用于增强执行功能的营养组合物的制作方法

用于增强执行功能的营养组合物
1.本发明涉及人乳低聚糖(hmo)或包含hmo的组合物用于增强个体的执行功能的用途。本发明还涉及hmo或包含hmo的组合物，其用于预防或治疗个体的次优执行功能。


背景技术：

2.执行功能是协调和整合与时间和空间相关的认知
‑
感知过程，从而确定个体能够多好地识别、评估并在各种替代选项和策略中做出选择的能力。它支配目标导向行为，并且在调节诸如问题解决、推理、灵活思维和决策之类的高阶认知过程中起到基本作用。它对认知发育和学习(尤其是新技能的认知发育和学习)极为重要，并且已经与社会和智力/学术成功/成就强烈相关。
3.考虑到执行功能与社会和智力/学术成功之间的关联，期望找到增强这种关联的方法。此外，还需要找到治疗和/或预防次优执行功能的方法，该次优执行功能可阻碍认知发育和学习，并且不利地影响智力和学术成功/成就。根据严重程度，次优执行功能甚至会对日常工作产生负面影响。
4.次优执行功能可与多种认知病症相关，包括注意力缺陷多动障碍(adhd)、阿尔茨海默病、强迫症(ocd)、图雷特综合征、创伤后应激障碍(ptsd)和血管性痴呆。还据信，其在早产或小于胎龄(sga)的个体中更为普遍。另外已知，随着年龄增长，执行功能可能会下降。因此，可能特别需要增强这些患者组的执行功能。
5.令人惊讶的是，本发明人现已发现食用hmo可增强个体的执行功能。该发现源于小猪中的几个临床前研究，所述研究包含若干测试的组合，当整体考虑时，其结果可被视为执行功能的指示，例如个体抑制响应、调整策略、识别、评估以及在各种替代选项和/或策略中作出选择的能力。


技术实现要素：

6.本发明在权利要求书中进行了陈述，并且在本文所包括的具体实施方式中进行了描述。
7.本发明提供了hmo或包含hmo的营养组合物用于增强个体的执行功能的用途。
8.本发明还提供了hmo或包含hmo的营养组合物，其用于治疗和/或预防个体的次优执行功能。
9.hmo可为岩藻糖基化低聚糖、n
‑
乙酰化低聚糖和/或唾液酸化低聚糖。
10.岩藻糖基化低聚糖的非限制性示例包括：2
’‑
岩藻糖基乳糖(2’fl)’、3’岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖(difl)、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖(诸如，乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖i、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖ii、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖iii、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖v)、乳糖
‑
n
‑
岩藻六糖、乳糖
‑
n
‑
二岩藻六糖i、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
六糖、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖(诸如，岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖i、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖ii)、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
六糖i、二岩藻糖基
‑
乳糖
‑
n
‑
新六糖、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖i、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖ii、岩藻糖基
‑
对
‑
乳糖
‑
n
‑
六糖、三岩藻基
‑
对
‑
乳糖
‑
n
‑
六糖i以及它们的任何组合。
11.特别有效的岩藻糖基化低聚糖可以是2
’‑
岩藻糖基乳糖(2fl)和二岩藻糖基乳糖(di fl)。
12.n
‑
乙酰化低聚糖的非限制性示例包括：lnt(乳糖
‑
n
‑
四糖)、对
‑
乳糖
‑
n
‑
新六糖(对
‑
lnnh)、lnnt(乳糖
‑
n
‑
新四糖)以及它们的任何组合。其它示例为乳糖
‑
n
‑
六糖、乳糖
‑
n
‑
新六糖、对
‑
乳糖
‑
n
‑
六糖、对
‑
乳糖
‑
n
‑
新六糖、乳糖
‑
n
‑
八糖、乳糖
‑
n
‑
新八糖、异
‑
乳糖
‑
n
‑
八糖、对
‑
乳糖
‑
n
‑
八糖和乳糖
‑
n
‑
十糖。
13.特别有效的n
‑
乙酰化低聚糖可为lnt(乳糖
‑
n
‑
四糖)、lnnt(乳糖
‑
n
‑
新四糖)以及它们的组合。
14.唾液酸化低聚糖的非限制性示例包括：3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)、6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)。
15.在一个方面，本发明涉及包含唾液酸化低聚糖的营养组合物，其用于改善髓鞘形成以使前额皮质区成熟，从而有助于增强人类儿童或婴儿(例如早产婴儿或sga婴儿)的执行功能。唾液酸化低聚糖为3
’‑
sl、6
’‑
sl或它们的组合。
16.特别有效的唾液酸化低聚糖可以是3'
‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)、6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)以及它们的组合。
17.因此，如果hmo选自：2
’‑
岩藻糖基乳糖(2’fl)、difl、lnt、lnnt、唾液酸乳糖以及前述物质的任何组合，则可能是特别有益的。
18.唾液酸乳糖可选自3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)、6
’‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)、以及它们的组合。如果唾液酸乳糖是6
’‑
唾液酸乳糖、或3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸乳糖(6'
‑
sl)的组合，则可能是特别有益的。
19.hmo的特别有效的组合可以是
[0020]2’
fl、difl、lnt和lnnt，
[0021]3’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)，以及
