含有任何错配。可以使用本文中所述的方法或本领域中公知的方法判定含有与靶序列错配的rnai药剂是否有效抑制hbv基因表达。考量具有错配的rnai药剂在抑制hbv基因的表达中的功效是重要的，特别是如果已知在hbv中的特定互补性区域具有多态序列变异时。
[0120]
b.化学修饰的rnai药剂
[0121]
在一些实施方式中，rnai药剂(例如，sirna)的rna经化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。在本文所述技术中表征的核酸可通过本领域中充分建立的方法合成和/或修饰，如在"currentprotocols in nucleic acid chemistry,"beaucage,s.l.等(编著)，john wiley&sons,inc.,new york,ny,usa中所描述的那些，其方法通过引用并入本文。
[0122]
例如，修饰包括(a)末端修饰，例如，5’末端修饰(磷酸化、缀合、倒置连接等)、3’末端修饰(缀合、dna核苷酸、倒置连接等)，(b)碱基修饰，例如，替代为稳定化的碱基、去稳定化的碱基、或与扩充的配偶体库进行碱基配对的碱基、除去的碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基，(c)糖修饰(例如，在2’位置或4’位置)或糖的替代，以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或替代。在本文所述的实施方式中使用的rna化合物的具体实例包括但不限于含有经修饰的骨架或没有天然核苷酸间连接的rna。具有经修饰的骨架的rna尤其包括骨架中不具有磷原子的那些。对于本说明书的目的，并且如有时本领域中所提及的，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰的rna视为寡核苷。在特定实施方式中，经修饰的
rna将在其核苷间骨架中具有磷原子。
[0123]
给定化合物中所有位置并不需一律经修饰，且事实上，可在单一化合物中或甚至在rnai药剂内的单一核苷处引入超过一种前述修饰。本文所述的技术还包括是嵌合化合物的rnai药剂化合物。在本公开内容的背景下，“嵌合”rnai药剂化合物或“嵌合体”是rnai化合物，如sirna，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个由至少一个单体单元构成，即在sirna化合物的情况下的核苷酸。这些rnai药剂通常含有至少一个区域，其中所述rna被修饰以赋予该rnai药剂增加的核酸酶降解抗性、增加细胞摄取和/或增加与靶核酸的结合亲和性。可以将rnai药剂的另外的区域作为能够切割rna:dna或rna:rna杂合体的酶作为底物。举例来说，rnase h是一种细胞核酸内切酶，其切割rna:dna双螺旋的rna链。因此，rnase h的活化导致该rna靶点的切割，从而大幅增强rnai抑制剂基因表达的效率。所以，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯去氧sirna相比，当使用嵌合sirna时，用更短的rnai药剂通常可以获得相当的结果。rna靶点的切割可通过凝胶电泳和(如有需要)本领域中公知的相关核酸杂交技术进行常规检测。
[0124]
经修饰的rna骨架包括例如具有正常3
’‑5’
连接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯(包括3
’‑
亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯)、亚磷酸酯、磷酰胺酸酯(包括3
’‑
氨基磷酰胺酸酯和氨基烷基磷酰胺酸酯)、硫代磷酰胺酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯，这些酯的2
’‑5’
连接类似物以及具有反极性的那些酯，其中核苷单元的相邻对是连接3'
‑
5'至5'
‑
3'或2'
‑
5至'5'
‑
2'。还包括各种盐、混合盐以及游离酸形式。
[0125]
教导制备上述含磷连接的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利re39464；其每一个通过引用在此并入本文。
[0126]
不包括磷原子的经修饰的rna骨架，在其中具有通过短键烷基或环烷基的核苷间连接、混合杂原子和烷基或环烷基之间核苷间连接、或一个或多个短键杂原子或杂环的核苷间键连接所形成的骨架。这些包括具有吗啉基连接(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫甲酰基骨架；含亚烷基的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；及其他具有混合n、o、s和ch2组分部分的骨架。
[0127]
教导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439；其每一个通过引用并入本文，以用于与此类制备方法相关的教导。
[0128]
在其他实施方式中，考虑将适宜rnai模拟物用于rnai药剂中是适宜的，其中该核
苷酸单元的糖和核苷间连接(即，骨架)两者经新颖基团替代。所述碱基单元被保持以供与适当核酸靶化合物的杂交。一种此类寡聚化合物，其是已被证明具有优异杂交特性的rna模拟物，被称为肽核酸(pna)。在pna化合物中，rna的糖骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨乙基甘氨酸骨架取代。保留核碱基并且直接或间接键合至骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导rna化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262；其每一个通过引用并入本文，以用于与此类制备方法相关的教导。pna化合物的其他教导可以参见例如nielsen等(science,254:1497
‑
1500(1991))。
[0129]
在本文所述技术中表征的一些实施方式包括具有硫代磷酸酯骨架的rna和具有杂原子骨架的寡核苷，且特别地该骨架是美国专利号5,489,677中的
‑
ch2‑
nh
‑
ch2‑
、
‑
ch2‑
n(ch3)
‑
o
‑
ch2‑
[已知为亚甲基(甲基亚胺基)或mmi骨架]、
‑
ch2‑
o
‑
n(ch3)
‑
ch2‑
、
‑
ch2‑
n(ch3)
‑
n(ch3)
‑
ch2‑
和
‑
n(ch3)
‑
ch2‑
ch2‑
[其中天然磷酸二酯骨架表示为
‑
o
‑
p
‑
o
‑
ch2‑
]，以及美国专利号5,602,240中的酰胺骨架。在一些实施方式中，本文中表征的rna具有美国专利号5,034,506中的吗啉骨架结构。
[0130]
经修饰的rna还可以包含一个或多个取代的糖部分。本文中表征的rnai药剂(例如，sirna)可以在2’位置处包括以下中的一者：oh；f；o
‑
、s
‑
或n
‑
烷基；o
‑
、s
‑
或n
‑
烯基；o
‑
、s
‑
或n
‑
炔基；或o
‑
烷基
‑
o
‑
烷基；其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的c1至c
10
烷基或c2至c
10
烯基和炔基。示例性的适宜取代包括o[(ch2)
n
o]
m
ch3、o(ch2).
n
och3、o(ch2)
n
nh2、o(ch2)
n
ch3、o(ch2)
n
onh2和o(ch2)
n
on[(ch2)
n
ch3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施方式中，sirna在2’位置处包括以下中的一者：c1至c
10
低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、o
‑
烷芳基或o
‑
芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的硅基、rna切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善rnai药剂的药代动力学性质的基团、或用于改善rnai药剂的药效动力学性质的基团以及其他具有类似性质的取代基。在一些实施方式中，修饰包括2'
‑
甲氧基乙氧基(2'
‑
o
‑
ch2ch2och3，也称为2'
‑
o
‑
(2
‑
甲氧基乙基)或2'
‑
moe)(martin等，helv.chim.acta 78:486
‑
504(1995))，即烷氧基
‑
烷氧基基团。另一种示例性修饰是2'
‑
二甲基氨基氧基乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基团，也称为2'
‑
dmaoe和2'
‑
二甲基氨基乙氧基乙基(在本领域中也称为2*
‑
o
‑
二甲基氨基乙氧基乙基或2*
‑
dmaeoe)，即2*
‑
o
‑
ch2‑
o
‑
ch2‑
n(ch2)2。
[0131]
其他示例性修饰包括2'
‑
甲氧基(2'
‑
och3)、2'
‑
氨基丙氧基(2
‑
och2ch2ch2nh2)和2'
‑
氟(2'
‑
f)。还可以在rnai药剂的rna上的其他位置处制备类似修饰，特别是3'末端核苷酸上或2'
‑
5'连接的sirna中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。rnai药剂还可以具有糖模拟物，如代替戊呋喃糖的环丁基部分。
[0132]
教导制备此类修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920；其每一个通过引用并入本文，以用于与此类制备方法相关的教导。
[0133]
rnai药剂还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未经修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸
腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，如5
‑
甲基胞嘧啶(5
‑
me
‑
c)、5
‑
羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2
‑
氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6
‑
甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2
‑
丙基和其他烷基衍生物、2
‑
硫尿嘧啶、2
‑
硫胸腺嘧啶和2
‑
硫胞嘧啶、5
‑
卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5
‑
丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6
‑
偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5
‑
尿嘧啶(假尿嘧啶)、4
‑
硫尿嘧啶、8
‑
卤代、8
‑
氨基、8
‑
硫醇基、8
‑
硫烷基、8
‑
羟基和其他8
‑
取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5
‑
卤代、特别是5
‑
溴代、5
‑
三氟甲基和其他5
‑
取代尿嘧啶和胞嘧啶、7
‑
甲基鸟嘌呤和7
‑
甲基腺嘌呤、8
‑
氮杂鸟嘌呤和8
‑
氮杂腺嘌呤、7
‑
去氮杂鸟嘌呤和7
‑
去氮杂腺嘌呤以及3
‑
去氮杂鸟嘌呤和3
‑
去氮杂腺嘌呤。其他核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的那些，在modified nucleosides in biochemistry,biotechnology and medicine(herdewijn,p.编著wiley
‑
vch,(2008))中公开的那些；在the concise encyclopedia of polymer science and engineering(第858
‑
859页，kroschwitz,j.l编著john wiley&sons(1990))中公开的那些，由englisch等(angewandte chemie,international edition,30,613(1991))公开的那些，和由sanghvi,y s.(第15章，dsrna research and applications,第289
‑
302页，crooke,s.t.和lebleu,b.编著，crc press(1993))公开的那些。这些核碱基的某些特别适用于增加本文所述技术中表征的寡聚化合物的结合亲和性。这些包括5
‑
取代的嘧啶、6
‑
氮杂嘧啶以及n
‑
2、n
‑
6和0
‑
6取代的嘌呤，包括2
‑
氨基丙基腺嘌呤、5
‑
丙炔基尿嘧啶和5
‑
丙炔基胞嘧啶。5
‑
甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双螺旋稳定性增加0.6
‑
1.2℃(sanghvi,y.s.,crooke,s.t.和lebleu,b.编著，dsrna research and applications,crc press,boca raton,pp.276
‑
278(1993))且是示例性的碱基取代，甚至特别是当与2'
‑
o
‑
甲氧基乙基糖修饰组合时。
[0134]
教导制备上述记载的某些经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088；其每一个通过引用并入本文，以用于与此类制备方法相关的教导。
[0135]
rnai药剂的rna还可以经修饰以包括一个或多个锁定核酸(lan)。锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连接该2’碳和4’碳的额外的桥。该结果有效地将该核酸“锁定”在3
’‑
内结构构型中。向sirna添加锁定核酸已显示增加sirna在血清中的稳定性并减少脱靶效应(elmen,j.等，nucleic acids research 33(l):439
‑
47(2005)；mook,o.r.等，mol cane ther 6(3):833
‑
43(2007)；grunweller,a.等，nucleic acids research 31(12):3185
‑
93(2003))。
[0136]
教导制备锁定核酸核苷酸的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；和7,399,845；其每一个通过引用并入本文，以用于与此类制备方法相关的教导。
[0137]
在某些实施方式中，联合疗法包括经修饰以包含一个或多个腺甘
‑
二醇核酸(“gna”)的sirna。腺苷
‑
gna的描述可以参见例如zhang等(jacs 127(12):4174
–
75(2005))。
[0138]
在一些实施方式中，本公开内容提供了方法和相关组合物，其中rnai是包含寡核
苷酸序列的sirna，所述寡核苷酸序列具有一个或多个修饰的核苷酸。表1中提供了如本文中使用的经修饰的核酸序列中核苷酸单体的缩写。
[0139]
表1：在经修饰的核酸序列表示中所使用的核苷酸单体的缩写。将理解的是，除非另有指示，否则当存在于寡核苷酸中时，这些单体通过5'
‑
3'
‑
磷酸二酯键互相连接。
[0140]
[0141][0142]
在一些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含sirna，其中sirna具有包含5'
‑
gsusgugfcafcfufucgcuucacal96
‑
3'(seq id no:5)的正义链，和包含5'
‑
usgfsugaafgcfgfaagugfcafcacsusu
‑
3'(seq id no:6)的反义链。
[0143]
在又一个实施方式中，sirna具有正义链，其包含5'
‑
gsusgugfcafcfufucgcuucacal96
‑
3'(seq id no:7)，和反义链，其包含5'
‑
usgfsuga(agn)gcfgfaagugfcafcacsusu
‑
3'(seq id no:8)。
[0144]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含sirna，其包含正义链和反义链，其中所述正义链包含seq id no:5或seq id no:7，或分别与seq id no:5或seq id no:7差异不
超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
[0145]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含sirna，其包含正义链和反义链，其中所述反义链包含seq id no:6或seq id no:8，或分别与seq id no:6或seq id no:8差异不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过2个核苷酸的序列。
[0146]
在一些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含sirna，其中sirna具有包含5'
‑
gsgsuggacfuufcfufcucaafufuuual96
‑
3'(seq id no:108)的正义链，和包含5'
‑
usafsaaaufugfafgagaafgufccaccsasc
‑
3'(seq id no:109)的反义链。
[0147]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂包含sirna，其包含正义链和反义链，其中所述正义链包含seq id no:108，或与seq id no:108差异不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
[0148]
c.与配体缀合的rnai药剂
[0149]
在一些实施方式中，rnai药剂包括涉及将rna与增强rnai药剂的活性、细胞分布、或细胞摄取的一个或多个配体、部分、或缀合物化学连接的修饰。此类部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(letsinger等，proc.natl.acid.sci.usa 86:6553
‑
56(1989))、胆酸(manoharan等，biorg.med.chem.let.4:1053
‑
60(1994))、硫醚，例如，绿柱石
‑
s
‑
三苯甲基硫醇(manoharan等，ann.n.y.acad.sci.660:306
‑
9(1992)；manoharan等，biorg.med.chem.let.3:2765
‑
70(1993))、硫胆固醇(oberhauser等，nucl.acids res.20:533
‑
38(1992))、脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(saison
‑
behmoaras等，embo j 10:1111
‑
18(1991)；kabanov等，febs lett.259:327
‑
30(1990)；svinarchuk等，biochimie 75:49
‑
54(1993))、磷脂质，例如，二
‑
十六烷基
‑
rac
‑
甘油或三乙基铵l,2
‑
二
‑
o
‑
十六烷基
‑
rac
‑
甘油
‑3‑
膦酸酯(manoharan等，tetrahedron lett.36:3651
‑
54(1995)；shea等，nucl.acids res.18:3777
‑
83(1990))、多胺或聚乙二醇链(manoharan等，nucleosides&nucleotides 14:969
‑
73(1995))或金刚烷乙酸(manoharan等，tetrahedron lett.36:3651
‑
54(1995))、棕榈基部分(mishra等，biochim.biophys.acta 1264:229
‑
37(1995))或十八烷基胺或己基胺基
‑
羰氧基胆固醇部分(crooke等，j.pharmacol.exp.ther.277:923
‑
37(1996))。
[0150]
在一些实施方式中，配体改变了将该配体引入其中的rnai药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方式中，如例如与不存在此类配体的物质相比，配体提供对所选的靶点例如分子、细胞、细胞类型、隔室(例如，细胞或器官的隔室、身体的组织、器官或区域)增强的亲和性。在此类实施方式中，配体将不参与双螺旋核酸中的双螺旋配对。
[0151]
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白(例如，人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。脂质还可以包括重组或合成的分子，如合成的聚合物，例如，合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸是聚赖氨酸(pll)、聚l
‑
天冬氨酸、聚l
‑
谷氨酸、苯乙烯
‑
马来酸酐共聚物、聚(l
‑
乳交酯
‑
共
‑
乙交酯)共聚物、二乙烯醚
‑
马来酸酐共聚物、n
‑
(2
‑
羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(hmpa)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯、聚(2
‑
乙基丙烯酸)、n
‑
异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、多胺、假肽
‑
多胺、肽模拟物多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子性脂质、阳离子性卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
[0152]
配体还可以包含靶向基团，例如，与特定细胞类型(如肝细胞)结合的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白a、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、n
‑
乙酰
‑
半乳糖胺、n
‑
乙酰
‑
葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素b12、维生素a、生物素或rgd肽或rgd肽模拟物。脂质的其他实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、德克萨卟啉(texaphyrin)、撒卟啉(sapphyrin))、多环芳香烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工合成的核酸内切酶(例如，edta)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1
‑
芘丁酸、二氢睾酮、l,3
‑
双
‑
0(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3
‑
丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、03
‑
(油酰基)石胆酸、03
‑
(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角肽、tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、peg(例如，peg
‑
40k)、mpeg、[mpeg]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶
‑
咪唑缀合物、四氮杂大环的eu3 配合物)、二硝基苯基、hrp和ap。
[0153]
配体可以是蛋白(例如，糖蛋白)、或肽(例如，对共配体具有特异性亲和性的分子)、或抗体(例如，与特定细胞类型(如肝细胞)结合的抗体)。配体还可以包括激素和激素受体。其还可以包括非肽物种，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、n
‑
乙酰基
‑
半乳糖胺、n
‑
乙酰基
‑
葡萄糖胺多价甘露糖和多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 map激酶的激活剂或nf
‑
kb的激活剂。
[0154]
配体可以是物质(例如，药物)，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架(例如，通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝)，增加rnai药剂进入细胞的摄取。药物可以是例如泰素(taxon)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、松胞菌素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、japlakinolide、红海海绵素a(latrunculin a)、鬼笔环肽(phalloidin)、swinholide a、indanocine或myoservin。
[0155]
在另一个方面中，配体是由靶分子(例如，肝细胞)摄取的部分，例如，维生素。示例性维生素包括维生素a、e和k。其他示例性维生素包括维生素b，例如，叶酸、b12、核黄素、生物素、吡哆醛或由靶细胞(如肝细胞)摄取的其他微生物或营养素。还包括hsa和低密度脂蛋白(ldl)。
[0156]
在一些实施方式中，与本文中所述的rnai药剂附接的配体作用是药代动力学(pk)调节剂。如本文所用，“pk调节剂”指药代动力学调节剂。pk调节剂包括亲脂物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、peg、维生素等。示例性pk调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素e、生物素等。包含多个硫代磷酸酯连接的寡核苷酸还已知与血清蛋白结合，因此在骨架中包含多个硫代磷酸酯连接的短寡核苷酸(例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)亦适用于本文中所述的技术作为配体(例如，作为pk调节配体)。此外，结合血清组分(例如，血清蛋白)适体也适合用作本文中所述的实施方式中的pk调节配体。
[0157]
(i)脂质缀合物。在一些实施方式中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对于缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运至靶细胞或
细胞膜，和/或(c)可以用于调整与血清蛋白(例如，hsa)的结合。此类脂质或基于脂质的分子可以结合血清蛋白，例如，人血清白蛋白(hsa)。结合hsa的配体允许该缀合物分布至例如身体的非肾靶组织的靶组织。例如，靶组织可以是肝，包括肝的实质细胞。还可以将结合has的其他分子用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。
[0158]
可以将基于脂质的配体用于抑制(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与hsa结合更强的脂质或基于脂质的配体时，将不太可能靶向至肾，因此也不太可能从身体清除。与hsa结合较不强的脂质或基于脂质的配体可用于使缀合物靶向至肾。
[0159]
在一些实施方式中，基于脂质的配体结合hsa。基于脂质的配体可以足够的亲和性与hsa结合，使得缀合物将会分布至非肾组织。在某些特定实施方式中，hsa
‑
配体结合是不可逆的。
[0160]
在一些其他实施方式中，基于脂质的配体较弱结合hsa或根本不结合hsa，使得缀合物将分布至肾。也可以使用靶向肾细胞的其他部分代替基于脂质的配体或除了基于脂质的配体。
[0161]
(ii)细胞渗透肽和细胞渗透剂。在另一个方面中，配体是细胞渗透剂，如螺旋形细胞渗透剂。在一些实施方式中，药剂是两亲性的。示例性药剂是肽，如tat或触角足的肽。如果药剂是肽，则其可以是经修饰的，包括肽基模拟物、反转异构体、非肽或假肽连接以及使用d
‑
氨基酸。在一些实施方式中，螺旋形剂是α螺旋形剂。在某些特定实施方式中，螺旋形剂具有亲脂性相和疏脂性相。
[0162]“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如，微生物细胞，如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞，如人细胞。渗透性微生物细胞肽可以是例如α螺旋形线性肽(例如，ll
‑
37或ceropin pi)、含二硫键的肽(例如，α
‑
防御素、β
‑
防御素或抗菌肽)或仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如，pr
‑
39或indolicidin)。
[0163]
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似天然肽的限定三维空间结构的分子。肽和肽模拟物与rnai药剂的附接可影响rnai的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5
‑
50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
[0164]
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子性肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由tyr、trp或phe组成)。肽部分可以是树枝状肽、受限肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜转位序列(mts)。示例性含疏水性mts肽是具有氨基酸序列aavallpavllallap(seq id no:9)的rfgf。含有疏水性mts的rfgf类似物(例如，氨基酸序列aallpvllaap(seq id no:10))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带包含肽、寡核苷酸和蛋白的大的极性分子穿过细胞膜。例如，已发现来自hiv tat蛋白(grkkrrqrrrppq(seq id no:11))和果蝇触角足蛋白(rqikiwfqnrrmkwk(seq id no:12))的序列能够作用为递送肽。肽或肽模拟物可由随机dna序列所编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(oboc)鉴定的肽(lam等，nature 354:82
‑
84(1991))。
[0165]
细胞渗透肽还可以包括核定位信号(nls)。例如，细胞渗透肽可以是二重两亲性肽，如mpg，其是来源于hiv
‑
1gp41的融合蛋白结构域和sv40大t抗原的nls(simeoni等，nucl.acids res.31:2717
‑
24(2003))。
[0166]
(iii)碳水化合物缀合物。在一些实施方式中，本文所述的rnai药剂寡核苷酸还包
括碳水化合物缀合物。碳水化合物缀合物对于体内核酸的递送以及适用于体内治疗用途的组合物而言可以说是有利的。如本文所用，“碳水化合物”指一种化合物，其本身是由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单元所构成的碳水化合物(其可以是线性、分支或环状)，其中氧、氮或硫原子与各个碳原子键合；或者是具有以下碳水化合物作为其一部分的化合物，该碳水化合物是由各具有至少6个碳原子之一或多个单糖单元所构成(其可以是线性、分支或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子键合。代表性碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和含有从约4
‑
9个单糖单元的寡糖)和多糖，如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定单糖包括c5及以上(在一些实施方式中，c5
‑
c8)的糖；以及二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(在一些实施方式中，c5
‑
c8)。
[0167]
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物选自以下：
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173][0174]
在本文所述的实施方式中使用的另一个代表性的碳水化合物缀合物包括但不限于，
[0175][0176]
(式xxii)，其中当x或y之一是寡核苷酸时，另一个是氢。
[0177]
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物还包含另一种配体，例如但不限于pk调节
剂、内体溶解配体或细胞渗透肽。
[0178]
(iv)接头。在一些实施方式中，本文所述的缀合物可以附接至具有各种接头的rnai药剂寡核苷酸，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
[0179]
术语“接头”或“连接基团”指连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包含直接键或原子(如氧或硫)、单元(如nr8、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh)或原子链，如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基和炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被o、s、s(o)、so2、n(r8)、c(o)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环中断或终止；其中r8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在某些实施方式中，接头在1
‑
24个原子之间、4
‑
24个原子之间、6
‑
18个原子之间、8
‑
18个原子之间或8
‑
16个原子之间。
[0180]
可切割的连接基团是一种在细胞外足够稳定的连接基团，但在进入靶细胞时被切割以释放接头保持在一起的两个部分。在某些实施方式中，可切割的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)下比在对象的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)切割快至少10倍或至少100倍。
[0181]
可切割的连接基团对切割剂敏感，例如，ph、氧化还原电位或降解分子的存在。通常，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍或发现水平或活性更高。此类切割剂的实例包括：为特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如氧化或还原酶或还原剂，如存在于细胞中的硫醇，其可通过还原作用降解氧化还原可裂解的连接基团；可产生酸性环境的内体或药剂，例如，导致ph值为5或更低的那些；可以通过充当一般酸、肽酶(可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割的连接基团的酶。可切割的连接基团，如二硫键，可能对ph敏感。人血清的ph值为7.4，而细胞内的平均ph值略低，约为7.1
‑
7.3。内体具有更酸性的ph值，在5.5
‑
6.0的范围内，溶酶体具有甚至更酸性的ph值，约为5.0。一些接头将具有可切割的连接基团，该连接基团在特定ph值下被切割，从而将阳离子脂质从细胞内的配体中释放出来，或释放到所需的细胞隔室中。
[0182]
接头可以包括可通过特定酶切割的可切割连接基团。引入接头中的可切割连接基团的类型可以取决于要靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包含酯基团的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，因此与不富含酯酶的细胞类型相比，肝细胞中的接头将被更有效地切割。其他富含酯酶的细胞类型包括肺细胞、肾皮质细胞和睾丸细胞。
[0183]
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的接头。
[0184]
在通常情况下，候选可切割连接基团的适用性可以通过检测降解剂(或条件)切割
候选连接基团的能力来评估。还可能需要检测候选可切割连接基团在血液中或与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定第一种和第二种条件之间对切割的相对敏感性，其中选择第一种以指示在靶细胞中的切割，选择第二种以指示在其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的切割。评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评估并通过对整个动物的进一步评估进行确认可能很有用。在某些实施方式中，与血液或血清(或在选定以模拟胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在选定以模拟胞内条件的体外条件下)的切割快至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少100倍。
[0185]
一类可切割的连接基团是在还原或氧化时被切割的氧化还原可切割的连接基团。可还原切割的连接基团的实例是二硫键连接基团(
‑
s
‑
s
‑
)。为了确定候选的可切割连接基团是否是合适的“可还原切割连接基团”，或者例如是否适合与特定rnai部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所述的方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(dtt)或使用本领域公知试剂的其他还原剂一起孵育来评估候选物，这些试剂模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。还可以在选择模拟血液或血清条件的条件下评价候选物。在一些实施方式中，候选化合物在血液中最多切割10％。在某些实施方式中，与血液(或在选定以模拟胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在选定以模拟胞内条件的体外条件下)的降解快至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少100倍。候选化合物的切割速率可以在选择模拟细胞内介质的条件下使用标准酶动力学分析确定，并与选择模拟细胞外介质的条件进行比较。
[0186]
基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。在胞内切割磷酸酯基团的试剂的实例是酶，如细胞内的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是
‑
o
‑
p(o)(ork)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(s)(ork)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(s)(srk)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(o)(ork)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(o)(ork)
‑
s
‑
、
‑
s
‑
p(o)(ork)
‑
s
‑
、
‑
o
‑
p(s)(ork)
‑
s
‑
、
‑
s
‑
p(s)(ork)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(o)(rk)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(s)(rk)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(o)(rk)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(s)(rk)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(o)(rk)
‑
s
‑
、
‑
o
‑
p(s)(rk)
‑
s
‑
。在某些实施方式中，基于磷酸酯的连接基团选自：
‑
o
‑
p(o)(oh)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(s)(oh)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(s)(sh)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(o)(oh)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(0)(oh)
‑
s
‑
、
‑
s
‑
p(o)(oh)
‑
s
‑
、
‑
o
‑
p(s)(oh)
‑
s
‑
、
‑
s
‑
p(s)(oh)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
ρ(o)(η)
‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(s)(h)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(o)(h)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(s)(h)
‑
o
‑
、
‑
s
‑
p(o)(h)
‑
s
‑
和
‑
o
‑
p(s)(h)
‑
s
‑
。在特定实施方式中，磷酸酯连接基团是
‑
o
‑
p(o)(oh)
‑
o
‑
。可以使用与上文所述的那些类似的方法评价这些候选物。
[0187]
酸可切割连接基团是在酸性条件下切割的连接基团。在一些实施方式中，酸可切割连接基团在ph为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中被切割，或被可用作一般酸的试剂(如酶)切割。在细胞中，特定的低ph细胞器，如内体和溶酶体，可以为可酸切割的连接基团提供切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团具有通式
‑
c＝n
‑
、c(o)o或
‑
oc(o)。在一些实施方式中，与酯的氧(烷氧基)附接的碳是芳基、取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所述的那些类似的方法评价这些候选物。
[0188]
基于酯的可切割连接基团被细胞中的酶(如酯酶和酰胺酶)切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式
‑
c(o)o
‑
或
‑
oc(o)
‑
。可以使用与上文所述的那些类似的方法评价这些候选物。
[0189]
基于肽的可切割连接基团是由酶(如在细胞中的肽酶和蛋白酶)来切割的。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基(
‑
c(o)nh
‑
)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基和亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成的酰胺键的特别类型，以产生肽和蛋白。基于肽的可切割基团通常限于在氨基酸之间形成产生肽和蛋白的肽键(即，酰胺键)，且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式
‑
nhchrac(o)nhchrbc(o)
‑
，其中ra和rb是两个相邻氨基酸的r基团。可以使用与上文所述的那些类似的方法评价这些候选物。
[0190]
具有接头的代表性碳水化合物缀合物包括但不限于，
[0191]
[0192][0193]
其中当x或y之一是寡核苷酸时，另一个是氢。
[0194]
在组合物和方法的某些实施方式中，配体是通过二价或三价分支接头附接的一个或多个“galnac”(n
‑
乙酰基半乳糖胺)衍生物。例如，在一些实施方式中，sirna缀合至galnac配体，如在下述结构中所示：
[0195][0196]
其中x是o或s。
[0197]
在一些实施方式中，sirna的正义链通过接头与附接在该正义链的3’末端处的配体缀合，所述接头如在下述结构中所示：
