一种呋喃酮的降血脂作用及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及利用微生物次级代谢产物制备活性化合物技术领域，更具体地，涉及一种呋喃酮：5
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羟基
‑3‑
甲氧基
‑5‑
甲基
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2(5h)
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呋喃酮的降血脂作用及其制备方法和应用。


背景技术：

2.高血脂症是指以血浆中一种或多种脂类物质水平过高为主要表现的一类疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、肥胖病等，高脂血症的临床表现主要是脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤和脂质在血管内皮沉积所引起的动脉硬化。临床上将血脂异常分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症和低高密度脂蛋白血症。
3.近年来，随着生活水平的提高，高血脂症患者数量日渐增多。目前临床上用于治疗高血脂症的多为他汀类药物，虽有显著的疗效，但是却具有一定的肝肾毒性，长期用药可能会导致不同程度的肝功能受损。因此很有必要去寻找一种更加安全有效的治疗高血脂症的药物。
4.随着相关技术的不断进步，从微生物尤其是真菌和放线菌的次级代谢产物中筛选寻找具有降血脂、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等具有潜在医疗价值的活性化合物变得愈发快速和高效。


技术实现要素：

5.针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种具有降血脂作用的5
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羟基
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甲氧基
‑5‑
甲基
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2(5h)
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呋喃酮，以期待对有效降血脂提供帮助。
6.为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种具有降血脂作用的5
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羟基
‑3‑
甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮，其结构式如下所示。
7.显然，上述化合物通过确定绝对构型证明了其结构的新颖性，而且具有从未被发现的降血脂作用而具有创造性。
8.本发明的第二方面提供5
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羟基
‑3‑
甲氧基
‑5‑
甲基
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2(5h)
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呋喃酮的降血脂作用及其制备方法和应用，包括步骤：(a) 将菌株活化后接种到pyg培养基中，摇瓶培养得到发酵产物；(b) 将发酵液过滤去除菌丝体，经有机溶剂萃取后获得萃取液，萃取液合并浓缩后得粗浸膏；(c) 粗浸膏经初步分离后得到粗组分，再从粗组分中分离得到5
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羟基
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甲氧基
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5
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮；作为本发明优选的实施方式，步骤(a)中，所述菌株活化的过程包括：将所述菌株从
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80℃冰箱中复苏，接种到pda固体培养基上，于28℃恒温培养箱中静置，活化培养3～5天。
9.作为本发明优选的实施方式，所述pda固体培养基的配制包括：称取150g马铃薯，洗净去皮，切成小块，加水至1000ml煮烂，用八层纱布过滤，滤液中加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，加入15g葡萄糖，搅拌均匀，最后补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，高压蒸汽灭菌冷却后贮存备用。
10.作为本发明优选的实施方式，步骤(a)中，pyg培养基的配制包括：称取葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉2g，加水至1000ml，搅拌均匀，分装试管或者锥形瓶，高压蒸汽灭菌冷却后贮存备用。
11.作为本发明优选的实施方式，所述摇瓶培养条件为：温度28℃，转速180rpm，培养天数14天。
12.作为本发明优选的实施方式，步骤(b)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯，得到所述粗浸膏具体包括：将发酵液用300目纱绢分离菌丝体与滤液。滤液用等体积乙酸乙酯萃取３次，菌丝体用80％丙酮
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水进行超声提取３次，丙酮蒸干后水相用等体积乙酸乙酯萃取３次，萃取液合并浓缩后得粗浸膏。
13.作为本发明优选的实施方式，步骤(c)中，分离得到所述5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮具体包括：采用减压柱层析对粗浸膏经进行初步分离后，采用石油醚
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丙酮和二氯甲烷
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甲醇体系进行梯度洗脱，得到粗组分，通过反复正相硅胶柱层析、ods反相柱层析以及凝胶柱层析、mplc及半制备高效液相色谱分离等方法从粗组分中分离得到5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮。