[0022]2’
fl、difl、lnt和lnnt、3'
‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)。
[0023]
执行功能可以是识别、评估和/或在各种替代选项和/或策略中做出选择。因此，hmo或包含hmo的营养组合物可特别有效地增强个体识别、评估和/或在各种替代选项和/或策略中做出选择的能力。
[0024]
个体可以是哺乳动物，并且例如可以是人或伴侣动物。hmo或包含hmo的组合物可特别适用于或特别有效于人类儿童或婴儿，例如早产婴儿或sga婴儿。
[0025]
如果hmo或包含hmo的组合物用于治疗和/或预防次优执行功能，则其可对患有adhd、阿尔茨海默病、ocd、图雷特综合征、ptsd或血管性痴呆的个体特别有效。它也可以对早产或sga出生的衰老的人或婴儿或儿童特别有效。
[0026]
包含hmo的营养组合物可以是婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、早产婴儿配方食品、强化剂、人乳强化剂、婴孩食物配方食品、成长乳、婴儿谷物组合物、食物产品、用于临床营养的医疗食物产品、补充剂、宠物食物产品、或宠物的补充剂。
[0027]
本发明还提供了hmo或包含hmo的组合物，其用于制备用于预防和/或治疗个体的次优执行功能的组合物。
[0028]
本发明还提供了预防和/或治疗个体的次优执行功能的方法，所述方法包括向所述个体施用如本文所公开的hmo和/或包含hmo的组合物的步骤，所述方法可任选地包括鉴
定患有次优执行功能的个体的步骤。
[0029]
本发明还提供了增强个体的执行功能的方法，所述方法包括向所述个体施用如本文所公开的hmo和/或包含hmo的组合物的步骤。
附图说明
[0030]
图1：处于补充有乳a、b、c、对照乳的离乳前饮食或由母猪喂养的猪的表现评分，对该表现评分进行计算以评估一般工作记忆。不同的字母指示显著差异(p<0.05)
[0031]
图2：处于补充有乳a、b、c、对照乳的离乳前饮食或由母猪喂养的猪的表现评分，对该表现评分进行计算以评估参考记忆。不同的字母指示显著差异(p<0.05)
[0032]
图3：处于补充有乳a、b、c、对照乳的离乳前饮食或由母猪喂养的猪的表现评分，对该表现评分进行计算以评估工作记忆。不同的字母指示显著差异(p<0.05)
[0033]
图4：接受无6’sl的乳的幼鼠和成年小鼠的前额和海马区脑样本中髓磷脂基因的表达，将该表达归一化为接受含6’sl的乳的小鼠的表达水平。星号指示与对照的显著差异(p<0.05)。
具体实施方式
[0034]
在本发明的第一方面，提供了hmo或包含hmo的营养组合物用于增强个体的执行功能的用途。
[0035]
hmo可为岩藻糖基化低聚糖、n
‑
乙酰化低聚糖、唾液酸化低聚糖或前述物质中任一者的任何组合。
[0036]
在一个实施方案中，hmo为岩藻糖基化低聚糖。
[0037]
在一个实施方案中，hmo为n
‑
乙酰化低聚糖。
[0038]
在一个实施方案中，hmo为唾液酸化低聚糖。
[0039]
在一个实施方案中，hmo为一种或多种岩藻糖基化低聚糖与一种或多种n
‑
乙酰化低聚糖的组合。
[0040]
在一个实施方案中，hmo为一种或多种岩藻糖基化低聚糖和一种或多种n
‑
乙酰化低聚糖以及一种或多种唾液酸化低聚糖的组合。
[0041]
岩藻糖基化低聚糖的非限制性示例包括：2'
‑
岩藻糖基乳糖(2’fl)、3’岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖(difl)、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖(诸如，乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖i、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖ii、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖iii、乳糖
‑
n
‑
岩藻五糖v)、乳糖
‑
n
‑
岩藻六糖、乳糖
‑
n
‑
二岩藻六糖i、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
六糖、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖(诸如，岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖i、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖ii)、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
六糖i、二岩藻糖基
‑
乳糖
‑
n
‑
新六糖、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖i、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新六糖ii、岩藻糖基
‑
对
‑
乳糖
‑
n
‑
六糖、三岩藻基
‑
对
‑
乳糖
‑
n
‑
六糖i以及它们的任何组合。
[0042]
特别有效的岩藻糖基化低聚糖可以是2
’‑
岩藻糖基乳糖(2fl)和二岩藻糖基乳糖(di fl)。
[0043]
在一个实施方案中，岩藻糖基化低聚糖选自2
’‑
岩藻糖基乳糖(2fl)、二岩藻糖基乳糖(di fl)以及它们的组合。
[0044]
n
‑
乙酰化低聚糖的非限制性示例包括：lnt(乳糖
‑
n
‑
四糖)、对
‑
乳糖
‑
n
‑
新六糖
(对
‑
lnnh)、lnnt(乳糖
‑
n
‑
新四糖)以及它们的任何组合。其它示例为乳糖
‑
n
‑
六糖、乳糖
‑
n
‑
新六糖、对
‑
乳糖
‑
n
‑
六糖、对
‑
乳糖
‑
n
‑
新六糖、乳糖
‑
n
‑
八糖、乳糖
‑
n
‑
新八糖、异
‑
乳糖
‑
n
‑
八糖、对
‑
乳糖
‑
n
‑
八糖和乳糖
‑
n
‑
十糖。
[0045]
特别有效的n
‑
乙酰化低聚糖可以是lnt(乳糖
‑
n
‑
四糖)和lnnt(乳糖
‑
n
‑
新四糖)。
[0046]
在一个实施方案中，n
‑
乙酰化低聚糖选自lnt(乳糖
‑
n
‑
四糖)、lnnt(乳糖
‑
n
‑
新四糖)以及它们的组合。
[0047]
唾液酸化低聚糖的非限制性示例包括：3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)、6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)。