[0198][0199]
其中x是o或s。
[0200]
在一些实施方式中，组合疗法包括与二价或三价分支接头缀合的sirna，所述接头选自式(xxxi)
–
(xxxiv)中任一式所示结构的组：
[0201][0202]
其中：
[0203]
q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b和q5c每次出现时独立地表示0
‑
20，且其中重复单元可以是相同的或不同的；
[0204]
p
2a
、p
2b
、p
3a
、p
3b
、p
4a
、p
4b
、p
5a
、p
5b
、p
5c
、t
2a
、t
2b
、t
3a
、t
3b
、t
4a
、t
4b
、t
4a
、t
5b
和t
5c
每次出现时各自独立地为不存在、co、nh、o、s、oc(o)、nhc(o)、ch2、ch2nh或ch2o；
[0205]
q
2a
、q
2b
、q
3a
、q
3b
、q
4a
、q
4b
、q
5a
、q
5b
和q
5c
每次出现时独立地为不存在、亚烷基、或取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下一个或多个所中断或终止：o、s、s(o)、so2、n(r
n
)、c(r')＝c(r”)、c≡c或c(o)；
[0206]
r
2a
、r
2b
、r
3a
、r
3b
、r
4a
、r
4b
、r
5a
、r
5b
和r
5c
每次出现时各自独立地为不存在、nh、o、s、
lett.36:3651(1995)；shea等，nucl.acids res.18:3777(1990))、多胺或聚乙二醇链(manoharan等，nucleosides&nucleotides 14:969(1995))或金刚烷乙酸(manoharan等，tetrahedron lett.36:3651(1195))、棕榈基部分(mishra等，biochim.biophys.acta 1264:229(1995))或十八烷基胺或己基氨基
‑
羰基
‑
氧基胆固醇部分(crooke等，j.pharmacol.exp.ther.277:923(1996))。
[0213]
典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置带有氨基接头的rna的合成。然后使用适当的缀合剂或活化剂使氨基与被缀合的分子反应。缀合反应可以在rna仍然结合在固相支持物上或在rna裂解后在溶液相中进行。通过hplc纯化rna缀合物通常提供纯缀合物。
[0214]
d.rnai药剂的递送
[0215]“引入细胞中”，当指rnai药剂时，指促进或有效摄取或吸收进入细胞中，如本领域技术人员所理解的。
[0216]
rnai药剂的吸收或摄取可以通过独立扩散(unaided diffusive)或主动细胞过程，或通过辅助药剂或装置。该术语的含义不限于体外细胞；rnai药剂还可以被“引入细胞中”，其中所述细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞将包括向生物体递送。例如，对于体内递送而言，可以将rnai药剂注射进入组织部位或全身施用。体内递送还可以通过β
‑
葡聚糖递送系统进行，如在美国专利号5,032,401和5,607,677和美国专利公开号2005/0281781中所描述的那些，其以引用方式并入本文中以用于与此类递送系统有关的教导。体外引入细胞中包括本领域中公知的方法，如电穿孔和脂质体转染(lipofection)。其他方法在下文中描述或在本领域中是公知的。
[0217]
可以以多种不同方式实现向有需要的对象递送rnai药剂。体内递送可以通过直接向对象施用包含rnai药剂(例如，sirna)的组合物进行。或者，递送可以通过施用一种或多种编码和指导rnai药剂表达的载体间接进行。这些替代方案将在下面进一步讨论。
[0218]
在通常情况下，任何递送核酸分子的方法均可适用于rnai药剂(参见，例如，akhtar s.和julian rl.,trends cell.biol.2(5):139
‑
44(1992)和wo94/02595，其以引用方式并入本文中以用于与此类递送方法有关的教导)。有三个因素对于在体内成功递送rnai药剂是特别重要的：(a)递送分子的生物稳定型，(2)防止非特异性作用，以及(3)递送分子在靶组织中的累积。rnai药剂的非特异性作用可以通过局部施用来最小化，例如，通过直接注射或植入组织(作为非限制性实例，肿瘤)或局部施用制剂。对治疗部位的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于全身组织，否则可能会受到药剂的伤害或可能降解药剂，并允许施用较低的rnai药剂的总剂量。几项研究表明，当局部施用rnai药剂时，基因产物成功敲除。例如，通过在食蟹猴的玻璃体内注射(tolentino,m.j.等，retina 24:132
‑
38(2004))和在小鼠中视网膜下注射(reich,s.j.等，mol.vis.9:210
‑
16(2003))来眼内递送vegf sirna，均显示在与年龄相关的黄斑变性实验模型中预防新生血管生成。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射sirna缩小了肿瘤体积(pille,j.等，mol.ther.11:267
‑
74(2005))，并且荷瘤小鼠的生存期(kim,w.j.等，mol.ther.14:343
‑
50(2006)；li,s.等，mol.ther.15:515
‑
23(2007))。rna干扰还显示了可通过直接注射成功局部递送至cns(dorn,g.等，nucleic acids 32:e49(2004)；tan,p.h.等，gene ther.12:59
‑
66(2005)；makimura,h.等，bmc neurosci.3:18(2002)；shishkina,g.t.等，neuroscience 129:521
‑
28(2004)；thakker,e.r.等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.101:17270
‑
75(2004)；akaneya,y.等，j.neurophysiol.93:594
‑
602(2005))，以及通过鼻腔内施用成功递送至肺(howard,k.a.等，mol.ther.14:476
‑
84(2006)；zhang,x.等，j.biol.chem.279:10677
‑
84(2004)；bitko,v.等，nat.med.11:50
‑
55(2005))。对于全身性施用rnai药剂以治疗疾病而言，rna可以经修饰或替代地使用药物递送系统来递送；这两种方法均对预防sirna被体内核酸内切酶和核酸外切酶的快速降解起作用。rna或药物载体的修饰还可以允许rnai药剂组合物靶向靶组织并避免不需要的脱靶效应。rnai药剂可以通过化学缀合到亲脂性基团(如胆固醇)进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的apob的rnai药剂全身注射到小鼠体内，导致肝脏和空肠中的apob mrna的敲除(soutschek,j.等，nature 432:173
‑
78(2004))。在一些其他实施方式中，rnai药剂可以使用递送系统来递送，如纳米粒子、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统。带正电的阳离子递送系统通常促进rnai药剂(带负电)的结合并增强带负电的细胞膜处的相互作用以允许细胞有效摄取rnai药剂。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可以与rnai结合，或被诱导形成包埋rnai药剂的囊泡或胶束(参见，例如，kim,s,h.等，journal of controlled release 129(2):107
‑
16(2008))。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步阻止了rnai药剂的降解。制备和施用阳离子
‑
rnai药剂复合物的方法在本领域技术人员的能力范围内(参见，例如，sorensen,d.r.等，j.mol.biol 327:761
‑
66(2003)；verma,u.n.等，clin.cancer res.9:1291
‑
1300(2003)；arnold,a.s.等，j.hypertens.25:197
‑
205(2007)；这些方法通过引用并入本文)。用于全身性递送rnai药剂的药物递送系统的一些非限制性实例包括dotap(sorensen,d.r.等，(2003)，同上；verma,u.n.等，(2003)，同上)、oligofectamine，“固体核酸脂质颗粒”(zimmermann,t.s.等，nature 441:111
‑
14(2006))、心磷脂(chien,p.y.等，cancer gene ther.12:321
‑
28(2005)；pal,a.等，int j.oncol.26:1087
‑
91(2005))、聚乙烯亚胺(bonnet,m.e.等，pharm.res.25(12):2972
‑
82；aigner,a.,j.biomed.biotechnol.2006(4):71659(2006))、arg
‑
gly
‑
asp(rgd)肽(liu,s.,mol.pharm.3:472
‑
487(2006))和聚酰胺基胺(tomalia,d.a.等，biochem.soc.trans.35:61
‑
7(2007)；yoo,h.等，pharm.res.16:1799
‑
1804(1999))。
[0219]
如本文所用，术语“snalp”指稳定的核酸
‑
脂质颗粒。snalp代表包覆缩小的水性内部的脂质囊泡，该囊泡包含诸如rnai药剂的核酸或来自转录rnai药剂的质粒。例如，在美国专利申请公开号us2006/0240093和us2007/0135372以及在国际申请公开号wo 2009/082817中对snalp进行了描述。这些申请以引用方式并入本文，以用于与snalp有关的教导。
[0220]
在一些实施方式中，rnai与环糊精形成复合物以用于全身性施用。rnai和环糊精的施用方法和药物组合物可以参见美国专利号7,427,605，其以引用方式并入本文中，以用于与此类组合物和方法有关的教导。在一些实施方式中，编码rnai的基因是从表达载体编码和表达的。在美国专利申请号us2017/0349900a1中描述了载体的实例及其在递送rnai中的用途，其实例以引用方式并入本文。
[0221]
e.rnai药剂的药物组合物和制剂
[0222]
在一些实施方式中，本文提供了包含如本文所述的rnai药剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。包含rnai药剂的药物组合物可用于联合疗法以治疗对象的hbv感染或降低hbv病毒载量。此类药物组合物基于递送方式配制。例如，组合物可以配制成用
于通过胃肠外递送全身施用，例如，通过静脉内(iv)递送，或用于直接递送到脑实质内，例如，通过输注进入脑内，如通过连续泵输注。
[0223]“药学上可接受的载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、混悬剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药理学惰性的载剂。赋形剂可以是液体或固体，并根据计划的施用方式进行选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其他成分组合时提供所需的体积、稠度等。通常药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖和其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠)；崩解剂(例如，淀粉、羟基乙酸淀粉钠)；和润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。
[0224]
不与核酸发生有害反应的适用于非胃肠外施用的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可用于配制本公开内容的组合物。适宜的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇类、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0225]
用于局部施用核酸的制剂可以包括无菌和非无菌水溶液、在常见溶剂如醇中的非水溶液、或在液体或固体油基中的核酸溶液。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他适宜添加剂。可以使用不与核酸发生有害反应的适用于非胃肠外施用的药学上可接受的有机或无机赋形剂。
[0226]
适宜的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0227]
在一些实施方式中，含有本文所述的rnai药剂的药物组合物以足以抑制hbv基因表达的剂量施用。在通常情况下，rnai药剂的适宜剂量范围为每天每公斤接受者体重0.001至200.0毫克，更典型地为每天每公斤体重1至50mg。例如，sirna可以每单一剂量0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg施用。药物组合物可以每天施用一次，或者rnai药剂可以在一天中以适当的间隔以两个、三个或更多个亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控释制剂递送。在这种情况下，在每个亚剂量中包含的rnai药剂必须相应地更小，以达到每日总剂量。剂量单位也可以混合用于在几天内递送，例如，使用在几天内提供rnai持续释放的常规持续释放制剂。持续释放制剂在本领域中是众所周知的，并且特别适用于在特定部位递送药剂，例如可以与本文所述技术的药剂一起使用。在该实施方式中，剂量单位含有相应的多个每日剂量。
[0228]
单次剂量对hbv基因表达水平的影响可以是持久的，因此后续剂量的给药间隔不超过3、4或5天，或不超过1、2、3或4周间隔。
[0229]
技术人员将理解的是，某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的总体健康状况和/或年龄，以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗对象可以包括单次治疗或一系列治疗。如本文其他地方所述，可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试来估计本文所述技术所涵盖的单个rnai药剂的有效剂量和体内半衰期。
[0230]
小鼠模型可用于研究hbv感染，此类模型可用于rnai的体内测试，以及确定可有效
降低hbv基因表达的剂量。
[0231]
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物和制剂的施用可以是局部的(例如，通过透皮贴片)、肺部(例如，通过粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过雾化器)；气管内；鼻内；表皮和透皮；口服；或胃肠外。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内和肌肉内注射或输注；皮下施用(例如，通过植入装置)；或颅内施用(例如，通过实质内、鞘内或心室内施用)。
[0232]
在某些实施方式中，用于治疗本文公开的hbv的联合疗法中的rnai药剂是皮下递送的。
[0233]
在一些实施方式中，rnai药剂可以以靶向特定组织的方式递送，例如肝脏(例如，肝脏的肝细胞)。
[0234]
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴片、软膏、乳液、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或合乎需要的。带涂层的避孕套、手套等也可能是有用的。适宜的局部制剂包括其中以本文所述技术为特征的rnai与局部递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。适宜的脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰磷脂酰dope乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱dmpc、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)和阳离子的(例如，二油酰四甲基氨基丙基dotap和二油酰磷脂酰乙醇胺dotma)。rnai药剂可以被包裹在脂质体中或可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体形成复合物。或者，rnai药剂可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。适宜的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸、二月桂酸酯、1
‑
单癸酸甘油酯、1
‑
十二烷基氮杂环庚烷
‑2‑
酮、酰基肉碱、酰基胆碱或c1‑
20
烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯ipm)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂的实例详述于美国专利号6,747,014中，其以引用方式并入本文中，以用于与此类局部制剂有关的教导。
[0235]
囊泡，如脂质体，可用于递送本文公开的rnai药剂的制剂；这种制剂可能具有所需的特性，例如特异性和作用持续时间。如本文所用，术语“脂质体”是指由排列成球形双层或双层的两亲脂质组成的囊泡。
[0236]
脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料和水性内部形成的膜。水性部分含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优势。非阳离子脂质体虽然不能有效地与细胞壁融合，但可以在体内被巨噬细胞摄取。脂质体制剂制备中的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水体积。
[0237]
在一些实施方式中，脂质体递送可具有以下有利特性：高度可变形且能够穿过皮肤中的细孔；生物相容性和生物降解性；能够整合多种水溶性和脂溶性药物；保护内部隔室中封装的药物免于被代谢和降解的能力(rosoff,in pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，marcel dekker,inc.,new york,n.y.,第1卷，p.245(1998))；对于局部施用，减少与施用药物的高全身吸收相关的副作用，增加施用药物在所需靶点的积累，以及将多种亲水性和疏水性药物施用到皮肤中的能力；以及向皮肤递送包括高分子量核酸、镇痛剂、抗体和激素在内的药剂的能力。
[0238]
脂质体分为两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分
子相互作用形成稳定的复合物。带正电的dna/脂质体复合物与带负电的细胞表面结合并被内体化。由于内体内的酸性ph值，脂质体破裂，将其内容物释放到细胞质中(wang等，biochem.biophys.res.commun.147,980
‑
985(1987))。
[0239]
ph敏感或带负电荷的脂质体会捕获核酸，而不是与其复合。由于dna和脂质都带有类似的电荷，因此会发生排斥而不是复合物的形成。然而，一些dna被包裹在这些脂质体的水性内部。ph敏感脂质体已被用于将核酸递送至培养的细胞单层(例如，zhou等，journal of controlled release 19,269
‑
74(1992))。
[0240]
在一些实施方式中，脂质体组合物由磷脂酰胆碱(pc)形成，例如，大豆pc和卵pc。在一些实施方式中，脂质体组合物包括除天然衍生的磷脂酰胆碱之外的磷脂。例如，中性脂质体组合物可由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)形成。阴离子脂质体组合物可由二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体可由二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)形成。在另外其他实施方式中，脂质体组合物由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
[0241]
在一些实施方式中，脂质体药物制剂局部递送至皮肤。
[0242]
在一些实施方式中，用于本文所述联合疗法的rnai剂完全包封在脂质制剂中，例如，以形成splp、psplp、snalp或其他核酸
‑
脂质颗粒。如本文所用，术语“snalp”指稳定的核酸
‑
脂质颗粒，包括splp。如本文所用，术语“splp”是指包含包封在脂质囊泡内的质粒dna的核酸
‑
脂质颗粒。snalp和splp通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，peg
‑
脂质缀合物)。snalp和splp可用于全身应用，因为其在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远端部位(例如，与给药部位物理分离的部位)累积。splp包括“psplp”，其包括如国际申请公开号wo 00/03683中所述的包封的缩合剂
‑
核酸复合物。本文所述技术的颗粒的平均直径通常为约50nm至约150nm、更通常为约60nm至约130nm、更通常为约70nm至约110nm和最通常为约70nm至约90nm，并且是基本上无毒性的。此外，在一些实施方式中，当存在于核酸
‑
脂质颗粒中时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸
‑
脂质颗粒和相关制备方法公开于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；和国际申请公开号wo 96/40964中。
[0243]
在一些实施方式中，通过脂质体或其他脂质制剂递送rnai药剂，其中脂质与药物的比例(质量/质量比)(例如，脂质与sirna的比例)是在从约1:1至约50:1、从约1:1至约25:1、从约3:1至约15:1、从约4:1至约10:1、从约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。