14.为进一步测试本发明的5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮的生物活性，采用hepg2细胞进行体外脂质堆积活性评价试验。
15.试验表明，本发明分离得到的5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮能显著的抑制脂质积累，具有优异的降血脂作用，因此具有用于制备预防或治疗高血脂症药物的潜力。
16.本发明的有益效果：本发明公开了一种全新的具有降血脂作用的5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮，由同一株真菌通过发酵培养及提纯后得到，其结构为天然产物中首次发现，绝对结构新颖。经活性测试发现，能显著抑制脂质积累，具有优异的降血脂作用，因此具有用于制备预防或治疗高血脂症药物的潜力。
17.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
18.图 1为实施例中5
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羟基
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甲氧基
‑5‑
甲基
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2(5h)
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呋喃酮的降血脂活性的测试结果图。
19.具体实施方式
20.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
21.菌种来源真菌菌株分离于中国盐城沿海滩涂，该菌株目前由本实验室保藏于
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86℃超低温冰箱，菌株编号为pc200921
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2。
22.培养基pda固体培养基：称取150g马铃薯，洗净去皮，切成小块，加水至1000ml煮烂，用八层纱布过滤，滤液中加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，加入15g葡萄糖，搅拌均匀，最后补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，高压蒸汽灭菌冷却后贮存备用。
23.pyg培养基：称取葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉2g，加水至1000ml，搅拌均匀，分装试管或者锥形瓶，高压蒸汽灭菌冷却后贮存备用。
24.实施例：1、菌株种子液将所述菌株从
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80℃冰箱中复苏，接种到pda固体培养基上，于28℃恒温培养箱中静置，活化培养3～5天。
25.将上述步骤已经活化的菌株落接种于含有250ml pyg培养基的500ml锥形瓶中，在摇床上28℃下以180rpm振荡培养3天，获得种子液。
26.2、化合物的发酵以每瓶接种10ml的量将上述种子液接种到发酵培养基中（步骤a中高压蒸汽灭菌冷却后贮存备用的pyg培养基），在摇床上28℃下以180rpm振荡培养培养14天后终止发酵。
27.3、化合物的制备将发酵液用300目纱绢分离菌丝体与滤液。滤液用等体积乙酸乙酯萃取３次，菌丝体用80％丙酮
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水进行超声提取３次，丙酮蒸干后水相用等体积乙酸乙酯萃取３次，萃取液合并浓缩后得粗浸膏。
28.采用减压柱层析对粗浸膏经进行初步分离（拌样为100～200目硅胶，填料为200～300目硅胶）。
29.采用石油醚
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丙酮（体积比1:1）和二氯甲烷
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甲醇体系体积比（20:1）进行梯度洗脱，得到粗组分。
30.通过反复正相硅胶柱层析、ods反相柱层析以及凝胶柱层析、mplc及半制备高效液相色谱分离等方法从粗组分中分离得到5mg化合物。
31.将分离纯化得到的化合物进行结构鉴定，其具体结构如下所示：
测试例：hepg2细胞体外脂质堆积实验取对数期hepg2细胞加入96孔板中(每孔100μl,约10000～15000个细胞)，待70％～80％细胞吸附后，将培养基替换成无血清的mem培养基，饥饿处理24h。
32.实验分为空白组、模型组、阳性对照组、样品组。空白组仅为无血清mem培养基，模型组为加入了油酸(100μm)的无血清mem培养基，阳性对照组为加入了油酸(100μm)和辛伐他汀(10μm即4 .18mg/ml)的无血清mem培养基，样品组为加入了油酸(100μm)和样品(10mg/ml)的无血清mem培养基，继续培养24h。
33.移除培养基，pbs清洗一次，用4％多聚甲醛固定30分钟后，pbs清洗一次，用体积比为60％异丙醇/水处理10分钟后，加入50μl油红工作液(工作液由0.3g/100ml油红/异丙醇的母液与水体积比3:2配制而成)，20分钟后，pbs清洗三次，加入70μl异丙醇溶解，在酶标仪520nm波长下测od值。结果见图1(注：与模型组比较，***p<0 .001)。
34.观察图1可以发现，化合物5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮可显著抑制hepg2细胞内脂质堆积，显示与阳性对照辛伐他汀相当的活性，说明化合物5
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羟基
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甲氧基
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甲基
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2(5h)
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呋喃酮具有优异的降血脂能力。本发明可为研制新的预防或治疗高血脂症药物提供了新的天然来源的先导化合物，具有很好的开发应用前景。
35.以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。