[0048]
在一个实施方案中，唾液酸化低聚糖选自：3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)、6
’‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)以及它们的组合。
[0049]
在一个实施方案中，hmo选自2
’‑
岩藻糖基乳糖(2’fl)、difl、lnt、lnnt、唾液酸乳糖以及前述物质的任何组合。
[0050]
在一个实施方案中，hmo为2’fl、difl、lnt和lnnt的组合。
[0051]
在一个实施方案中，hmo为3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)的组合。
[0052]
在一个实施方案中，hmo为2’fl、difl、lnt、lnnt、3'
‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)的组合。
[0053]
如本文所用，术语“3
’‑
唾液酸乳糖”(3
’‑
sl、3
‑
sl、3’sl或3sl)是指(6r)
‑5‑
乙酰胺基
‑
3,5
‑
二脱氧
‑6‑
[(1r,2r)
‑
1,2,3
‑
三羟基丙基]
‑
β
‑
l
‑
苏式
‑
己
‑2‑
吡喃酮糖基
‑
(2
‑
>3)
‑
β
‑
d
‑
吡喃半乳糖基
‑
(1
‑
>4)
‑
d
‑
吡喃葡萄糖(iupac)。
[0054]
如本文所用，术语“6
’‑
唾液酸乳糖”(6
’‑
sl、6
‑
sl、6’sl或6sl)是指(6r)
‑5‑
乙酰胺基
‑
3,5
‑
二脱氧
‑6‑
[(1r,2r)
‑
1,2,3
‑
三羟基丙基]
‑
β
‑
l
‑
苏式
‑
己
‑2‑
吡喃酮糖基
‑
(2
‑
>6)
‑
β
‑
d
‑
吡喃半乳糖基
‑
(1
‑
>4)
‑
d
‑
吡喃葡萄糖(iupac)。
[0055]
如本文所用，术语lnt(乳糖
‑
n
‑
四糖)是指β
‑
d
‑
半乳糖
‑
己吡喃糖基
‑
(1
‑
>3)
‑2‑
乙酰胺基
‑2‑
脱氧
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖
‑
己吡喃糖基
‑
(1
‑
>3)
‑
β
‑
d
‑
半乳糖
‑
己吡喃糖基
‑
(1
‑
>4)
‑
d
‑
葡萄糖
‑
己吡喃糖(iupac)。
[0056]
如本文所用，术语lnnt(乳糖
‑
n
‑
新四糖)是指β
‑
d
‑
半乳糖
‑
己吡喃糖基
‑
(1
‑
>4)
‑2‑
乙酰胺基
‑2‑
脱氧
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖
‑
己吡喃糖基
‑
(1
‑
>3)
‑
β
‑
d
‑
半乳糖
‑
己吡喃糖基
‑
(1
‑
>4)
‑
d
‑
葡萄糖
‑
己吡喃糖(iupac)。
[0057]
如本文所用，术语2
’‑
岩藻糖基乳糖(2fl)是指(2r,3r,4r,5r)
‑4‑
[(2s,3r,4s,5r,6r)
‑
4,5
‑
二羟基
‑6‑
(羟甲基)
‑3‑
[(2s,3s,4r,5s,6s)
‑
3,4,5
‑
三羟基
‑6‑
甲基氧杂环己
‑2‑
基]氧基氧杂环己
‑2‑
基]氧基
‑
2,3,5,6
‑
四羟基己醛(iupac)。
[0058]
如本文所用，术语二岩藻糖基乳糖(di fl)是指(3s,4s,5s,6r)
‑6‑
(羟甲基
‑5‑
[(2s,3r,4s,5r,6r)
‑
3,4,5
‑
三羟基
‑6‑
(羟甲基)氧杂环己
‑2‑
基]氧基
‑
2,3
‑
双[(3s,4r,5s,6s)
‑
3,4,5
‑
三羟基
‑6‑
甲基氧杂环己
‑2‑
基]氧杂环己
‑
2,3,4
‑
三醇(iupac)。
[0059]
n
‑
乙酰化低聚糖(例如，lnnt和/或lnt)可采用酶转移法，即使用糖基转移酶将供体部分的糖单元转移到受体部分来化学合成，如例如美国专利no.5,288,637和wo 96/10086中所述。另选地，lnt和lnnt可通过将游离的或与低聚糖(例如，乳果糖)结合的酮
‑
六糖(例如，果糖)化学转化成n
‑
乙酰六糖胺或包含n
‑
乙酰六糖胺的低聚糖来制备，如
wrodnigg,t.m.；stutz,a.e.(1999)angew.chem.int.ed.38:827
‑
828中所述。然后可将用这种方式制得的n
‑
乙酰基
‑
乳糖胺转移到作为受体部分的乳糖。
[0060]
可采用层析技术或过滤技术从天然来源(诸如动物乳)中分离出唾液酸化低聚糖，例如3
’‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和/或6
’‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)。另选地，也可使用特定唾液酸基转移酶或唾液酸酶、神经氨酸苷酶，通过生物技术手段，通过基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术、通过化学合成或通过微生物发酵技术，来制备唾液酸化低聚糖。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(dp)的受体底物开始形成唾液酸基低聚糖，从dp＝1开始。另选地，可通过由乳糖和游离n'
‑
乙酰神经氨酸(唾液酸)的化学合成来产生唾液酸基乳糖。唾液酸乳糖也可从例如kyowa hakko kogyo,japan或genechem,republic of korea商购获得。
[0061]
可采用层析技术或过滤技术从天然来源(诸如动物乳)中分离出岩藻糖基化低聚糖，例如2’fl和/或difl。另选地，也可使用特定岩藻糖基转移酶和/或岩藻糖苷酶，通过生物技术手段，通过使用基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术或微生物发酵技术，来制备岩藻糖基化低聚糖。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(dp)的受体底物开始形成岩藻糖基化低聚糖，从dp＝1开始。另选地，可以通过由乳糖和游离岩藻糖化学合成来制备岩藻糖基化低聚糖。岩藻糖基化低聚糖也可从例如日本协和发酵工业株式会社(kyowa,hakko,kogyo)购得。
[0062]
如本文所用，术语“执行功能”是指识别、评估并在各种替代选项和策略中做出选择的能力。该术语涵盖目标导向行为、计划和/或认知灵活性。
[0063]
如本文所用，术语“个体”是指哺乳动物，并且可例如为人或动物，诸如伴侣动物，例如猫或狗。