[0244]
iii.抗hbv抗体
[0245]
本公开内容提供了用于治疗hbv的联合疗法的抗hbv抗体。
[0246]
a.结合至hbv蛋白的抗体
[0247]
在一些实施方式中，联合疗法的抗hbv抗体或其抗原结合片段结合至hbsag的抗原环区域。乙型肝炎病毒的包膜包含三种“hbv包膜蛋白”(也称为“hbsag”，“乙肝病毒表面抗原”)：s蛋白(针对“小的”，也称为s
‑
hbsag)、m蛋白(针对“中等的”，也称为m
‑
hbsag)和l蛋白(针对“大的”，也称为l
‑
hbsag)。s
‑
hbsag、m
‑
hbsag和l
‑
hbsag共享相同的c端末端(也称为“s结构域”，226个氨基酸)，其对应于s蛋白(s
‑
hbsag)并参与病毒组装和传染性。s
‑
hbsag、m
‑
hbsag和l
‑
hbsag在内质网(er)中合成、组装并作为颗粒通过高尔基体分泌。s结构域包含四个预测的跨膜(tm)结构域，其中s结构域的n端和c端都暴露于管腔(lumen)。跨膜结构域tm1
和tm2都是共翻译蛋白整合到er膜所必需的，跨膜结构域tm3和tm4位于s结构域的c端三分之一处。hbsag的“抗原环区”位于hbsag s结构域的预测tm3和tm4跨膜结果域之间，其中抗原环区包含s结构域的氨基酸101
‑
172(salisse j.和sureau c.journal of virology 83:9321
‑
8(2009))。传染性的重要决定因子存在于hbv包膜蛋白的抗原环区中。特别地，hbsag的119和125之间的残基包含一个cxxc基序，其已被证明是hbv传染性所需的最重要的序列(jaoude,g.a.和sureau,c.,journal of virology 79:10460
‑
6(2005))。
[0248]
如本文所用，hbsag的s结构域指seq id no:13所示的氨基酸序列(如下所示)或者其天然或人工序列变体。
[0249]
menitsgflgpllvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggttvclgqnsqsptsnhsptscpptcpgyrwmclrrfiiflfilllclifllvlldyqgmlpvcplipgssttstgpcrtcmttaqgtsmypsccctkpsdgnctcipipsswafgkflwewasarfswlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmmwywgpslysilspflpllpiffclwvyi
[0250]
(seq id no:13；氨基酸101
‑
172加下划线显示)
[0251]
例如，表述“s结构域的氨基酸101
‑
172”指根据seq id no:13的多肽位置101
‑
172的氨基酸残基。然而，本领域技术人员将理解的是，突变或变异(包括但不限于取代、缺失和/或添加，例如，本文所述的不同基因型的hbsag或不同的hbsag突变体)可在hbsag s结构域的氨基酸序列天然发生或人工引入hbsag s结构域的氨基酸序列而不影响其生物学性质。因此，术语“hbsag的s结构域”包含所有此类多肽，例如，包括根据seq id no:13的多肽及其天然或人工突变体。此外，当本文描述hbsag的s结构域的序列片段时(例如，hbsag的s结构域的氨基酸101
‑
172或氨基酸120
‑
130)，其不仅包括seq id no:13的相应序列片段，还有其天然或人工突变体的相应序列片段。例如，表述“来自hbsag的s结构域的101
‑
172位的氨基酸残基”包括来自seq id no:13的101
‑
172位的氨基酸残基及其突变体(天然或人工突变体)的相应片段。
[0252]
如本文所用，表述“相应的序列片段”或“相应的片段”是指在对序列进行优化比对时，位于序列相同位置的片段，即对序列进行比对以获得最高百分比的同一性。m蛋白(m
‑
hbsag)对应于由称为“pre
‑
s2”的55个氨基酸的n端结构域延伸的s蛋白。l蛋白(l
‑
hbsag)对应于由108个氨基酸的n端结构域扩展的m蛋白，称为“pre
‑
s1”(基因型d)。l蛋白的pre
‑
s1和pre
‑
s2结构域可以存在于病毒颗粒的内表面(在er的细胞质侧)，在病毒组装中起关键作用，或在外表面(在er的内腔侧)，可用于与靶细胞相互作用并且是病毒感染性所必需的。此外，hbv表面蛋白(hbsag)不仅结合到病毒体包膜中，而且还会从er
‑
高尔基体中间隔室膜自发出芽，形成空的“亚病毒颗粒”(svp)，通过分泌从细胞中释放出来。
[0253]
由于所有三种hbv包膜蛋白s
‑
hbsag、m
‑
hbsag和l
‑
hbsag都包含s结构域，因此所有三种hbv包膜蛋白s
‑
hbsag、m
‑
hbsag和l
‑
hbsag也包含“抗原环区”。因此，结合hbsag抗原环区的抗体或其抗原结合片段结合所有三种hbv包膜蛋白：s
‑
hbsag、m
‑
hbsag和l
‑
hbsag。
[0254]
此外，在一些实施方式中，联合疗法的抗hbv抗体或其抗原结合片段中和乙型肝炎病毒感染。换言之，抗体或其抗原结合片段可降低乙型肝炎病毒的病毒感染性。
[0255]
为了在实验室中研究和定量病毒感染性(或“中和”)，本领域技术人员知道各种标准的“中和测定”。对于中和测定，动物病毒通常在细胞和/或细胞系中繁殖。在本公开内容的上下文中，对于中和测定，培养的细胞可以在存在(或不存在)待测抗体的情况下与固定
量的hbv一起孵育。作为读数，可以使用分泌到细胞培养物上清液中的乙型肝炎表面抗原(hbsag)或乙型肝炎e抗原(hbeag)的水平和/或可以评估hbcag染色。在hbv中和测定的一个实施方式中，培养的细胞，例如heparg细胞，特别是分化的heparg细胞，在存在或不存在待测抗体的情况下与固定量的hbv一起孵育，例如在37℃下孵育16小时。孵育可以在培养基(例如，补充了4％peg 8000)中进行。孵育后，可以洗涤细胞并进一步培养。为了测量病毒的传染性，分泌到培养物上清液中的乙型肝炎表面抗原(hbsag)和乙型肝炎e抗原(hbeag)的水平，例如，从感染后第7天到第11天，可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)来确定。此外，可以在免疫荧光测定中评估hbcag染色。
[0256]
在一些实施方式中，抗体和抗原结合片段具有很强的中和能力。50％中和乙型肝炎病毒(hbv)所需的本公开内容的抗体浓度是，例如，约10pg/ml或更低。在某些实施方式中，50％中和hbv所需的本公开内容的抗体浓度是约5pg/ml、约1pg/ml或约750ng/ml。在某些实施方式中，50％中和hbv所需的本公开内容的抗体浓度是500ng/ml或更低，例如，450、400、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60或约50ng/ml或更低。这意味着50％的hbv中和只需要低浓度的抗体。可以使用本领域技术人员已知的标准测定来测量特异性和效力。
[0257]
在一些实施方式中，抗hbv抗体作为联合治疗的组成部分，可用于预防和/或治疗乙型肝炎。
[0258]
在一些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段促进hbsag和hbv的清除。特别地，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以促进hbv和乙型肝炎病毒的亚病毒颗粒(svp)两者的清除。hbsag或亚病毒颗粒的清除可以通过测量例如来自乙型肝炎患者的血液样品中的hbsag水平来评估。类似地，可以通过测量例如来自乙型肝炎患者的血液样品中的hbv水平来评估hbv的清除率。
[0259]
在感染hbv的患者的血清中，除了感染性颗粒(hbv)外，通常还有过量的(通常是1,000至100,000倍)仅由hbv包膜蛋白(hbsag)组成的空亚病毒颗粒(svp)，其是相对较小的球体和可变长度的细丝形式。亚病毒颗粒显示出强烈增强细胞内病毒复制和hbv基因表达(bruns,m.等，j virol 72(2):1462
‑
8(1998))。这在含hbv血清的传染性方面也很重要，因为传染性不仅取决于病毒的数量，还取决于svp的数量(bruns,m.等，jvirol72(2):1462
‑
8(1998))。此外，过量的亚病毒颗粒可以通过吸收中和抗体充当诱饵，从而延迟感染的清除。通常，实现乙型肝炎表面抗原(hbsag)消失因此被认为是理想的治疗终点和最接近治愈慢性乙型肝炎(chb)的结局。因此，在一些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段，其促进hbsag的清除，特别是乙型肝炎病毒和hbv的亚病毒颗粒的清除，能够改善乙型肝炎的治疗，特别是在慢性乙型肝炎的情况下。因此，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以有效地中和hbv，因为较少的抗体被用作诱饵的svp吸收。此外，在某些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段促进乙型肝炎病毒亚病毒颗粒的清除，并降低血清中hbv的传染性。
[0260]
根据基因组序列，hbv可分为多种基因型。迄今为止，已经定义了hbv基因组的八种众所周知的基因型(a
‑
h)。此外，还鉴定了两种新的基因型i和j(sunbul,m.,world j gastroenterol 20(18):5427
‑
34(2014))。已知基因型会影响疾病的进展，并且已经确定了基因型之间响应抗病毒治疗的差异。例如，基因型a有慢性化的趋势，而基因型c经常遇到病
毒突变。基因型d的慢性化和突变频率都很常见。而且，hbv的基因型在世界范围内分布存在差异(sunbul,m.,2014，同上)。在某些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合至hbsag基因型a、b、c、d、e、f、g、h、i和j的至少6个、至少8个或全部10个。在某些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合至hbsag基因型a、b、c、d、e、f、g、h、i和j的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。针对hbsag的不同基因型的实例包括以下：genbank登录号j02203(hbv
‑
d，ayw3)、genbank登录号fj899792.1(hbv
‑
d，adw2)、genbank登录号am282986(hbv
‑
a)、genbank登录号d23678(hbv
‑
b1日本)、genbank登录号ab117758(hbv
‑
c1柬埔寨)、genbank登录号ab205192(hbv
‑
e加纳)、genbank登录号x69798(hbv
‑
f4巴西)、genbank登录号af160501(hbv
‑
g usa)、genbank登录号ay090454(hbv
‑
h尼加拉瓜)、genbank登录号af241409(hbv
‑
i越南)和genbank登录号ab486012(hbv
‑
j婆罗洲)。不同基因型的hbsag s结构域的抗原环区的氨基酸序列如表2中所示(seq id no:14
‑
42)。
[0261]
表2：来自不同hbv基因型的抗原环序列
[0262]
[0263][0264]
在某些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合至hbsag突变体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个，所述突变体在以下抗原环区具有突变：hbsag y100c/p120t、hbsag p120t、hbsag p120t/s143l、hbsag c121 s、hbsag r122d、hbsag r122i、hbsag t123n、hbsag q129h、hbsag q129l、hbsag m133h、hbsag m133l、hbsag m133t、hbsag k141 e、hbsag p142s、hbsag s143k、hbsag d144a、hbsag g145r和hbsagn146a。这些突变体是基于hbsag基因型d的s结构域((seq id no:43)，genbank登录号fj899792)的天然存在的突变体，(其中突变的一个或多个氨基酸残基在名
称中表示)。
[0265]
menvtsgflgpllvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggttvclgqnsqsptsnhsptscpptcpgyrwmclrrfiiflfilllclifllvlldyqgmlpvcplipgssttgtgpcrtcttpaqgtsmypsccctkpsdgnctcipipsswafgkflwewasarfswlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmmwywgpslystlspflpllpiffclwvyi(seq id no:43)(抗原环区，即，氨基酸101
‑
172加下划线显示)
[0266]
在特定实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合至感染性hbsag突变体的至少12个、至少15个或全部18个，所述突变体在以下抗原环区中具有突变：hbsag y100c/p120t、hbsag p120t、hbsag p120t/s143l、hbsag c121 s、hbsag r122d、hbsag r122i、hbsag t123n、hbsag q129h、hbsag q129l、hbsag m133h、hbsag m133l、hbsag m133t、hbsag k141 e、hbsag p142s、hbsag s143k、hbsag d144a、hbsag g145r和hbsag n146a。
[0267]
在某些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合至包含hbsag的抗原环区的至少一个、至少两个、至少三个氨基酸或至少四个氨基酸的表位，其中至少两个、至少三个或至少四个氨基酸选自hbsag的s结构域的氨基酸115
‑
133、hbsag的s结构域的氨基酸120
‑
133或hbsag的s结构域的氨基酸120
‑
130。值得注意的是，氨基酸的位置(例如，115
‑
133、120
‑
133、120
‑
130)指如上文所述的hbsag的s结构域，其存在于所有三种hbv包膜蛋白s
‑
hbsag、m
‑
hbsag和l
‑
hbsag中。
[0268]
在特定实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合至在hbsag的抗原环区中的表位，由此表位由位于选自hbsag的s结构域的氨基酸位置115
‑
133、氨基酸位置120
‑
133或氨基酸位置120
‑
130的位置的一个或多个氨基酸形成。
[0269]
本文在表位上下文中使用的术语“由
……
形成”是指本公开内容的抗体或其抗原结合片段所结合的表位可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。线性或连续表位是抗体通过其线性氨基酸序列或一级结构识别的表位。相反，构象表位具有特定的三维形状和蛋白质结构。因此，如果表位是线性表位并且包含位于选自hbsag s结构域的氨基酸位置115
‑
133或氨基酸位置120
‑
133的多于一个的氨基酸，则表位所包含的氨基酸可以位于一级结构的相邻位置(即氨基酸序列中的连续氨基酸)。相反，在构象表位(3d结构)的情况下，氨基酸序列通常形成3d结构作为表位，因此，形成表位的氨基酸(或表位“包含”的氨基酸)可以是或者可以不位于一级结构的相邻位置(即，在氨基酸序列中可以是也可以不是连续的氨基酸)。在某些实施方式中，于本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合的表位仅由选自hbsag的s结构域的氨基酸位置115
‑
133、氨基酸位置120
‑
133或氨基酸位置120
‑
130的(一个或多个)氨基酸形成。在特定实施方式中，不需要位于位置115
‑
133、位置120
‑
133或位置120
‑
130之外的(其他)氨基酸来形成与本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合的表位。
[0270]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段所结合的hbsag的抗原环中的表位是由位于选自hbsag的s结构域的氨基酸位置115
‑
133、氨基酸位置120
‑
133或氨基酸位置120
‑
130的位置的两个或更多个氨基酸形成。在某些实施方式中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段所结合的hbsag的抗原环中的表位是由位于选自hbsag的s结构域的氨基酸位置115
‑
133、氨基酸位置120
‑
133或氨基酸位置120
‑
130的位置的三个或更多个氨基酸形成。在一些实施方式中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段所结合的hbsag的抗原环中的表位是由位于选自hbsag的s结构域的氨基酸位置115
‑
133、氨基酸位置120
‑
133或氨基
酸位置120
‑
130的位置的四个或更多个氨基酸形成。因此，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以与选自hbsag的s结构域的氨基酸115
‑
133、hbsag的s结构域的氨基酸120
‑
133或hbsag的s结构域的氨基酸120
‑
130的hbsag的抗原环区的至少一个、至少两个、至少三个氨基酸或至少四个氨基酸结合。在特定实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段与包含hbsag的抗原环区的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸的表位结合，其中所述至少两个、至少三个或至少四个氨基酸选自hbsag的s结构域的氨基酸120
‑
133、或氨基酸120
‑
130，且其中所述至少两个、至少三个或至少四个氨基酸位于相邻位置(即，在氨基酸序列/一级结构中的连续序列)中。
[0271]
在某些实施方式中，与根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段结合的表位是构象表位。因此，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段可与包含hbsag的抗原环区的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸的表位结合，其中所述至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸选自hbsag的s结构域的氨基酸120
‑
133、或氨基酸120
‑
130，且其中至少两个、或至少三个、或至少四个氨基酸不位于(一级结构的)相邻位置中。
[0272]
在某些特定实施方式中，本公开内容的抗体是双特异性抗体，其具有对hbsag的第一特异性和刺激免疫效应细胞的第二特异性(例如，通过靶向t细胞表面蛋白，比如例如，cd3蛋白胞外部分)。第二特异性可以引起例如细胞毒性效应或疫苗接种效应。
[0273]
b.fc部分
[0274]
在一些实施方式中，结合部分(例如，抗体或其抗原结合片段)包含fc部分。在某些实施方式中，fc部分可以来源于人类来源，例如，来自人igg1、igg2、igg3和/或igg4。在特定实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包含来源于人igg1的fc部分。
[0275]
如本文所用，术语“fc部分”是指包含或衍生自位于木瓜蛋白酶切割位点上游铰链区的免疫球蛋白重链的一部分的序列(例如，天然igg中的残基216，重链恒定区的第一个残基是114)并在免疫球蛋白重链的c端结束。因此，fc部分可以是完整fc部分或其部分(例如，结构域)。在某些实施方式中，完整的fc部分包含铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域(例如，eu氨基酸位置216
‑
446)。另外的赖氨酸残基(k)有时存在于fc部分的极端c端，但通常从成熟抗体中切割下来。fc部分内的氨基酸位置已根据kabat的eu编号系统编号(参见，例如，kabat等，"sequences of proteins of immunological interest",u.s.dept.health andhuman services,1983 and 1987)。fc部分的氨基酸位置还可以根据imgt编号系统(包括针对c结构域的独特编号和外显子编号)和kabat编号系统编号。
[0276]
在一些实施方式中，fc部分包含以下的至少一者：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域、或其变体、部分或片段。在一些实施方式中，fc部分至少包含铰链结构域、ch2结构域或ch3结构域。在其他实施方式中，fc部分是完整fc部分。人igg1同种型的示例性fc部分的氨基酸序列在seq id no:96中提供。fc部分还可以包含相对于天然存在的fc部分的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。例如，铰链结构域、ch2结构域或ch3结构域中的至少一个或其一部分可以被缺失。例如，fc部分可以包含或由以下组成：(i)融合至ch2结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)，(ii)融合至ch3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)，(iii)融合至ch3结构域(或其部分)的ch2结构域(或其部分)，(iv)铰链结构域(或其部分)，(v)ch2结构域(或其部分)，或者(vi)ch3结构域或其部分。
[0277]
可以修饰本公开内容的fc部分，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的完整fc部分不同，同时保留(或增强)由天然存在的fc部分赋予的至少一种所需功能。此类功能包括，例如，fc受体(fcr)结合、抗体半衰期调节(例如，通过结合至fcrn)、adcc功能、蛋白a结合、蛋白g结合和补体结合。本领域中已经描述了与这些功能相关的天然存在的fc部分的部分。
[0278]