[0064]
在本发明的一个实施方案中，个体是人或伴侣动物，例如猫或狗。人可以是婴儿、幼儿、儿童、青少年或包括衰老成人的成人。
[0065]
衰老成人可以是50岁或以上、例如60岁或以上、70岁或以上、80岁或以上、90岁或以上的人。人婴儿是12个月或更小的人。“幼儿”是指介于一和七岁之间、例如介于人1和3岁之间的。“儿童”可以是幼儿。
[0066]
婴儿可以是早产婴儿、小于胎龄(sga)婴儿和/或低出生体重(lbw)婴儿。
[0067]
术语“早产儿”是指不足月出生的婴儿或幼儿。通常是指在妊娠满36周之前出生的婴儿或幼儿。
[0068]
表述“小于胎龄”或”“sga”是指个头小于同胎龄出生的正常标准(最常被定义为体重在同胎龄的第10个百分位以下)的婴儿或幼儿。在一些实施方案中，sga可能与宫内生长受限(iugr)相关联，其中iugr是指胎儿无法达到其潜在个头的病症。
[0069]
表述“低出生体重”应理解为出生时不足2500g的任何体重。因此其涵盖：
[0070]
‑
出生时体重为1800至2500g的婴儿或幼儿(通常称为“低出生体重”或lbw)
[0071]
‑
出生时体重为1000至1800g的婴儿或幼儿(称为“极低出生体重”或vlbw)
[0072]
‑
出生时体重不足1000g的婴儿或幼儿(称为“超低出生体重”或elbw)
[0073]
低出生体重的婴儿或幼儿可能是或可能不是早产儿，并且类似地，胎龄偏小的婴
儿或幼儿可能是或可能不是早产儿。
[0074]
hmo是存在于人母乳(人乳低聚糖)中的化合物，因此，如果将hmo或包含hmo的组合物施用给婴儿或儿童，并且特别是婴儿配方食品或成长乳喂养的婴儿或儿童，则可能是特别有益的。虽然向所有婴儿推荐母乳喂养，但在某些情况下，由于医学原因，母乳喂养不足或不可能。在这些情况下，婴儿配方食品或成长乳成为生命线，因为它们可用作母乳的替代物。
[0075]
因此，在一个实施方案中，个体是人婴儿或幼儿，并且在更具体的实施方案中，个体仍然是婴儿配方食品或成长乳喂养的人婴儿或儿童。
[0076]
个体可以是未患有次优执行功能的健康个体。
[0077]
执行功能可通过技术人员熟知的方法来测量。
[0078]
例如，通过评价(可能整体地评价)已知构成执行功能的不同认知技能，例如抑制、工作记忆、认知灵活性、模式识别测试等。
[0079]
在儿童中例如是维度变化卡片分类(dccs)任务，在成人中例如是威斯康星卡片分类任务。向参与者显示目标卡并要求其根据一个维度(例如，颜色)对一系列二价测试卡进行分类。在切换阶段期间，告诉他们根据另一个维度(例如，形状)对相同类型的测试卡进行分类。
[0080]
未患有次优执行功能的个体将具有在被视为正常(非病理)的范围内(例如针对个体的类型和年龄)的测试评分。
[0081]
可将hmo或包含hmo的营养组合物施用给泌乳哺乳动物，从而经由母乳喂养施用给婴儿。不受理论的束缚，本发明人认为hmo或其代谢物可经由母乳转移至婴儿。
[0082]
还可将hmo或包含hmo的营养组合物施用给怀孕的哺乳动物或尝试怀孕(孕前)的哺乳动物，从而施用给在子宫内的婴儿。不受理论的束缚，本发明人认为hmo或其代谢物可转移至在子宫内的婴儿。
[0083]
因此，在本发明的另一个实施方案中，产后经由母乳喂养将hmo或包含hmo的组合物施用给婴儿。
[0084]
包含hmo的组合物可为适于由个体食用的任何类型的组合物。
[0085]
在本发明的一个实施方案中，该组合物选自婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、早产婴儿配方食品、强化剂、人乳强化剂、婴孩食物配方食品、成长乳、婴儿谷物组合物、食物产品、用于临床营养的医疗食物产品、补充剂、宠物食物产品、或宠物的补充剂。
[0086]
在本发明的更具体的实施方案中，包含hmo的组合物是婴儿配方食品、人乳强化剂或补充剂。
[0087]
医疗食物产品是专门配制的并旨在用于疾病或医学病症的膳食管理(例如，用于预防或治疗不期望的医学病症)。医疗食物产品可提供临床营养，例如，满足存在医学病症的患者或具有特定营养需求的其他人士的特殊营养需求。医疗食物产品可以是完全膳食、部分膳食、作为食物添加剂或者用于溶解的粉末的形式。
[0088]
食物产品、医疗食物或营养组合物可以是任何口服营养形式，例如作为保健饮料，作为即食饮料，任选地作为软饮料，包括酒吧里的果汁、奶昔、酸奶饮料、冰沙或大豆基饮料，或者分散于任何类型的食物中，诸如烘烤产品、谷物棒、乳制品棒、快餐食物、汤、早餐谷
物、木斯里、糖果、片(tabs)、曲奇、饼干、薄脆饼干(诸如米饼)和乳制品。
[0089]
补充剂可以是例如片剂、胶囊剂、锭剂或液体的形式。可将补充剂作为可摄入的载体或承载物添加到消费者可接受的产品中。此类载体或承载物的非限制性示例是药物、食物组合物。食物组合物的非限制性示例为乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、含乳发酵产品、基于发酵谷物的产品、含乳粉、人乳、早产儿配方食品、婴儿配方食品、口服补充剂和管饲物。
[0090]
如本文所用，术语“婴儿配方食品”是指旨在用于生命的前几个月期间的婴儿的特定营养用途，而且本身可满足这类人的营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/eec 2006/141/ec号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如在食品法典委员会(法典stan 72
‑
1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述“婴儿配方食品”既涵盖“1段婴儿配方食品(starter infant formula)”，也涵盖“2段婴儿配方食品(follow
‑
up formula)”或“较大婴儿配方食品(follow
‑
on formula)”。
[0091]
一般来讲，“1段婴儿配方食品”旨在用作出生婴儿的母乳替代品。
[0092]“较大婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
[0093]
如本文所用，术语“早产婴儿配方食品”是指旨在用于早产婴儿的婴儿配方食品。
[0094]
如本文所用，术语“乳强化剂”是指适于与母乳(对于人乳强化剂而言，其为人乳)或婴儿配方食品混合的液体或固体营养组合物。它用于增加喂给具有低出生体重的早产婴儿或婴儿的母乳中的卡路里、蛋白质、矿物质和维生素。术语“母乳”应理解为母亲的乳汁或母亲的初乳，或者供乳者的乳汁或供乳者的初乳。
[0095]
如本文所用，术语“婴孩食物配方食品”是指旨在供婴儿或儿童(诸如幼儿)在生命的头几年期间用于特定营养用途的食料。
[0096]
如本文所用，术语“成长乳”(或gum)是指一年后提供的乳配方食品产品。它通常为适合幼儿的特定营养需要的乳制品饮料。
[0097]
如本文所用，术语“婴儿谷物组合物”是指旨在供婴儿或儿童(诸如幼儿)在生命的头几年期间用于特定营养用途的食料。
[0098]
除了hmo，本发明的组合物还可包含已知用于所涉及的组合物类型(例如，婴儿配方食品)的任何其他成分或赋形剂。
[0099]
此类成分的非限制性示例包括：蛋白质、氨基酸、碳水化合物、低聚糖(除hmo以外)、脂质、益生元或益生菌、核苷酸、核苷、其他维生素、矿物质和其他微量营养素。
[0100]
如果组合物为用于婴儿或幼儿的组合物，则该组合物可例如包含蛋白质源、脂质源和碳水化合物源。例如，此类组合物可包含在约2至6g/100kcal的范围内的蛋白质，在约1.5至3g/100kcal范围内的脂质和/或在约1.7至12g/100kcal的范围内的碳水化合物。如果所述组合物是液体，则其能量密度可介于60和75kcal/100ml之间。如果所述组合物是固体，则其能量密度可介于60和75kcal/100g之间。
[0101]
蛋白质的非限制性示例包括：酪蛋白、α
‑
乳白蛋白、乳清、β乳球蛋白、大豆蛋白质、大米蛋白质、玉米蛋白质、燕麦蛋白质、大麦蛋白质、小麦蛋白质、黑麦蛋白质、豌豆蛋白质、卵蛋白质、葵花籽蛋白质、马铃薯蛋白质、鱼蛋白质、肉蛋白质、乳铁蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白以及它们的组合。
[0102]
氨基酸的非限制性示例包括亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、l
‑
丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸以及它们的组合。
[0103]
碳水化合物的非限制性示例包括乳糖、蔗糖(saccharose)、麦芽糖糊精、淀粉以及它们的组合。
[0104]
脂质的非限制性示例包括：棕榈油精、高油酸葵花油、高油酸红花油、芥花油、鱼油、椰子油、牛乳脂肪以及它们的组合。
[0105]
如果组合物以25至30g/100g组合物干重的量包含脂肪，则可能是特别有益的。
[0106]
必需脂肪酸的非限制性示例包括：亚油酸(la)、α
‑
亚麻酸(ala)。本发明的组合物还可包含神经节苷脂。神经节苷脂的非限制性示例包括：单唾液酸神经节苷脂
‑
3(gm3)和双唾液酸神经节苷脂3(gd3)、以及它们的组合。
[0107]
益生元的非限制性示例包括：任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖的低聚糖；膳食纤维，特别是可溶纤维、大豆纤维；菊粉；以及它们的组合。优选的益生元为低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、低聚异麦芽糖(imo)、低聚木糖(xos)、低聚阿拉伯木聚糖(axos)、低聚甘露糖(mos)、大豆低聚糖、葡糖基蔗糖(gs)、乳蔗糖(ls)、乳酮糖(la)、低聚帕拉金糖(pao)、低聚麦芽糖、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物以及前述的组合。
[0108]
低聚糖的进一步示例描述于wrodnigg,t.m.；stutz,a.e.(1999)angew.chem.int.ed.38:827
‑
828和wo 2012/069416(以引用方式并入本文)中。
[0109]
益生菌的非限制性示例包括：双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、肠球菌属(enterococcus)、链球菌属(streptococcus)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、酵母属(saccharoymces)、假丝酵母属(candida)，特别是选自长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、乳酸双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)、乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、布拉酵母(saccharomyces boulardii)或它们的混合物，优选地选自长双歧杆菌ncc3001(atcc baa
‑
999)、长双歧杆菌ncc2705(cncm i
‑
2618)、长双歧杆菌ncc490(cncm i
‑
2170)、乳酸双歧杆菌ncc2818(cncm i
‑
3446)、短双歧杆菌菌株a、副干酪乳杆菌ncc2461(cncm i
‑
2116)、约氏乳杆菌ncc533(cncm i
‑
1225)、鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)、鼠李糖乳杆菌ncc4007(cgmcc 1.3724)、屎肠球菌sf 68(ncc2768；ncimb10415)，以及它们的组合。
[0110]
核苷酸的非限制性示例包括：胞苷一磷酸(cmp)、尿苷一磷酸(ump)、腺苷一磷酸(amp)、鸟苷一磷酸(gmp)以及它们的组合。
[0111]
除了hmo之外，包含hmo的组合物还可包含至少一种非消化性低聚糖(例如，益生
元)。此类益生元的示例包括某些低聚糖，诸如低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、岩藻糖基化低聚糖(诸如2
’‑
岩藻糖基乳糖、3’岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
岩藻戊糖i、乳糖
‑
n
‑
岩藻戊糖ii、乳糖
‑
n
‑
岩藻戊糖iii、乳糖
‑
n
‑
岩藻戊糖v、乳糖
‑
n
‑
岩藻己糖、乳糖
‑
n
‑
二岩藻己糖i、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
己糖、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新己糖i、岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新己糖ii、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
己糖i、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新己糖i、二岩藻糖基乳糖