例如，为了激活补体级联反应，当免疫球蛋白分子连接到抗原靶点时，c1q蛋白复合物可以与至少两个分子的igg1或一个分子的igm结合(ward,e.s.和ghetie,v.,ther.immunol.277
‑
94(1995))。包含氨基酸残基318至337的重链区域参与补体固定(burton,d.r.,mol.immunol.22:161
‑
206(1985))。duncan,a.r.和winter,g.(nature 332:738
‑
40(1988))使用位点定向诱变，报道了glu318、lys320和lys322形成与c1q的结合位点。glu318、lys320和lys 322残基在c1q结合中的作用通过含有这些残基的短合成肽抑制补体介导的裂解的能力得到证实。
[0279]
例如，fcr结合可以通过(抗体的)fc部分与fc受体(fcr)的相互作用介导，fc受体是包括造血细胞在内的细胞上的特化细胞表面受体。fc受体属于免疫球蛋白超家族，并显示出通过吞噬免疫复合物来介导抗体包被病原体的去除，以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性裂解被相应抗体包被的红细胞和各种其他细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(adcc；van de winkel,j.g.和anderson,c.l.,j.leukoc.biol.49:511
‑
24(1991))。fcr由其对免疫球蛋白类别的特异性定义；igg抗体的fc受体被称为fcγr，ige被称为fcεr，iga被称为fcαr，等等，新生儿fc受体被称为fcrn。例如，在ravetch,j.v.和kinet,j.p.,annu.rev.immunol.9:457
‑
92(1991)；capel,p.j.等，immunomethods 4:25
‑
34(1994)；de haas,m.等，j lab.clin.med.126:330
‑
41(1995)；和gessner,j.e.等，ann.hematol.76:231
‑
48(1998)中描述了fc受体结合。
[0280]
天然igg抗体(fcγr)的fc结构域与受体的交联触发了多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎症介质的释放，以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。本文中考虑提供受体(例如，fcγr)交联的fc部分。在人类中，已表征了三种类型的fcγr：(i)fcγri(cd64)，以高亲和性结合单体igg，在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达；(ii)fcγrii(cd32)以中低亲和性结合复合igg，广泛表达，特别是在白细胞上，被认为是抗体介导免疫的核心参与者，可分为fcγriia、fcγriib和fcγriic，其在免疫系统中执行不同的功能，但与igg
‑
fc的结合具有相似的低亲和性，并且这些受体的胞外域高度同源；和(iii)fcγriii(cd16)，以中低亲和性与igg结合，以两种形式存在：fcγriiia，已在nk细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和t细胞上发现，据信介导adcc；和fcγriiib，在中性粒细胞上高度表达。
[0281]
fcγriia存在于很多参与杀伤的细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上，并且似乎能够激活杀伤过程。fcγriib似乎在抑制过程中发挥作用，存在于b细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上。已经表明，75％的fcγriib存在于肝脏中(ganesan,l.p.等，journal of immunology 189:4981
–
8(2012))。fcγriib在肝窦内皮(称为lsec)和肝脏枯否细胞中大量表达，lsec是小免疫复合物清除的主要位点(ganesan,l.p.等，2012，同上)。
[0282]
在一些实施方式中，本文公开的抗体及其抗原结合片段包含用于结合fcγriib的
fc部分，特别是fc区，例如igg型抗体。此外，可以通过引入突变s267e和l328f来工程化fc部分以增强fcγriib的结合，如chu,s.y.等(molecular immunology 45:3926
–
33(2008))所描述的。因此，免疫复合物的清除可以被增强(chu,s.等，am j respir crit,american thoracic society international conference abstracts(2014))。在一些实施方式中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段包含具有突变s267e和l328f的工程化fc部分，特别是如chu,s.y.等(2008，同上)所描述的。
[0283]
在b细胞上，fcγriib似乎可以抑制进一步的免疫球蛋白产生和同种型转换，例如ige类。在巨噬细胞上，fcγriib被认为抑制通过fcγriia介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，b形式可能有助于通过ige与其独立受体结合来抑制这些细胞的活化。
[0284]
对于fcγri结合，在天然igg中至少一个e233
‑
g236、p238、d265、n297、a327和p329的修饰减少结合至fcγri。将233
‑
236位的igg2残基替换为相应的igg1和igg4位置，将igg1和igg4与fcγri的结合降低103倍，并消除了人类单核细胞对抗体致敏红细胞的应答(armour,k.l.等，eur.j.immunol.29:2613
‑
2624(1999))。
[0285]
对于fcγrii结合，发现例如对于e233
‑
g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、r292和k414中的至少一个的igg突变降低对于fcγriia的结合。
[0286]
对于fcγriii结合，发现例如对于e233
‑
g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、s239、e269、e293、y296、v303、a327、k338和d376中的至少一个的突变降低对于fcγriiia的结合。
[0287]
在shields,r.l.等(j.biol.chem.276:6591
‑
6604(2001))中描述了人igg1上fc受体结合位点的作图、上述突变位点以及测量与fcγri和fcγriia结合的方法。
[0288]
对于结合至fcγrii，天然igg fc的两个区域似乎参与了fcγrii和igg之间的相互作用，即(i)igg fc的低铰链位点，特别是氨基酸残基l、l、g和g(234
‑
237，eu编号)，和(ii)igg fc的ch2结构域的邻近区域，特别是与下部铰链区相邻的上部ch2结构域中的环和链，例如，在p331的区域中(wines,b.d.等，j.immunol.164:5313
–
8(2000))。此外，fcγri似乎与igg fc上的相同位点结合，而fcrn和蛋白a与igg fc上的不同位点结合，这似乎在ch2
‑
ch3界面(wines,b.d.等，2000，同上)。
[0289]
还考虑增加本公开内容的fc部分对(即，一种或多种)fcγ受体的结合亲和性的突变(例如，与不包含突变的参考fc部分或抗体相比)。参见，例如，delillo和ravetch,cell161(5):1035
‑
45(2015)以及ahmed等，j.struc.biol.194(1):78(2016)，该fc突变及其技术以引用方式并入本文中。在任何本文中公开的实施方式中，结合蛋白可以包含含有选自以下的突变的fc部分：g236a；s239d；a330l；和i332e；或者包含其的组合，例如，s239d/i332e；s239d/a330l/i332e；g236a/s239d/i332e；g236a/a330l/i332e；和g236a/s239d/a330l/i332e。
[0290]
在某些实施方式中，fc部分可以包含参与与fcrn结合的fc部分的至少一部分或由其组成。在某些实施方式中，fc部分包含一个或多个氨基酸修饰，其改善针对fcrn的结合亲和性，并且，在一些实施方式中，从而延长包含fc部分的分子的体内半衰期(例如，与不包含修饰的参考fc部分或抗体相比)。在某些实施方式中，fc部分包含或来源于igg和延长半衰期的突变，其包含以下的任何一个或多个：m428l；n434s；n434h；n434a；n434s；m252y；s254t；t256e；t250q；p257i；q311i；d376v；t307a；和e380a(eu编码)。在某些实施方式中，延
长半衰期的突变包含m428l/n434s。在某些实施方式中，延长半衰期的突变包含m252y/s254t/t256e。在某些实施方式中，延长半衰期的突变包含t250q/m428l。在某些实施方式中，延长半衰期的突变包含p257i/q311i。在某些实施方式中，延长半衰期的突变包含p257i/n434h。在某些实施方式中，延长半衰期的突变包含d376v/n434h。在某些实施方式中，延长半衰期的突变包含t307a/e380a/n434a。
[0291]
在特定实施方式中，结合蛋白包含fc部分，其包含取代突变：m428l/n434s和g236a/a330l/i332e。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含fc部分，其包含取代突变：m428l/n434s和g236a/s239d/a330l/i332e。
[0292]
在特定实施方式中，结合蛋白包含fc部分，其包含取代突变：g236a/a330l/i332e。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含fc部分，其包含取代突变：g236a/s239d/a330l/i332e。
[0293]
或者或另外，本公开内容的结合蛋白的fc部分可包含本领域已知的蛋白a结合所需的至少一部分；和/或本公开内容的抗体的fe部分包含本领域已知的蛋白g结合所需的fe分子的至少部分。在一些实施方式中，保留的功能包括清除hbsag和hbvg。因此，在某些实施方式中，fc部分包含本领域已知的fcγr结合所需的至少一部分。如上所述，因此fc部分至少可以包含(i)天然igg fc的下铰链位点，特别是氨基酸残基l、l、g和g(234
–
237，eu编码)，和(ii)天然igg fc的ch2结构域的相邻区域，特别是与下铰链区相邻的上ch2结构域中的环和链，例如，在p331区域中，如在p331周围(例如，在天然igg fc的氨基酸320与340(eu编号)之间)的天然igg fc的上ch2结构域中至少3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的区域。
[0294]
在一些实施方式中，根据本公开内容的结合蛋白包含fc区。如本文所用，术语“fc区”是指由抗体重链的两个或更多个fc部分形成的免疫球蛋白部分。例如，fc区可以是单体或“单链”fc区(即，scfc区)。单链fc区由连接在单个多肽链内的fc部分组成(例如，在单个连续核酸序列中编码)。示例性scfc区在wo 2008/143954 a2中公开，并通过引用并入本文。fc区可以是或包含二聚化fc区。“二聚化fc区”或“dcfc”是指由两条独立免疫球蛋白重链的fc部分形成的二聚体。二聚化fc区可以是两个相同fc部分的同型二聚体(例如，天然存在的免疫球蛋白的fc区)或两个不同fc部分的异二聚体(例如，二聚化fc区的一个fc单体包含至少一个不存在于其他fc单体中的氨基酸修饰(例如，取代、缺失、插入或化学修饰)，或一个fc单体与另一个相比可能被截短)。
[0295]
目前公开的fc部分可以包含相同或不同类别和/或亚类的fc序列或区域。例如，fc部分可以来源于igg1、igg2、igg3或igg4亚类的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)，或来自其任何组合。在某些实施方式中，fc区的fc部分是相同类别和亚类。然而，fc区(或fc区的一个或多个fc部分)也可以是嵌合的，由此嵌合fc区可以包含源自不同免疫球蛋白类别和/或亚类的fc部分。例如，二聚体或单链fc区的至少两个fc部分可以来自不同的免疫球蛋白类和/或亚类。在某些实施方式中，二聚体fc区可以包含来自两个或更多个不同种型或亚类的序列；例如，seed体(“链交换工程化结构域”)(参见davis等，protein eng.des.sel.23(4):195(2010))。
[0296]
此外或或者，嵌合fc区可以包含一个或多个嵌合fc部分。例如，嵌合fc区或部分可以包含一个或多个来源于第一亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的部分，而fc区或fc部分的其余部分属于不同亚类。例如，fc多肽的fc区或fc部分可以包含来源于第
一亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的ch2和/或ch3结构域和来自第二亚类(例如，igg3亚类)的免疫球蛋白的铰链区。例如，fc区或fc部分可以包含来源于第一亚类(例如，igg4亚类)的免疫球蛋白的铰链和/或ch2结构域和来自第二亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的ch2结构域。例如，嵌合fc区可以包含来自第一亚类(例如，igg4亚类)的免疫球蛋白的fc部分(例如，完整fc部分)和来自第二亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的fc部分。例如，fc区或fc部分可以包含来自igg4免疫球蛋白的ch2结构域和来自igg1免疫球蛋白的ch3结构域。例如，fc区或fc部分可以包含来自igg4分子的ch1结构域和ch2结构域和来自igg1分子的ch3结构域。例如，fc区或fc部分可以包含来自抗体的特定亚类的ch2结构域的部分，例如，ch2结构域的eu位置292
‑
340。例如，fc区或fc部分可以包含来源于igg4部分的ch2的氨基酸位置292
‑
340和来源于igg1部分的ch2的其余部分(或者，ch2的292
‑
340可以来源于igg1部分和来源于igg4部分的ch2的其余部分)。
[0297]
此外，fc区或fc部分可以(另外地或替代地)例如包含嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可例如部分源自iggl、igg2或igg4分子(例如，上部和下部中间铰链序列)并且部分源自igg3分子(例如，中间铰链序列)。在另一个实例中，fc区或fc部分可包含部分源自iggl分子且部分源自igg4分子的嵌合铰链。在另一个实例中，嵌合铰链可以包含来自igg4分子的上部和下部铰链结构域以及来自igg1分子的中间铰链结构域。这样的嵌合铰链可以例如通过在igg4铰链区的中间铰链域中的eu位置228处引入脯氨酸取代(ser228pro)来制备。在一些其他实施方式中，嵌合铰链可以包含位于eu位置233
‑
236的氨基酸来自igg2抗体和/或ser228pro突变，其中铰链的其余氨基酸来自igg4抗体(例如，序列eskygppcppcpappvagp(seq id no:105)的嵌合铰链)。us 2005/0163783a1中描述了可用于根据本公开内容的抗体的fc部分中的其他嵌合铰链。
[0298]
在一些实施方式中，fc部分或fc区，包含源自人免疫球蛋白序列(例如，源自人igg分子的fc区或fc部分)的氨基酸序列或由其组成。然而，多肽可包含来自另一哺乳动物物种的一个或多个氨基酸。例如，灵长类fc部分或灵长类结合位点可以包括在对象多肽中。或者，一个或多个小鼠氨基酸可以存在于fc部分中或fc区中。
[0299]
c.hbc34和hbc24抗体
[0300]
在某些实施方式中，抗hbv抗体是hbc34或其工程化变体，或者是hbc24或其工程化变体。hbc34和hbc24是针对hbsag的人抗体，具有高中和活性。hbc34以高亲和性(在pm范围内)与hbsag的抗原环结合，识别所有10种hbv基因型和18种突变体，并以低化学计量与球形svp结合。hbc34的活性，如用免疫测定法测定的，为5000iu/mg。作为比较，hbig的活性为～1iu/mg。
[0301]
如本文所指，除非另有说明，否则术语“hbc34抗体”和“hbc抗体”可包括野生型hbc34抗体或其工程化变体(例如，表3中描述的hbc34和hbc34变体)。
[0302]
表3显示了hbc34的cdr、重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)及其工程化变体(“hbc34v7”、“hbc34v23”、“hbc34v31”、“hbc34v32”、“hbc34v33”、“hbc34v34”和“hbc34v35”)以及“hbc24”的氨基酸序列。还显示了本公开内容的示例性抗体的全长重链(hc)和轻链(lc)氨基酸序列。一个或多个氨基酸残基在名称中表示)。
[0303]
表3：hbc34和hbc24抗体的序列
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313]
[0314]
[0315]
[0316]
[0317]
[0318][0319]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体是hbc34，或hbc34抗体的非天然变体。hbc34的非天然变体的实例包括例如“hbc34v7”、“hbc34v23”、“hbc34v31”、“hbc34v32”、“hbc34v33”、“hbc34v34”和“hbc34v35”。
[0320]
在某些实施方式中，抗hbv抗体包含表3中所列的一个或多个氨基酸序列。在某些实施方式中，根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段包含与表3中所示的cdr序列、v
h
序列、v
l
序列、hc序列和/或lc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在任何目前公开的实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包含如表3中所示的cdr、v
h
、v
l
、hc和/或lc序列。
[0321]
在一些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：(i)分别根据seq id no:44、45或46、和47的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸序列；和(ii)分别根据seq id no:48、49或50、和51或52的cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0322]
因此，在一些实施方式中，cdrh1、cdrh2和cdrh3是分别根据seq id no:44、45和47。在一些实施方式中，cdrh1、cdrh2和cdrh3是分别根据seq id no:44、46和47。在一些实施方式中，cdrl1、cdrl2和cdrl3是分别根据seq id no:48、49和51。在一些实施方式中，cdrl1、cdrl2和cdrl3是分别根据seq id no:48、49和52。在一些实施方式中，cdrl1、cdrl2和cdrl3是分别根据seq id no:48、50和51。在一些实施方式中，cdrl1、cdrl2和cdrl3是分别根据seq id no:48、50和52。
[0323]
将理解的是，本公开内容的抗体或抗原结合片段可以包含根据seq id no:44
‑
52的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列的任何组合。
[0324]
在特定实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：分别根据seq id no:44、45和47的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸序列；和分别根据seq id no:48、49和51的
cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。在其他实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：分别根据seq id no:44、45和47的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸序列；和分别根据seq id no:48、49和52的cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0325]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:55
‑
69中任一者所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53或54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0326]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：
[0327]
(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:55
‑
63中任一者所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0328]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：
[0329]
(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:55
‑
57或64
‑
69中任一者所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0330]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：
[0331]
(i)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:55所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0332]
(ii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:55所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0333]