‑
n
‑
新己糖ii、岩藻糖基
‑
对
‑
乳糖
‑
n
‑
己糖以及它们的任意组合)、n
‑
乙酰化低聚糖(诸如乳糖
‑
n
‑
四糖(lnt)、n
‑
新四糖(lnnt)以及它们的任意组合)。其量通常可介于按组合物的重量计的0.3和10％之间。
[0112]
可用于本发明的组合物中的组合物的其它合适的和所需成分可在食品法典委员会(codex alimentarius)颁发的有关所涉及的组合物类型(例如婴儿配方食品、hm强化剂、较大婴儿配方食品或旨在用来供婴儿食用的食料(例如婴儿谷物))的指南中有所描述。
[0113]
可以以任何合适的方式制备包含hmo的组合物(例如，婴儿配方食品)。例如，婴儿配方食品可通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以合适的比例共混在一起而制备。如果使用乳化剂，则可将其包含在共混物中。此时可添加hmo，此时也可添加任何维生素和任何矿物质，但为了避免热降解，通常在稍晚一点的时候添加。在共混之前，可先将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶解于脂肪源中。然后可混入水(优选经受反渗透的水)，以形成液体混合物。随后可对液体混合物进行热处理，以降低细菌载量。例如，可将液体混合物迅速加热到约80℃至约110℃的范围内的温度，保持约5秒至约5分钟。这可通过蒸汽喷射或热交换器(例如板式热交换器)来进行。然后，可例如通过急速冷却来使液体混合物冷却到约60℃至约85℃。接着可将液体混合物均质化；例如分两个阶段进行：第一阶段在约7mpa至约40mpa下进行，第二阶段在约2mpa至约14mpa下进行。然后可进一步冷却均质化混合物，以添加任何热敏感组分；诸如维生素和矿物质。此刻便利地将均质化混合物的ph和固体含量标准化。将均质化混合物转移至合适的干燥装置(诸如喷雾干燥器或冷冻干燥器)，并将其转化成粉末。该粉末的水分含量应小于约5重量％。如果需要添加一种或多种益生菌，可根据任何合适的方法培养所述益生菌，然后例如通过冷冻干燥或喷雾干燥方式制成，以供添加到婴儿配方食品中。另选地，可从专业供应商诸如丹麦汉森集团公司(christian hansen)和日本森永乳业株式会社(morinaga)购买已被制成合适的形式的细菌制品，以供添加到食物产品(诸如婴儿配方食品)中。此类细菌制品可通过干混方式添加到粉状的婴儿配方食品中。
[0114]
包含hmo的组合物可以以任何有效量包含hmo。在本领域的技术人员的能力范围内能够基于组合物的性质、目的、目标个体和剂量(例如每天组合物将被个体摄取多少次)来识别有效量。通常，有效剂量将取决于个体的年龄、个头、健康状态，取决于个体的生活方式及组合物的剂量。
[0115]
有效量可以是增强个体的执行功能的任何量。
[0116]
执行功能的增强可通过如上文详述的熟知测试来测量。
[0117]
仅在6个月、1年以上，例如5年以上，10年以上，20年以上之后，才能觉察到执行功能的增强。
[0118]
基于本文的信息和本领域的知识确定有效剂量完全在本领域技术人员的能力范围内。
[0119]
对于婴儿配方食品或成长乳，技术人员可将hmo(例如2’fl、difl、lnt、lnnt、3sl
和/或6sl)的量基于特别是由营养丰富的母亲对于相同年龄的婴儿或儿童产生的人母乳中发现的量。在人母乳中，此类量可落入以下范围内：difl：100mg/l
‑
500mg/l，lnt：50mg/l
‑
300mg/l，lnnt：200mg/l
‑
2000mg/l，2’fl：500mg/l
‑
3000mg/l，3’sl：100mg/l
‑
400mg/l，6’sl：50mg/l
‑
750mg/l。然而，与人类母乳相比，它们可能会超出，这取决于例如来自婴儿配方食品的所述hmo的生物利用率。
[0120]
作为指导，对于婴儿配方食品或成长乳，岩藻糖基化低聚糖(例如，2’fl和/或difl)可以以0.75g/l
‑
1.65g/l组合物的总量，例如，0.8g/l
‑
1.5g/l组合物(例如0.85g/l
‑
1.3g/l、0.9g/l
‑
1.25g/l、0.9g/l
‑
1.1g/l、1g/l
‑
1.25g/l、1.05g/l
‑
1.25g/l组合物)的总量存在于根据本发明的营养组合物中(浓度可以指组合物例如用水重构后的浓度)。
[0121]
作为指导，对于婴儿配方食品或成长乳，n
‑
乙酰化低聚糖(例如，lnt和/或lnnt)可以以0.45g/l
‑
0.9g/l组合物的总量，例如0.5g/l组合物、例如0.63g/l组合物的总量存在于根据本发明的营养组合物中。
[0122]
作为指导，对于婴儿配方食品或成长乳，唾液酸化低聚糖(例如，唾液酸乳糖(3'
‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和/或6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)))可以以50mg/l至5000mg/l、例如50mg/l至2500mg/l、例如60mg/l至2000mg/l、80mg/l至1000mg/l营养组合物的浓度存在于根据本发明的营养组合物中。在一个具体实施方案中，该组合物包含每l组合物2090mg总唾液酸乳糖。在另一个具体实施方案中，该组合物包含每l营养组合物87.5mg至735mg总唾液酸乳糖。
[0123]
如果包含hmo的组合物包含3'
‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)，则以下情况可能特别有利：所述3'
‑
唾液酸乳糖(3
’‑
sl)和6'
‑
唾液酸乳糖(6
’‑
sl)以介于10:1和1:10之间(诸如介于10:1和2:1之间、介于8:1和3:1之间、介于6:1和3:1之间、介于5:1和3:1之间、介于5:1和4:1之间、或介于4.7:1和4.1:1之间)的重量比包含在所述营养组合物中。
[0124]
如对于技术人员将显而易见的，如本文所公开的用于增强执行功能的hmo或包含hmo的组合物，也可用于预防和/或治疗个体的次优执行功能。
[0125]
因此，在本发明的另一方面，提供了如本文所公开的hmo或包含hmo的组合物，其用于预防和/或治疗次优执行功能。
[0126]
在一个实施方案中，个体可以是患有次优执行功能并因此需要增强执行功能的个体。
[0127]
患有次优执行功能的人可以是不具有在被视为正常(非病理)的范围内(例如针对个体的类型和年龄)的测试评分(在用于评估执行功能的标准测试中)的个体。在本领域的技术人员能力范围内能够确定个体是否患有次优执行功能。
[0128]
次优执行功能可与多种认知病症相关，包括注意力缺陷多动障碍(adhd)、阿尔茨海默病和血管性痴呆。还据信，其在早产或小于胎龄(sga)的个体中更为普遍，并且已知的是，执行功能可随着年龄的增长而下降。因此，可能特别需要治疗和/或预防这些患者组中的次优执行功能。
[0129]
因此，在更特定的实施方案中，需要增强执行功能的个体是患有adhd、阿尔茨海默病或血管性痴呆的个体，或者是衰老成人、早产婴儿或小于胎龄(sga)婴儿。
[0130]
在本发明的另一方面，提供了如本文所公开的hmo和/或包含hmo的组合物的用途，其用于制备用于预防和/或治疗次优执行功能的组合物。
[0131]
在本发明的另一方面，提供了预防和/或治疗个体的次优执行功能的方法，所述方法包括向所述个体施用如本文所公开的hmo和/或包含hmo的组合物的步骤。所述方法还可任选地包括识别患有次优执行功能的个体的步骤。
[0132]
在本发明的另一方面，提供了增强个体的执行功能的方法，所述方法包括向所述个体施用如本文所公开的hmo或包含hmo的组合物的步骤，所述方法可任选地包括鉴定患有次优执行功能的个体的步骤。
[0133]
应当理解，可自由组合本文所公开的本发明的所有特征，而且在不脱离权利要求书所限定的本发明范围的前提下，可对这些特征作出变型和修改。此外，如果特定的特征存在已知的等同物，则应将这些等同物并入本说明书中，如同在本说明书中明确提到这些等同物。
[0134]
如在本公开和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述(该)”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，对“成分”或“该成分”的提及包括两种或更多种成分。在“x和/或y”的上下文中使用的术语“和/或”应被解释为“x”或“y”或“x和y”。当在本文中使用时，特别是后跟一列术语时，术语“示例”仅是示例性和例示性的，并且不应被视为排他性或全面性的。
[0135]
如本文所用，“约”应理解为是指某一数值范围内的数字，例如该所提及数字的
‑
10％至 10％的范围，优选在该所提及数字的
‑
5％至 5％的范围内，更优选在该所提及数字的
‑
1％至 1％的范围内，最优选在该所提及数字的
‑
0.1％至 0.1％的范围内。“介于”两个值之间的范围包括这两个值。此外，本文中的所有数值范围都应理解为包含该范围内的所有整数或分数。另外，这些数值范围应理解为对涉及该范围内任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，1至10的公开应理解为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。
[0136]
本文中表示的所有百分数均以占组合物的总重量的重量计，除非另有表示。提及ph时，其值对应于利用标准设备在25℃处测量的ph。
[0137]
相对术语“增强”和“降低”是指与未施用hmo或包含hmo的组合物的个体相比，如本文所公开的hmo或包含hmo的组合物对个体的执行功能的影响(例如，对已知用于构成执行功能的不同认知技能，例如注意力或冲动、工作记忆、认知灵活性的影响，这可能需要整体地考虑)。在本领域技术人员能力范围内能够评估改善、增加或增强。仅在1年以上，例如5年以上，10年以上，20年以上之后，才能觉察到执行功能(已知用于构成执行功能的不同认知技能，例如认知灵活性、工作记忆、注意力和/或冲动降低)的增强。
[0138]
本文所公开的组合物可不含本文未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的组分组成”的实施方案和“由所指明的组分组成”的实施方案的公开内容。类似地，本文所公开的方法可不含本文未具体公开的任何步骤。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的步骤组成”的实施方案和“由所指明的步骤组成”的实施方案的公开内容。此外，一些步骤被描述为“任选的”并不意味着其它未明确描述为任选的步骤是必需的步骤。在文本简单地指组合物的情况下，这可以是营养组合物。
[0139]
下面是用于举例说明本发明的一系列非限制性示例。
[0140]
实施例
[0141]
实施例1
[0142]
方法
‑
行为研究
[0143]
离乳后，对53只雌性小猪(gottingen小型猪、ellegaard、danemark)进行孔板测试。在1周龄时，将配方食品喂养(n＝45)的小猪与母猪分开，并将其以2只小猪的混合组圈养在猪圈(2.5m
×
1m)中，该猪圈富含切碎的稻草作为垫层并且配备有挤压球和狗床。此外，将8只小猪交叉哺育并与3只母猪保持在一起直至10周龄(天然哺乳小猪)。从母乳离乳后，在10周龄时，将天然哺乳小猪圈养在与配方食品喂养的小猪相同的条件下。还将两条金属链添加到猪圈作为附加富集材料。
[0144]
治疗乳干预为1周龄至10周龄。在1周龄时，将配方食品喂养的小猪随机分配到4种乳配方食品中的1种，其富含不同的益生元混合物(乳a：3’sl和6
‘
sl，乳b：2’fl difl lnt lnnt，乳c：2’fl difl lnt lnnt 3’sl 6
‘
sl)或不含益生元(对照乳)。在整个营养干预周期期间，给天然哺乳小猪喂以母乳。在离乳后，在10周龄时给小猪喂以高能肥胖饮食。该实验设置产生5个治疗组：乳a(n＝12)、乳b(n＝12)、乳c(n＝10)、对照乳(n＝11)和天然哺乳(n＝8)。
[0145]
在空间孔板任务中单独测试每个猪圈的两只猪，以评价它们的空间认知(记忆和学习)表现。孔板场地(3m
×
3m)具有黑色、木质、80cm高的墙和4个带闸门的入口。在该场地中，将16个灰色金属桶(12cm
‑
h12cm)以4
×
4的矩阵拧到地板上，其中4个用小苹果块(约12mm
×
12mm
×
20mm)上饵。场地内的小猪能够看到具有通风管和灯管的房间的墙壁和天花板。在整个孔板测试周期期间，剥夺小猪的饲料过夜。
[0146]
从大约16.5至19周龄，在12个连续工作日，每天对小猪单独进行2次批量试验(即，相隔几分钟进行)，即24次采集试验。每天使用不同的入口，其中每天测试2个不同的入口(即，每次试验1个入口)。当小猪的4条腿在孔板场地中时开始试验，并且当小猪发现全部4次奖励时或在180秒后结束试验。每当小猪首次访问带诱饵的桶时，产生咔嗒声以促进学习。如果小猪完成了任务(即，在少于180秒内发现4个奖励)，则打开出口(南)闸门，小猪接受一半的白色葡萄。如果小猪在180秒内没有完成任务，则产生警笛声音；小猪未收到奖励。在每个猪圈测试了2只小猪两次后，将所有猪圈同伴引导回其家庭圈中，并分配其早晨乳配给量。
[0147]