(iii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:56所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0334]
(iv)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:56所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0335]
(v)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:57所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0336]
(vi)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:57所示的氨基酸序列为至少
90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0337]
(vii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:58所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0338]
(viii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:59所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0339]
(ix)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:60所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0340]
(x)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:61所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0341]
(xi)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:62所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0342]
(xii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:63所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0343]
(xiii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:64所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0344]
(xiv)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:65所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0345]
(xv)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:66所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0346]
(xvi)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:67所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；
[0347]
(xvii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:68所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
[0348]
(xviii)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其包含与seq id no:69所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其包含与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0349]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含：
[0350]
(a)轻链，其包含与seq id no:73所示的氨基酸序列是至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链，其包含与seq id no:70
‑
72和97中的任一者所示的氨基酸序列是至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
[0351]
(a)轻链，其包含与seq id no:74所示的氨基酸序列是至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链，其包含与seq id no:70
‑
72和97中的任一者所示的氨基酸序列是至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
[0352]
(a)轻链，其包含与seq id no:83
‑
95中的任一者所示的氨基酸序列是至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；和(b)重链，其包含与seq id no:70
‑
72、97和98中的任一者所示的氨基酸序列是至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
[0353]
在特定实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:73所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:70所示的氨基酸序列或由其组成。
[0354]
在特定实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:73所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:71所示的氨基酸序列或由其组成。
[0355]
在其他实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:73所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:72所示的氨基酸序列或由其组成。
[0356]
在其他实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:73所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:97所示的氨基酸序列或由其组成。
[0357]
在另外其他实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:74所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:70所示的氨基
酸序列或由其组成。
[0358]
在另外其他实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:74所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:71所示的氨基酸序列或由其组成。
[0359]
在又一个实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:74所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:72所示的氨基酸序列或由其组成。
[0360]
在另外其他实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链，其包含seq id no:74所示的氨基酸序列或由其组成，和(b)重链，其包含seq id no:97所示的氨基酸序列或由其组成。
[0361]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3，其具有分别根据seq id no:77
‑
82的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)根据seq id no:76的轻链可变结构域(v
l
)氨基酸序列；和(b)据seq id no:75的重链可变结构域(v
h
)氨基酸序列。
[0362]
在某些实施方式中，本公开内容的抗体或抗原结合片段包含(a)轻链可变结构域(v
l
)，其与seq id no:76中所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性，和(b)重链可变结构域(v
h
)，其与seq id no:75中所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性。
[0363]
d.药物组合物
[0364]
在一些实施方式中，组合疗法的抗体或其抗原结合片段作为药物组合物提供，其包括抗hbv抗体和任选的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，组合物可以包含抗hbv抗体，其中抗体可以占组合物中以质量计总蛋白的至少50％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在此类组合物中，抗体可以是纯化的形式。
[0365]
抗hbv抗体的药物组合物可以包含抗微生物剂，特别是如果以多剂量形式包装的话。其可以包含去垢剂，例如，吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。当存在时，去垢剂通常以低水平(例如，少于0.01％)存在。组合物还可以包含钠盐(例如，氯化钠)，以提高张力。例如，在一些实施方式中，药物组合物包含浓度为10
±
2mg/ml的nacl。
[0366]
此外，药物组合物可包含糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，例如，以约15
‑
30mg/ml(例如，25mg/ml)，特别是如果其是冻干的，或者如果其包含由冻干材料重构的材料。在冻干之前，用于冻干的组合物的ph值可以被调整至5至8之间，或5.5至7之间或约6.1。
[0367]
本公开内容的抗体组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。在一些实施方式中，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。
[0368]
制备抗hbv抗体的药物组合物的方法可以包括以下步骤：(i)制备抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的载体混合。
[0369]
iv.使用组合疗法治疗的方法
[0370]
在一些实施方式中，本公开内容提供了用于治疗hbv感染或乙型肝炎病毒相关疾病的方法。
[0371]
如本文所用，“对象”是动物，如哺乳动物，包括可感染hbv的任何哺乳动物，例如，灵长类(如人、非人灵长类，例如，猴或黑猩猩)，或被认为是可接受的hbv感染临床模型，hbv
‑
aav小鼠模型的动物(参见，例如，yang等，cell and mol immunol 11:71(2014))或hbv 1.3xfs转基因小鼠模型(guidotti等，j.virol.69:6158(1995))。在一些实施方式中，对象具有乙型肝炎病毒(hbv)感染。在一些其他实施方式中，对象具有乙型肝炎病毒(hbv)感染和丁型肝炎病毒(hdv)感染。在一些其他实施方式中，对象是人，如具有hbv感染的人，特别是慢性乙型肝炎病毒(chbv)感染。
[0372]
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指下列有利或所需的结果，包括但不限于：减轻或改善与不想要的hbv基因表达或hbv复制相关的一种或多种体征或症状，例如，存在血清或肝hbv cccdna、存在血清hbv dna、存在血清或肝hbv抗原(例如，hbsag或hbeag)、alt升高、ast升高(一般认为正常范围是约10至34u/l)、不存在或抗hbv抗体水平较低；肝损伤；肝硬化；丁型肝炎；急性乙型肝炎；急性爆发性乙型肝炎；慢性乙型肝炎；肝纤维化；终末期肝病；肝细胞癌；血清病样综合征；厌食症；恶心；呕吐，低烧；肌痛；易疲劳；味觉和嗅觉紊乱(厌恶食物和香烟)；或右上腹和上腹痛(间歇性、轻度至中度)；肝性脑病；嗜睡；睡眠模式紊乱；精神错乱；昏迷；腹水；消化道出血；凝血功能障碍；黄疸；肝肿大(轻度增大，软肝)；脾肿大；手掌红斑；蜘蛛痣；肌肉消瘦；蜘蛛血管瘤；血管炎；静脉曲张出血；外周水肿；男性乳房发育症；睾丸萎缩；腹部侧支静脉(肚周静脉曲张)；alt水平高于ast水平；γ
‑
谷氨酰转肽酶(ggt)升高(正常范围通常被认为约8至65u/l)和碱性磷酸酶(alp)水平升高(正常范围通常被认为约44至147iu/l(国际单位/升)，且不超过uln的3倍)；白蛋白水平略低；血清铁水平升高；白细胞减少症(即，粒细胞减少症)；淋巴细胞增多症；红细胞沉降率(esr)增加；红细胞存活时间缩短；溶血；血小板减少症；国际标准化比率(inr)延长；存在血清或肝hbsag、hbeag、乙型肝炎核心抗体(抗
‑
hbc)、免疫球蛋白m(igm)；乙型肝炎表面抗体(抗
‑
hb)、乙型肝炎e抗体(抗
‑
hbe)或hbv dna；胆红素水平增加；高球蛋白血症；存在组织非特异性抗体，如抗平滑肌抗体(asma)或抗核抗体(ana)(10
‑
20％)；存在组织特异性抗体，诸如抗甲状腺抗体(10
‑
20％)；类风湿因子(rf)水平升高；血小板和白细胞计数降低；小叶具有退化性和再生性肝细胞变化，且伴随炎症；以及主要小叶中心坏死，无论是否能够检测到。降低发展程例如肝纤维化的可能性，例如，当个体具有一种或多种肝纤维化的风险因素(例如，慢性乙型肝炎感染)时，其将不会发展成肝纤维化或相对于具有相同风险因素但未接受如本文中所述的治疗的群体，其发展成肝纤维化的严重程度较低。与没有接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可以指延长生存期。
[0373]
如本文所用，术语“防止(preventing)”或“预防(prevention)”指不会发展成疾病、病症或病况，或减轻与这种疾病、病症或病况相关的体征或症状的发展(例如，通过临床上相关的量)、或显示出延迟的体征或症状延缓(例如，数天、数周、数月或数年)。预防可能需要施用超过一剂。
[0374]
在一些实施方式中，治疗hbv感染导致“功能性治愈”乙型肝炎。如本文所用，功能性治愈被理解为循环hbsag的清除，并且可能伴随转变为使用临床相关测定可检测到hbsag抗体的状态。例如，可检测的抗体可以包括高于10miu/ml的信号，如通过化学发光微粒免疫测定(cmia)或任何其他免疫测定。功能性治愈不需要清除所有复制形式的hbv(例如，来自肝脏的cccdna)。每年约有0.2
‑
1％的慢性感染患者会自发地发生抗hb血清学转换。然而，即
使在抗hb血清学转换后，仍经常观察到低水平的hbv持续数十年，表明发生了功能性治愈而非完全治愈。在不受特定机制约束的情况下，免疫系统可能能够在已经实现功能性治愈的条件下控制hbv。功能性治愈允许停止对hbv感染的任何治疗。然而，应当理解，hbv感染的“功能性治愈”可能不足以预防或治疗由hbv感染引起的疾病或病症，例如，肝纤维化、hcc或肝硬化。在一些特定实施方式中，“功能性治愈”可以指治疗方案开始或治疗方案完成后血清hbsag持续降低，如<1iu/ml，持续至少3个月、至少6个月或至少一年。
[0375]
如本文所用，术语“乙型肝炎病毒相关疾病”或“hbv相关疾病”是由hbv感染或复制引起或与其相关的疾病或病症。术语“hbv相关疾病”包括将从hbv基因表达或复制的减少中受益的疾病、病症或病况。hbv相关疾病的非限制性实例包括例如丁型肝炎病毒感染、丁型肝炎、急性乙型肝炎；急性爆发性乙型肝炎；慢性乙型肝炎；肝纤维化；终末期肝脏疾病；和肝细胞癌。
[0376]
在一些实施方式中，hbv相关疾病是丁型肝炎病毒感染。丁型肝炎病毒或肝炎丁型病毒(hdv)是一种人类病原体。然而，病毒有缺陷，依赖于乙型肝炎病毒(hbv)提供的强制性辅助功能进行传播；实际上，hdv需要相关的或预先存在的hbv感染才能变得具有传染性和繁殖力，特别是包含乙型肝炎表面抗原的病毒包膜。hdv可导致与hbv相关的严重急性和慢性肝病。丁型肝炎感染或丁型肝炎在几个非洲国家、亚马逊地区和中东高度流行，而其在工业化国家(地中海除外)的流行率较低。
[0377]
hdv的传播可以通过同时感染hbv(共感染)或叠加在慢性乙型肝炎或乙型肝炎携带者状态(重复感染)发生。与单独感染hbv相比，双重感染和合并感染hdv通常会导致更严重的并发症。这些并发症包括在急性感染中发生肝功能衰竭的可能性更大，并迅速发展为肝硬化，慢性感染中患肝癌的机会增加。与乙型肝炎病毒结合，丁型肝炎在所有肝炎感染中的致死率最高，为20％。
[0378]
在一些实施方式中，hbv相关疾病是急性乙型肝炎。急性乙型肝炎包括持续不到六个月的肝脏炎症。急性乙型肝炎的典型症状是疲劳、厌食、恶心和呕吐。通常观察到非常高的转氨酶值(>1000u/l)和高胆红素血症。严重的急性乙型肝炎病例可能会迅速发展为急性肝功能衰竭，表现为肝脏合成功能不良。这通常被定义为凝血酶原时间(pt)为16秒或在没有既往肝病情况下的国际标准化比率(inr)为1.5。急性乙型肝炎可能演变成慢性乙型肝炎。
[0379]
在一些实施方式中，hbv相关疾病是慢性肝炎。慢性乙型肝炎(chb)包括持续六个月以上的肝脏炎症。患有chb的对象为hbsag阳性并且具有高病毒血症(≥104个hbv
‑
dna拷贝/ml血液)或低病毒血症(<103个hbv
‑
dna拷贝/ml血液)。在某些实施方式中，对象已被hbv感染至少5年。在某些实施方式中，对象已被hbv感染至少10年。在某些实施方式中，对象在出生时感染了hbv。患有慢性乙型肝炎疾病的对象可能是免疫耐受的或具有非活动性慢性感染而没有任何活动性疾病的证据，并且其也没有症状。慢性活动性肝炎患者，尤其是处于复制状态的患者，可能会出现与急性肝炎相似的症状。患有慢性乙型肝炎疾病的对象可能患有伴有坏死性炎症性肝病的活动性慢性感染，在没有可检测到的坏死性炎症的情况下肝细胞周转增加，或患有无任何活动性疾病迹象的非活动性慢性感染，并且其也无症状。chb对象中hbv感染的持续存在是ccchbv dna的结果。在一些实施方式中，患有chb的对象是hbeag阳性。在一些其他实施方式中，患有chb的对象是hbeag阴性。患有chb的对象的血清
hbv dna水平低于105，并且转氨酶(例如，alt、ast和γ
‑
谷氨酰转移酶)持续升高。患有chb的对象可以具有小于4的肝脏活检评分(例如，坏死性炎症评分)。
[0380]
在一些实施方式中，hbv相关疾病的急性爆发性乙型肝炎。患有急性爆发性乙型肝炎的对象具有急性肝炎的症状以及意识混乱或昏迷的其他症状(因为肝脏无法对化学物质解毒)以及瘀血或出血(因为缺乏凝血因子)。
[0381]
具有hbv感染(例如，chb)的对象可能发展成肝纤维化。因此，在一些实施方式中，hbv相关疾病是肝纤维化。肝纤维化(或肝硬化)的组织学定义为弥漫性肝过程，其特征在于纤维化(过量纤维结缔组织)并将正常肝脏构造转化成结构异常的结节。
[0382]
具有hbv感染(例如，chb)的对象可能发展成终末期肝脏疾病。因此，在一些实施方式中，hbv相关疾病是终末期肝脏疾病。例如，由于肝纤维化可能发展至身体可能无法代偿的程度，例如肝功能降低造成肝纤维化(即，失代偿肝脏)，并导致例如精神和神经症状和肝衰竭。
[0383]
具有hbv感染(例如，chb)的对象可能发展成肝细胞癌(hcc)，也称为恶性肝癌。因此，在一些实施方式中，hbv相关疾病是hcc。hcc通常在患有chb的个体中发展，且可能是纤维层状、伪腺状(腺样体)、多形(巨细胞)或透明细胞。
[0384]“hdv相关病症”或“丁型肝炎病毒相关病症”是与hdv的表达相关的疾病或病症。示例性hdv相关病症包括乙型肝炎病毒感、急性乙型肝炎、急性丁型肝炎；急性爆发性丁型肝炎；慢性丁型肝炎；肝纤维化；终末期肝脏疾病；和肝细胞癌。
[0385]
如本文所用，“治疗有效量”旨在指包括rnai药剂或抗hbv抗体的量，当向患者施用以治疗患有hbv感染和/或hbv相关的疾病的个体时，其量足以有效治疗疾病(例如，通过减少或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)。“治疗有效量”可能随rnai药剂和/或抗hbv抗体、其施用方式、疾病及其严重程度以及所接受治疗的患者的病史、年龄、体重、家庭病史、基因组成、由hbv基因所介导的病理过程阶段、此前或伴随治疗的类型(如果有的话)、以及其他个体特征而有所不同。治疗有效量可能需要施用超过一剂。
[0386]“治疗有效量”还包括在可适用于任何治疗的合理的获益/风险比之下，产生一些所需效应的rnai药剂或抗hbv抗体的量。本公开内容的方法中所使用的治疗剂(例如，rnai药剂、抗hbv抗体)可施用足够的量以产生可适用于此类治疗的合理的获益/风险比。
[0387]
如本文所用，术语“样品”包括从对象分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及对象体内存在的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清和浆液、血浆、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可以包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可能来自特定器官、器官的一部分或这些器官内的流体或细胞。在某些实施方式中，样品可以来源于肝脏(例如，整个肝脏或肝的某些部分、或肝中的某些细胞类型，比如例如，肝细胞)。在某些实施方式中，“来源于对象的样品”指从对象抽血获得的血液、或血浆、或血清。在其他实施方式中，“来源于对象的样品”指来源于对象的肝脏组织(或其亚组分)或血液组织(或其亚组分，例如，血清)。
[0388]
本公开内容的一些实施方式提供了在有需要的对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的方法，包括：(i)向所述对象施用降低hbv抗原负载的药剂；和(ii)向所述对象施用抗hbv抗体。在某些实施方式中，降低hbv抗原负载的药剂是在抗hbv抗体之前施用的。在某些实施方式中，在抗hbv抗体之前施用降低hbv抗原负载的药剂，使得当施用抗hbv抗体时病
毒负载降低。在某些实施方式中，组合疗法的抗hbv抗体的治疗有效量低于当尚未向对象施用降低hbv抗原负载的药剂时所递送的抗hbv抗体的治疗有效量(例如，当抗hbv抗体是作为单一疗法单独施用时)。在一些实施方式中，降低hbv抗原负载的药剂是抑制hbv转录物的表达的rnai药剂(例如，sirna)。
[0389]
在某些实施方式中，本公开内容提供了一种在有需要的对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的方法，包括：向所述对象施用降低hbv抗原负载的药剂；和向所述对象施用抗hbv抗体；以及还包括在施用降低hbv抗原负载的药剂之前和之后从对象的血液样品中测量hbsag的存在量，其中hbsag的减少指示至少一种hbv基因的表达降低
[0390]
在某些实施方式中，本公开内容提供了一种用于在对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的降低hbv抗原负载的药剂，其中随后向所述对象施用抗hbv抗体。在某些其他实施方式中，本公开内容提供了用于在对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的抗hbv抗体，并且所述对象此前已施用降低hbv抗原负载的药剂。在其他实施方式中，至少一种hbv基因的表达在施用降低hbv抗原负载的药剂之后降低，且当所述至少一种hbv基因的表达降低时向所述对象施用抗hbv抗体。
[0391]
在某些实施方式中，本公开内容提供了降低hbv抗原负载的药剂和/或抗hbv抗体在制备用于治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的药剂的用途。
[0392]
本公开内容的一些实施方式提供了在有需要的对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的方法，包括：(i)向所述对象施用hbv基因表达抑制剂；和(ii)向所述对象施用抗hbv抗体。在某些实施方式中，在施用抗hbv抗体之前施用hbv基因表达抑制剂。在某些实施方式中，在抗hbv抗体之前施用hbv基因表达抑制剂，导致当施用抗hbv抗体时病毒负载被降低。在某些实施方式中，组合疗法的抗hbv抗体的治疗有效量低于当尚未向对象施用hbv基因表达抑制剂时所递送的抗hbv抗体的治疗有效量(例如，当抗hbv抗体是作为单一疗法单独施用时)。
[0393]
在某些实施方式中，至少一种hbv基因表达在施用hbv基因表达抑制剂之后降低，且当所述至少一种hbv基因表达降低时向所述对象施用抗hbv抗体。在特定实施方式中，至少一种hbv基因是hbv x基因和/或hbsag。
[0394]
在某些实施方式中，本公开内容提供了一种在有需要的对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的方法，包括：向所述对象施用hbv基因表达抑制剂；和向所述对象施用抗hbv抗体；以及还包括在施用hbv表达抑制剂之前和之后从对象的血液样品中测量hbsag的存在量，其中hbsag减少提示至少一种hbv基因的表达降低。
[0395]
在某些实施方式中，本公开内容提供了一种用于在对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的hbv基因表达抑制剂，其中所述对象随后施用抗hbv抗体。在某些其他实施方式中，本公开内容提供了抗hbv抗体用于在对象中治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的用途，并且所述对象此前已施用了基因表达抑制剂。在其他实施方式中，施用hbv基因表达抑制剂后至少一种hbv基因表达降低，当至少一种hbv基因表达降低时向对象施用抗hbv抗体。
[0396]
在某些实施方式中，本公开内容提供了hbv基因表达抑制剂和/或抗hbv抗体在制备用于治疗慢性hbv感染或hbv相关疾病的药物中的用途。
[0397]
在任何上述方法、组合物、在制备中的用途中，所述方法和组合物可以用于治疗慢性hbv感染。
[0398]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂以单剂、两剂、三剂、四剂或五剂施用。在某些特定实施方式中，至少一剂hbv基因表达抑制剂在抗hbv抗体施用之前施用。
[0399]
在某些实施方式中，hbv基因表达抑制剂以单剂、两剂、三剂、四剂、或五剂、六剂、七剂或八剂施用。可以施用一剂或多剂，例如，每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周两次、每周一次、每隔一周、每四个星期或每月一次。
[0400]
在某些实施方式中，施用抗hbv抗体包括每周两次、每周一次、每隔一周、每两周或每月一次施用抗hbv抗体。
[0401]
在某些实施方式中，施用抗hbv抗体包括施用至少两剂治疗有效量的抗hbv抗体。在某些其他实施方式中，每周两次、每周一次、每隔一周、每两周或每月一次施用至少两剂。
[0402]
在某些实施方式中，在施用hbv基因表达抑制剂后至少1周开始施用抗hbv抗体。在某些实施方式中，在施用hbv基因表达抑制剂后2周开始施用抗hbv抗体。在某些实施方式中，在施用hbv基因表达抑制剂后8周开始施用抗hbv抗体。
[0403]
在某些实施方式中，抗hbv抗体和hbv基因表达抑制剂分别皮下施用。
[0404]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体可以识别hbv基因型a、b、c、d、e、f、g、h、i和j。
[0405]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体可以是人抗体；单克隆抗体；或双特异性抗体，其具有对hbsag的第一特异性以及具有刺激免疫效应物的的第二特异性(例如，刺激细胞毒性或疫苗接种效应的第二特异性)。在本文公开的上述方法、组合物或在制备中的用途的某些其他实施方式中，抗hbv抗体是单克隆抗体。
[0406]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体可以是如本文公开的hbc34或hbc34的非天然变体。例如，在某些实施方式中，抗hbv抗体包含具有以下氨基酸序列的cdr：(i)根据seq id no:44、45、47
‑
49和51；或(ii)根据seq id no:44、45、47
‑
49和52。在某些实施方式中，抗hbv抗体包含具有根据seq id no:44、45、47、48、49和51的氨基酸序列的cdr。在某些实施方式中，抗hbv抗体包含具有根据seq id no:44、45、47、48、49和52的氨基酸序列的cdr。在某些实施方式中，抗hbv抗体包含：(1)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其与seq id no:55
‑
63的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性；或者(2)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其与seq id no:55
‑
57和64
‑
69的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性。
[0407]
在某些实施方式中，抗hbv抗体包含：(1)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其与seq id no:55
‑
69的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其与seq id no:53所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性；或者(2)(a)轻链可变结构域(v
l
)，其与seq id no:55
‑
69的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性；和(b)重链可变结构域(v
h
)，其与seq id no:54所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性。
[0408]
在某些实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)根据seq id no:59的轻链可变结构域(v
l
)序列；和(b)根据seq id no:53的重链可变结构域(v
h
)序列。
[0409]
在某些实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)根据seq id no:58的轻链可变结构域
(v
l
)序列；和(b)根据seq id no:53的重链可变结构域(v
h
)序列。
[0410]
在方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)轻链，其与seq id no:73所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性，和(b)重链，其与seq id no:70
‑
72和97的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性。
[0411]
在方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)轻链，其与seq id no:74所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性，和(b)重链，其与seq id no:70
‑
72和97的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性。
[0412]
在方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)轻链，其与seq id no:83
‑
95的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性，和(b)重链，其与seq id no:70
‑
72、97和98的任一项所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性。
[0413]
在方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)根据seq id no:73的氨基酸序列的轻链，和(b)根据seq id no:70的氨基酸序列的重链。
[0414]
在方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)根据seq id no:73的氨基酸序列的轻链，和(b)根据seq id no:71的氨基酸序列的重链。
[0415]
在方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，抗hbv抗体包含：(a)根据seq id no:74的氨基酸序列的轻链，和(b)根据seq id no:70的氨基酸序列的重链。
[0416]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的某些其他实施方式中，抗hbv抗体包含具有根据seq id no:77
‑
82的氨基酸序列的cdr。在上述方法、组合物或在制备中的用途的某些实施方式中，抗hbv抗体包含(a)根据seq id no:76的氨基酸序列的轻链可变结构域(v
l
)；和(b)根据seq id no:75的氨基酸序列的重链可变结构域(v
h
)。
[0417]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的某些实施方式中，抗hbv抗体包含(a)轻链可变结构域(v
l
)，其与seq id no:76所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性，和(b)重链可变结构域(v
h
)，其与seq id no:75所示的氨基酸序列为至少90％、至少95％或100％同一性。
[0418]
在某些实施方式中，抗hbv抗体的治疗有效量低于当未向对象施用hbv基因表达抑制剂时所递送的抗hbv抗体的治疗有效量。例如，如与单独施用抗hbv抗体相比，组合疗法可降低抗hbv抗体的有效剂量。
[0419]
在某些实施方式中，抗hbv抗体以至少单独的两剂施用。在特定实施方式中，每周两次、每周一次、每隔一周、每两周或每月一次施用至少两剂。
[0420]
在某些实施方式中，对象是人，且抗hbv抗体以治疗有效量施用；其中所述治疗有效量是从约3mg/kg至约30mg/kg。
[0421]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述抑制剂是抑制hbv转录物的表达的rnai药剂。在一些实施方式中，hbv转录物表达的抑制通过rtpcr测量。在一些实施方式中，hbv转录物表达的抑制通过elisa测量的蛋白质水平的降低来测量。
[0422]
在某些实施方式中，rnai药剂包含形成双链区的正义链和反义链，其中所述正义链包含与seq id no:1的核苷酸1579
‑
1597相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在某些实施方式中，所述rnai药剂包含正义链和反义链，其中所述正义链包含seq id no:1的核苷酸1579
‑
1597。
[0423]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述rnai药剂的至少一条链可以包含至少1个核苷酸或至少2个核苷酸的3'悬突。
[0424]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述rnai药剂的双链区可以是15
‑
30个核苷酸对的长度；17
‑
23个核苷酸对的长度；17
‑
25个核苷酸对的长度；23
‑
27个核苷酸对的长度；19
‑
21个核苷酸对的长度；或21
‑
23个核苷酸对的长度。
[0425]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述rnai药剂的每条链可以是15
‑
30个核苷酸或19
‑
30个核苷酸。
[0426]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，rnai药剂是sirna。在特定实施方式中，sirna抑制编码hbsag蛋白、hbcag蛋白和hbx蛋白或hbv dna聚合酶蛋白的hbv转录物的表达。在某些实施方式中，sirna与由下列所编码的靶点的至少15个相邻核苷酸结合：p基因、nc_003977.2的核苷酸2309
‑
3182和1
‑
1625；s基因(编码l、m和s蛋白)、nc_003977.2的核苷酸2850
‑
3182和1
‑
837；hbx，nc_003977.2的核苷酸1376
‑
1840；或c基因，nc_003977.2的核苷酸1816
‑
2454。
[0427]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，rnai药剂是sirna，并且所述sirna的反义链包含5'
‑
ugugaagcgaagugcacacuu
‑
3'(seq id no:4)的核苷酸序列的至少15个相邻核苷酸或19个相邻核苷酸。在一些实施方式中，sirna的反义链包含5'
‑
ugugaagcgaagugcacacuu
‑
3'(seq id no:4)的核苷酸序列。在一些实施方式中，反义链由5'
‑
ugugaagcgaagugcacacuu
‑
3'(seq id no:4)的核苷酸序列组成。在一些实施方式中，sirna的正义链包含5'
‑
gugugcacuucgcuucaca
‑
3'(seq id no:3)的核苷酸序列。在一些实施方式中，sirna的正义链由5'
‑
gugugcacuucgcuucaca
‑
3'(seq id no:3)的核苷酸序列组成。
[0428]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述rnai药剂是sirna，并且所述sirna的反义链包含5'
‑
uaaaauugagagaaguccaccac
‑
3'(seq id no:107)的核苷酸序列的至少15个相邻核苷酸或19个相邻核苷酸。在一些实施方式中，sirna的反义链包含5'
‑
uaaaauugagagaaguccaccac
‑
3'(seq id no:107)的核苷酸序列。在一些实施方式中，反义链由5'
‑
uaaaauugagagaaguccaccac
‑
3'(seq id no:107)的核苷酸序列组成。在一些实施方式中，sirna的正义链包含5'
‑
gguggacuucucucaauuuua
‑
3'(seq id no:106)的核苷酸序列。在一些实施方式中，sirna的正义链由5'
‑
gguggacuucucucaauuuua
‑
3'(seq id no:106)的核苷酸序列组成。
[0429]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述rnai药剂是sirna，其中所述正义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，且其中所述正义链与在3’末端附接的配体缀合。在特定实施方式中，配体是通过单价接头、二价分支接头或三价分支接头附接的一个或多个galnac衍生物。在某些实施方式中，通过接头附接的galnac衍生物是或包含以下：
[0430][0431]
在特定实施方式中，sirna如下图所示缀合至配体(即，通过接头所附接的galnac衍生物是)：
[0432][0433]
其中x是o或s。
[0434]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，所述rnai药剂是sirna，其中所述sirna的至少一个核苷酸是经修饰的核苷酸，其包括脱氧
‑
核苷酸、3'
‑
末端脱氧
‑
胸腺嘧啶(dt)核苷酸、2'
‑
o
‑
甲基修饰的核苷酸、2'
‑
氟修饰的核苷酸、2'
‑
脱氧
‑
修饰的核苷酸、锁定核苷酸、未锁定核苷酸、构象限制的核苷酸、受限的乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'
‑
氨基
‑
修饰的核苷酸、2'
‑
o
‑
烯丙基
‑
修饰的核苷酸、2'
‑
c
‑
烷基
‑
修饰的核苷酸、2'
‑
羟基
‑
修饰的核苷酸、2'
‑
甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'
‑
o
‑
烷基
‑
修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、磷酰胺酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5
‑
无水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5'
‑
磷酸酯的核苷酸、腺苷
‑
二醇核酸或包含5'
‑
磷酸酯类似物的核苷酸。在某些实施方式中，sirna包含磷酸酯骨架修饰、2'核糖修饰、5'三磷酸酯修饰或galnac缀合修饰。在某些实施方式中，磷酸酯骨架修饰包含硫代磷酸酯键。在某些实施方式中，2'核糖修饰包含氟或
‑
o
‑
甲基取代。
[0435]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，rnai药剂是具有包含5'
‑
gsusgugfcafcfufucgcuucacal96
‑
3'(seq id no:5)的正义链和包含5'
‑
usgfsugaafgcfgfaagugfcafcacsusu
‑
3'(seq id no:6)的反义链的sirna，
[0436]
其中a、c、g和u分别是2'
‑
o
‑
甲基腺苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
o
‑
甲基胞苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
o
‑
甲基鸟苷
‑
3'
‑
磷酸酯和2'
‑
o
‑
甲基尿苷
‑
3'
‑
磷酸酯；
[0437]
af、cf、gf和uf分别是2'
‑
氟腺苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
氟胞苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
氟鸟苷
‑
3'
‑
磷酸酯和2'
‑
氟尿苷
‑
3'
‑
磷酸酯；
[0438]
s是硫代磷酸酯连接；和
[0439]
l96是n
‑
[三(galnac
‑
烷基)
‑
酰胺基癸酰基)]
‑4‑
羟基脯氨醇。
[0440]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，rnai药剂是具有包含5'
‑
gsusgugfcafcfufucgcuucacal96
‑
3'(seq id no:7)的正义链和包含5'
‑
usgfsuga(agn)gcfgfaagugfcafcacsusu
‑
3'(seq id no:8)的反义链的sirna，
[0441]
其中a、c、g和u分别是2'
‑
o
‑
甲基腺苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
o
‑
甲基胞苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
o
‑
甲基鸟苷
‑
3'
‑
磷酸酯和2'
‑
o
‑
甲基尿苷
‑
3'
‑
磷酸酯；
[0442]
af、cf、gf和uf分别是2'
‑
氟腺苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
氟胞苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
氟鸟苷
‑
3'
‑
磷酸酯和2'
‑
氟尿苷
‑
3'
‑
磷酸酯；
[0443]
(agn)是腺苷
‑
二醇核酸(gna)；
[0444]
s是硫代磷酸酯连接；和
[0445]
l96是n
‑
[三(galnac
‑
烷基)
‑
酰胺基癸酰基)]
‑4‑
羟基脯氨醇。
[0446]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，rnai药剂是具有包含5'
‑
gsgsuggacfuufcfufcucaafufuuual96
‑
3'(seq id no:108)的正义链和包含5'
‑
usafsaaaufugfafgagaafgufccaccsasc
‑
3'(seq id no:109)的反义链的sirna，
[0447]
其中a、c、g和u分别是2'
‑
o
‑
甲基腺苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
o
‑
甲基胞苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
o
‑
甲基鸟苷
‑
3'
‑
磷酸酯和2'
‑
o
‑
甲基尿苷
‑
3'
‑
磷酸酯；
[0448]
af、cf、gf和uf分别是2'
‑
氟腺苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
氟胞苷
‑
3'
‑
磷酸酯、2'
‑
氟鸟苷
‑
3'
‑
磷酸酯和2'
‑
氟尿苷
‑
3'
‑
磷酸酯；
[0449]
s是硫代磷酸酯连接；和
[0450]
l96是n
‑
[三(galnac
‑
烷基)
‑
酰胺基癸酰基)]
‑4‑
羟基脯氨醇。
[0451]
在上述方法、组合物或在制备中的用途的特定实施方式中，对象是人，且rnai或sirna以治疗有效量向所述对象施用；其中所述rnai或sirna的治疗有效量是从约1mg/kg至约8mg/kg。
[0452]
在本文公开的方法、组合物或用途的一些实施方式中，sirna每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周两次、每周一次、每隔一周、每四个星期或每月一次施用于对象。在一些实施方式中，其中每四周向所述对象施用所述sirna。
[0453]
在某些实施方式中，所述方法包括施用两种hbv基因表达抑制剂和抗hbv抗体。所述两种hbv基因表达抑制剂可以是两种sirna，如靶向不同hbv基因的两种sirna。两种不同hbv基因可以是例如hbsag和hbv x。两种hbv基因表达抑制剂可以同时施用。在某些实施方式中，施用各自定向至hbv基因的两种sirna，并且第一sirna具有包含seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8的反义链；和第二sirna包含具有正义链的sirna，所述正义链包含seq id no:1的核苷酸2850至3182的至少15个相邻核苷酸。在某些实施方式中，施用各自定向至hbv基因的两种sirna，并且第一sirna具有包含seq id no:107或seq id no:109的反义链；和第二sirna包含具有正义链的sirna，所述正义链包含seq id no:1的核苷酸2850至3182的至少15个相邻核苷酸。在某些实施方式中，施用各自定向至hbv基因的两种sirna，并且第
一sirna具有包含seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8的反义链；和第二sirna具有包含seq id no:107或seq id no:109的反义链。在某些实施方式中，第一sirna具有包含seq id no:3、seq id no:5或seq id no:7的正义链；和第二sirna具有包含seq id no:106或seq id no:108的正义链。
[0454]
在某些实施方式中，抗hbv抗体和hbv基因表达抑制剂显示出协同治疗作用。术语“协同作用”用于描述两种或更多种活性剂的组合作用，其大于每种相应活性剂的单独作用的总和。因此，当两种或更多种药剂的组合作用导致活性或过程的“协同抑制”时，意指对活性或过程的抑制大于每个相应活性剂的抑制效果的总和。术语“协同治疗效果”是指用两种或更多种疗法的组合观察到的治疗效果，其中治疗效果(如通过多个参数中的任一个测量)大于用各自的单独疗法观察到的单独治疗效果的总和。
[0455]
在一些实施方式中，向具有hbv感染、和/或hbv相关疾病的对象施用靶向hbv mrna的rnai药剂，使得一种或多种hbv基因的表达、hbv ccc dna水平、hbv抗原水平、hbv病毒负载水平、alt和/或ast(例如，在对象的细胞、组织、血液或流体中)降低至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者更多。
[0456]
在一些实施方式中，向具有hbv感染、和/或hbv相关疾病的对象施用靶向hbv mrna的rnai药剂，并抑制hbv基因表达至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者约100％(即，低于测定的检测水平)。
[0457]
在一些实施方式中，根据本公开内容的组合疗法包含施用作为第三组分的核苷(酸)类似物。如本文所用，术语“核苷(酸)类似物”(或“聚合酶抑制剂”或“逆转录酶抑制剂”)是一种dna复制抑制剂，在结构上与核苷酸或核苷类似，并且特异性抑制hbv cccdna的复制，并且不会显着抑制宿主(例如，人)dna的复制。此类抑制剂包括富马酸替诺福韦地索普西(tdf)、替诺福韦艾拉酚胺(taf)、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦(etv)、替比夫定、agx
‑
1009、恩曲他滨(ftc)、克拉夫定、利托那韦、双吡呋酯、洛布卡韦、泛昔洛韦、n
‑
乙酰基
‑
半胱氨酸(nac)、pc1323、theradigm
‑
hbv、胸腺素
‑
α、更昔洛韦、贝斯福韦(ana
‑
380/lb
‑
80380)和替诺福韦
‑
exaliades(tlx/cmx157)。在某些实施方式中，核苷(酸)类似物是恩替卡韦(etv)。核苷(酸)类似物可从许多来源商购获得，并根据其标签指示(例如，通常以特定剂量口服施用)或根据治疗hbv的本领域技术人员确定，用于本文提供的方法中。
[0458]
抗hbv抗体或hbv基因表达抑制剂可以存在于与第三种活性组分相同的药物组合
物中，或抗hbv抗体、hbv基因表达抑制剂和第三种活性组分可存在于三种不同的药物组合物中。此类不同的药物组合物可以组合/同时或在不同时间或在不同位置(例如，身体的不同部分)给药。
[0459]
v.用于hbv组合疗法的试剂盒
[0460]
本文提供了包含hbv疗法的组分的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包含一种或多种抗hbv抗体、一种或多种hbv基因表达抑制剂，以及任选的hbv组合疗法的第三种组分(例如，核苷(酸)类似物)。试剂盒可另外包含制备和/或施用hbv组合疗法的组分的说明书。
[0461]
实施例
[0462]
实施例1
[0463]
抗体和hbv靶向的sirna的组合疗法减少在aav
‑
hbv小鼠中hbv感染的标志物
[0464]
为确定sirna
‑
抗体组合疗法在治疗hbv感染中是否可能是有效的，向aav/hbv感染的c57bl/6小鼠施用以下十四种不同治疗之一：(1)hbv
‑
特异性sirna(hbv02，具有seq id no:8的反义链)；(2)
‑
(5)四种剂量之一的抗hbv抗体(hbc34抗体hbc34v7，hbc34
‑
v7
‑
mu
‑
igg2a的小鼠嵌合形式)；(6
‑
7)hbv02 sirna和两种抗体剂量之一的hbc34
‑
v7
‑
mu
‑
igg2a抗体；(8
‑
11)hbv02 sirna、四种抗体剂量之一的hbc34
‑
v7
‑
mu
‑
igg2a抗体和恩替卡韦(etv)；(12)对照sirna和对照抗体；(13)仅恩替卡韦；或者(14)仅盐水(见表4)。
[0465]
表4：治疗水平和剂量
[0466][0467]
hbv02是化学合成的双链寡核苷酸，与含有三个galnac残基的配体共价连接。所有核苷酸是2'
‑
ome或2'
‑
f修饰的，并且反义链的一个核酸被(s)
‑1‑
(2,3
‑
二羟基丙基)腺苷(agn)替代。正义链和反义链的核苷酸是通过3'
‑
5'磷酸二酯连接或3'
‑
5'硫代磷酸酯连接而连接，形成所述寡核苷酸的糖
‑
磷酸酯骨架。
[0468]
hbc34是一种针对hbv表面抗原(pres1、pres2和s)的高度中和单克隆抗体。本实验中使用的hbc34抗体是完全鼠源化的hbc34v7，但与hbv表面抗原结合的fab片段部分除外。人hbc34v7具有如seq id no:53所示的v
h
序列和如seq id no:56所示的v
l
序列。用于该实验的hbc34
‑
v7
‑
mu
‑
igg2a抗体中hbc34v7序列的小鼠嵌合形式具有分别如seq id no:99和100所示的重链和轻链氨基酸序列。
[0469]
将靶向人甲状腺素运载蛋白基因的sirna用作对照sirna，因为预计其不会导致血清中感染的hbv标志物减少。
[0470]
本实施例中使用的对照单克隆抗体(mab)是呼吸道合胞病毒特异性抗体，预计不会导致血清中感染的hbv标志物减少。
[0471]
小鼠(c57bl/6品系)用以下量的raav8
‑
1.3hbv毒株ayw，d型接种：通过尾静脉注射，每只小鼠1.0x10
11
个病毒基因组，在200μl体积中。在病毒接种后四周，开始使用测试化合物治疗。
[0472]
给药方案如图1所示。恩替卡韦每天口服一次。在研究开始时皮下施用一次hbv特异性sirna，并在研究的第三周和第四周每周两次腹腔施用抗hbv抗体。一部分小鼠在第四周处死，另一部分在研究的第六周处死。
[0473]
每周两次，从血清样品中测量病毒载量、hbsag和游离hbc34抗体。还测量了血清hbeag、血清丙氨酸转移酶(alt)、肝脏hbcag、肝脏hbsag、肝脏中的总hbv dna(通过qpcr)和血清抗hbv抗体。分析肝淋巴细胞、脾细胞和淋巴结(门静脉/腹腔与腹股沟)以确定hbv特异性ifng
cd4
细胞和ifng
cd8
细胞的比例。
[0474]
治疗组的平均hbsag值如表5中所示。
[0475][0476]
图2a和2b显示了通过hbv dna拷贝数测量的病毒载量，图3a和3b显示了血清hbsag水平。图2a和3a分别显示了分别单独施用hbv02 sirna或hbc34抗体(15mg/kg)时的病毒载量和hbsag水平。相对于盐水对照，hbv02 sirna将血清hbv dna和hbsag分别降低了约0.5
‑
log
10
和1
‑
log
10
。相对于盐水对照，单独的hbc34抗体对hbv dna没有影响，并且将血清hbsag降低<1
‑
log
10
。图2b和3b表明，与盐水对照相比，用hbv02 sirna和hbc34抗体(15mg/kg)治疗
使病毒载量和hbsag水平降低了约3
‑
log
10
。与单独使用任一分子相比，当hbv02 sirna和hbc34抗体联合使用时，血清hbv dna和hbsag的降低显着更强，并且组合效果超过了单一疗法的效果总和。组合疗法也比单独使用恩替卡韦治疗更能降低病毒载量和hbsag水平。无论是否还施用恩替卡韦，均观察到hbv02 sirna和hbc34抗体组合的作用。这些结果表明hbv02 sirna和hbc34抗体具有协同作用降低病毒载量和hbsag的潜力，这种作用与恩替卡韦治疗无关。
[0477]
图4描绘了在第1天研究开始后14天至42天之间测量的游离hbc34抗体水平(第1天＝向选择的治疗组施用sirna)。相对于单独使用hbc34治疗，无论治疗是否包括恩替卡韦，使用hbv02 sirna和hbc34抗体组合治疗都导致更高的初始游离抗体水平，且该水平维持超过28天。图4中显示的结果连同病毒载量和血清hbsag水平表明治疗效果取决于游离循环hbc34抗体的量，并且随着hbsag载量降低，较低剂量的抗体可能会变得有效。例如，联合疗法可能允许通过以下方式进行有效治疗：较少剂量的抗体、较低剂量的抗体和/或侵入性较小的给药途径(例如，皮下而不是静脉内)，至少部分基于在抗体治疗之前减少hbsag的负载。
[0478]
总之，该研究表明，先施用针对hbv的sirna，然后再施用针对hbv的抗体，可有效降低血清hbv dna和hbsag。此外，各个成分似乎协同相互作用，因此这种联合疗法的效果大于单独使用每个成分的效果，也大于如果效果只是相加的预期效果。最后，结果表明sirna的给药可降低血清hbsag，从而使抗体更有效。
[0479]
实施例2
[0480]
以两种抗hbv抗体之一和hbv靶向的sirna的组合疗法
[0481]
为确定使用sirna和抗hbv抗体hbc24的sirna
‑
抗体组合疗法是否有效治疗hbv感染，将受aav/hbv感染的c57bl/6小鼠施用以下十一种不同治疗之一：(1)hbv
‑
特异性sirna(hbv02，具有seq id no:8的反义链；参见在实施例1中的说明)；(2)
‑
(3)抗hbv抗体(全鼠源化hbc24)，以两种剂量之一；(4)
‑
(5)hbv02 sirna(以一种剂量)和全鼠源hbc24(以两种剂量之一)；(6
‑
9)hbv02 sirna(以两种剂量之一)和全鼠源抗hbv抗体hbc34(hbc34
‑
v35
‑
mu
‑
igg2a)(以三种抗体剂量之一)；(10)对照sirna和对照抗体；或者(11)仅pbs，腹腔内施用(参见表6)。
[0482]
表6：实施例2的治疗水平和剂量
[0483][0484]
本实验中使用的hbc24和hbc34抗体除了结合hbv表面抗原的fab片段部分以外是完全鼠源化的。人hbc24具有如seq id no:75所示的v
h
氨基酸序列和如seq id no:76所示的v
l
氨基酸序列。用于该实验的抗体的鼠源化hbc24序列具有重链和轻链，分别包含seq id no:103和104中列出的氨基酸序列。hbc34抗体是鼠源化hbc34v35变体hbc34
‑
v35
‑
mu
‑
igg2a。人hbc34v35具有如seq id no:70所示的重链氨基酸序列和如seq id no:73所示的轻链氨基酸序列。用于该实验的hbc34
‑
v35
‑
mu
‑
igg2a抗体的鼠源化hbc34v35序列具有重链和轻链，分别包含seq id no:101和102中列出的氨基酸序列。
[0485]
对照sirna靶向人转甲状腺素蛋白基因，预计不会导致血清中hbv感染标志物的减少。
[0486]
对照单克隆抗体(mab)是一种针对呼吸道合胞病毒的特异性抗体，预计不会导致血清中hbv感染标志物的减少。
[0487]
对药明康德免疫功能低下的hbv小鼠(wuxi immunocompromisedhbv mouse)进行治疗。这种鼠模型是通过在免疫活性小鼠中转导含有hbv基因组的腺相关病毒的肝细胞而产生的。使用该模型，hbv蛋白的产生受内源性hbv启动子的控制，小鼠产生hbv特异性细胞和体液t细胞应答。然而，没有发生hbv感染，没有产生cccdna，复制是短暂的，且免疫应答受到载体驱动干扰的阻碍。
[0488]
小鼠(c57bl/6品系)用以下量的raav8
‑
1.3hbv毒株ayw，d型接种：通过尾静脉注射，每只小鼠1.0x10
11
个病毒基因组，在200μl体积中。
[0489]
每个治疗组包括五只小鼠。在研究开始时皮下施用一次hbv特异性sirna，在研究的第二周和第三周每周两次腹腔内施用抗hbv抗体。在研究的第六周处死小鼠。
[0490]
在整个研究期间定期收集血清样品，测量病毒载量、hbsag和游离hbc34抗体。还测量了血清hbeag、血清丙氨酸转移酶(alt)、肝脏hbcag、肝脏hbsag、肝脏中的总hbv dna(通过qpcr)和血清抗hbv抗体。分析肝淋巴细胞、脾细胞和淋巴结(门静脉/腹腔与腹股沟)以确定hbv特异性ifng
cd4
细胞和ifng
cd8
细胞的比例。
[0491]
实验结果如图5a和5b(血清hbv dna浓度)、图6a和6b(血清hbsag浓度)以及图7a和7b(血清hbeag浓度)所示。与单独用sirna或对照治疗的小鼠相比，用hbv02和抗hbv抗体之一治疗的小鼠的血清hbv dna浓度、hbsag浓度和hbeag浓度较低。对于hbc34和hbc24抗体都
观察到了这种效应。此外，在较高剂量的hbv02下效果更好，并且当使用较高剂量的hbv02时，在较低的抗体剂量下实现了hbsag的降低。这些结果提供了进一步的证据，即使用hbv02和靶向hbv的单克隆抗体联合治疗比hbv02单药治疗更能降低hbsag和hbeag。这些结果还表明，在给予抗体之前较高剂量的sirna可以在较低剂量的抗体下提供类似的hbsag降低。
[0492]
实施例3
[0493]
在小鼠模型中hbsag的血清清除和病毒进入抑制
[0494]
使用移植了人类肝细胞的免疫缺陷小鼠来测试使用hbv特异性sirna和抗hbv抗体联合治疗清除hbsag的有效性。模型(phoenixbio,japan)使用upa/scid小鼠以产生具有≥70％小鼠肝脏繁殖人肝细胞的小鼠(ohshitah和tateno c,methods mol biol.1506:91
‑
100,(2017))。与aav
‑
hbv模型不同的是，cccdna已建立并可能发生hbv的肝内传播。
[0495]
将原代人肝细胞移植到scid小鼠中，其小鼠肝细胞先前已被酶促破坏。小鼠缺乏t细胞和b细胞。该模型可用于研究hbv感染，包括进入、传播、cccdna调节、肝细胞内在免疫应答和病毒整合到宿主基因组中。该模型还可用于研究人类ifnα对感染的影响。然而，该模型不包括适应性免疫应答的诱导。通过尾静脉对小鼠进行接种，给每只小鼠注射有1.0x107个病毒基因组的hbv基因型c。在感染后第八周开始治疗。
[0496]
向hbv感染小鼠(n＝4，每个治疗组)施用以下七种不同治疗之一：(1)仅pbs；(2
‑
4)抗hbv抗体(完全鼠源化hbc34v35抗体，hbc34
‑
v35
‑
mu
‑
igg2a)，在第二周和第三周期间以三种剂量之一每周腹腔内施用两次；或(5
‑
7)hbv
‑
特异性sirna(hbv02，具有seq id no:8的反义链；参见实施例1的说明)，在研究开始时皮下施用一次，以及完全鼠源化hbc34v35，在第二周和第三周期间以三种剂量之一每周腹腔内施用两次(参见表7)。在第6周处死小鼠。研究设计亦参见图8。
[0497]
表7：治疗水平和剂量
[0498][0499]
本实验中使用的hbc34抗体hbc34v35除了结合hbv表面抗原的fab片段部分以外是完全鼠源化的。人hbc34v35具有如seq id no:70所示的重链氨基酸序列和如seq id no:73所示的轻链氨基酸序列。用于该实验的hbc34
‑
v35
‑
mu
‑
igg2a抗体的鼠源化形式hbc34v35序列具有重链和轻链，分别包含seq id no:101和102中列出的氨基酸序列。
[0500]
在整个研究期间定期收集血清样品，测量病毒载量、hbsag和游离hbc34抗体。还测量了血清hbeag、血清丙氨酸转移酶(alt)、肝脏hbcag、肝脏hbsag、肝脏中的总hbv dna(通过qpcr)和血清抗hbv抗体。分析肝淋巴细胞、脾细胞和淋巴结(门静脉/腹腔与腹股沟)以确
定hbv特异性ifng
cd4
细胞和ifng
cd8
细胞的比例。
[0501]
与施用相同剂量的抗体相比，施用sirna和抗hbv抗体的组合降低了血清hbv dna浓度(图9)和血清hbsag浓度(图10)。对于血清hbeag浓度(图11)和血清hbcrag浓度(图12)观察到类似的趋势。此外，在这个模型系统中，抗体还可以作为病毒进入肝细胞的抑制剂；当hbc34抗体作为单一疗法(即不与sirna组合)以15mg/kg施用时，血清hbv dna浓度(图9)和血清hbsag浓度(图10)也较低。
[0502]
该研究在真实感染模型中提供了实验支持，即当hbv02 sirna和hbc34抗体联合使用时，与hbc34单药治疗相比，hbv dna和hbsag水平降低的程度更大。
[0503]
实施例4
[0504]
sirna抗体组合疗法治疗慢性hbv感染的临床评价
[0505]
进行了sirna
‑
抗体联合疗法的2期临床研究，以评估联合疗法对慢性hbv感染的人类患者的疗效。表8显示了该研究的治疗方案。该研究可能包括另外的队列以测试另外治疗对组合疗法的影响(例如，9个队列，如果测试了两种另外的治疗)。每个组/队列包括十五名患者。
[0506]
表8：临床试验的治疗水平和剂量
[0507][0508]
图13显示了为2期研究设计的治疗方案。该研究包括24周的治疗和24周的随访。所有患者在进入研究时均无肝硬化且nuc受到抑制(用核苷(酸)类似物治疗)。在整个研究过程中，所有患者组都可以接受nuc治疗(例如，每天口服替诺福韦或恩替卡韦)。该研究从接受hbv02 sirna为期八周的导入治疗的所有队列开始。例如，hbv02的剂量可以是每四个星期皮下施用的两剂400mg。但是，可以在2期试验之前通过单一疗法试验确定合适的剂量。研究八周后，所有队列都继续使用hbv02进行治疗；队列2、4和6开始使用低剂量的hbc34抗体(hbc34v35)进行治疗；队列3、5和7开始使用更高剂量的hbc34抗体进行治疗；队列1未接受hbc34抗体治疗。低剂量的hbc34v35可以是，例如，每两周静脉注射0.5克；更高的剂量可以是，例如，每两周静脉注射2克。在第2阶段试验之前，可以通过单一疗法试验验证适当的剂量。在研究的第12周期间，第1
‑
3组可能每周接受一次另外的治疗。此外，一些队列(例如，队列6和7)可能会接受另一种治疗。治疗24周后，对患者进行监测和评估以确定是否实现了功能性治愈，其通过可检测的血清hbsag和/或抗hb血清学转换的消失来指示。
[0509]
虽然已经说明和描述了特定实施方式，但是很容易理解，上述各种实施方式可以组合以提供进一步的实施方式，并且可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。
[0510]
除非另有说明，否则本说明书中提及或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开文件、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括于2018年12月20日提交的美国临时专利申请号62/782,896的全部内容通过引用并入本文。如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外进一步的实施方式，则可以修改实施方式的方面。
[0511]
根据以上详细描述，可以对实施方式进行这些和其他改变。在通常情况下，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制在说明书和权利要求中公开的特定实施方式，而应被解释为包括所有可能的实施方式以及这些权利要求所享有的等效物的完整范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。
再多了解一些
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