在采集阶段完成后，对小猪单独进行16次反向试验，在8个连续工作日每天进行2次批量试验。该程序与采集阶段中的程序相同，但小猪被分配到不同配置的带诱饵的桶。
[0148]
使用观察者xt 10(noldus information technology,wageningen,the netherlands)对以下参数进行实时评分：对所有桶的所有访问和再访问，对所有桶访问的等待时间，试验持续时间，试验期间的排便、排尿和逃生尝试总数。通过在测试期间记录的参数，根据van der staay等人，(2012.neurosci and biobehav rev，第36卷，第379
‑
403页)凭经验计算变量(表1)。
[0149]
表1在孔板任务中凭经验计算的参数
[0150][0151]
在采集阶段期间，所有猪均表现出通过随时间推移线性增加的wm、rm和一般wm评分可见的性能增加，并且wm、rm和一般wm误差的数量随时间推移线性减小。乳治疗对离乳后小猪的认知表现没有影响。
[0152]
在反向阶段期间，所有猪均表现出通过随时间推移线性增加的wm、rm和一般wm评分可见的性能增加，并且wm、rm和一般wm误差的数量随时间推移线性减少。与天然哺乳小猪相比，对照乳替代物组中rm、wm和一般wm性能的这种增加减少(对于一般wm和rm而言显著)，并且令人惊讶的是，通过在乳替代物中存在hmo，这种缺乏恢复到与天然哺乳组中所观察到的相似的水平(参见图1至图3)。
[0153]
实施例2
[0154]
下表2给出了根据本发明的营养组合物(例如，婴儿配方食品)的组成的示例。该组合物仅以例证的方式给出。
[0155]
[0156][0157]
表2：根据本发明的营养组合物(例如，婴儿配方食品)的组成的示例
[0158]
实施例3
[0159]
动物及饲养条件
[0160]
成年野生型(wt)b6.129和杂合(hz)b6.129
‑
st6gal1
tm2jxm
育种对(分别为四个雄性和四个雌性，以及三个雄性和四个雌性)购自商业饲养方(the jackson laboratory)。抵达后，同性小鼠被容纳在1型聚碳酸酯笼子(33.0
×
13.0
×
14.0cm)中的2
‑
3相同性别组中，配备锯末垫、富集袋(mucedola,settimo milanese,italy)、金属顶部和任意水和食物粒料(mucedola,settimo milanese,italy)。在空调室(温度21
±
1℃和相对湿度60
±
10％)将小鼠保持在颠倒的12小时明暗循环中(在晚上7:00亮灯)。在抵达两周后，形成饲养三鼠组(一个雄性、两个雌性)。在交配两周后，移除雄性小鼠，并且将雌性个体单独容纳在标准1型笼中。每日检查雌性的分娩时间，它们分娩的那一天被指定为产后天数(pnd)0。除了每周一次的笼清洁之外，母鼠和它们的后代保持不受干扰，直到断奶(在pnd 25)。在断奶时，将雄性和雌性小鼠分离并且置于相同性别的相同喂养笼中；另外，通过耳夹标记雄性小鼠，并且通过该程序去除的耳组织用于基因型分型。然后将纯合的敲除(ko)和wt小鼠用于实验。
[0161]
哺育程序和饲养
[0162]
将十四只野生型(wt)和14只st6gal1纯合(下文简称为ko)雌性小鼠分别与七只wt和七只ko雄性小鼠进行了交配。在该批中，10只wt和10只ko母鼠分娩下活的后代。出生日被指定为产后天数(pnd)0。在10:00和13:00之间进行的哺育程序(详情见图1)要求同时使用四只母鼠(两只wt和两只ko)。因此，为了将由于缺乏哺育母鼠而被废弃的个体的数量降至最低，在出生后24至60小时之间进行哺育程序。在哺育日，我们首先将母鼠从其笼子中取出，并且然后通过脚趾刺青针刺对后代确定性别并进行标记。在完成了性别确定和标记程序之后，将小鼠转移到容纳哺育母鼠的笼子，并铺上锯末。将每个后代转移至哺育母鼠，以使所有实验个体处于相同条件。每只母鼠都培育了由wt和ko雄性和雌性后代组成的混合幼崽(所有变量之间的比例尽量为1:1)。在睁眼时和成年时，收集前额皮质和海马体脑样本用于基因表达分析。
[0163]
构成以下实验组：
[0164]
‑
wt后代由wt母鼠进行饲养(wt对wt)
[0165]
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wt后代由ko母鼠进行饲养(wt对ko)
[0166]
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ko后代由wt母鼠进行饲养(ko对wt)
[0167]
‑
ko后代由ko母鼠进行饲养(ko对ko)
[0168]
总rna提取和qc
[0169]
使用agencourt rnadvance组织试剂盒(beckman coulter)提取总rna：在450μl中进行裂解。提取400μl的裂解液。洗脱体积50μl使用quant it ribogreen测定剂(life technologies)进行定量使用片段分析仪96(agilent)上的标准灵敏度rna试剂盒进行qc评估。
[0170]
样本库制备
[0171]
使用来自lexogen的illumina的quantseq 3'mrna
‑
seq库制备试剂盒(fwd)ht来生成库。其被设计成生成接近于聚腺苷酸化rna的3’末端的illumina相容序列。
[0172]
试剂盒使用总rna作为输入，因此不需要先前的聚(a)富集或rrna耗尽。库生成开始于包含illumina特异性read 2接头序列的oligodt引发。在第一链合成后，去除rna。第二链合成通过随机引发和dna聚合酶而开始。随机引物含有illumina特异性read 1接头序列。在第一链合成和第二链合成之间不需要纯化。第二链合成之后是基于磁珠的纯化步骤。在库扩增步骤期间引入簇生成所需的序列以用于测序。通过pcr扩增双链cdna。在该步骤期间，引入各个条形码索引以便多路复用样本。ngs读段针对聚(a)尾部生成并直接对应于mrna。有关详细信息，参见图1。用quant it picogreen(life technologies)对库进行定量。用片段分析仪(agilent)上的高灵敏度ngs片段分析试剂盒控制大小模式。库以等摩尔比(即，等量的每个样本库)合并，并且以9pm的浓度在单读段(sr)测序流动池(illumina)上成簇。使用hiseq sr簇试剂盒v4 cbot、hiseq sbs试剂盒v4 50循环试剂盒(通过合成测序)在hiseq 2500(illumina)上进行65个循环的测序。在测序运行期间执行原始数据质量控制以确保最佳流动池负载(簇密度)并检查测序运行的质量度量(qc30)。通过图像分析检测到的簇密度的最佳数值介于850k/mm2和1000k/mm2之间。以最佳簇密度执行运行涉及在保持良好质量的数据但导致较低数据输出的成簇不足与可导致较差运行性能的过度成簇之间找到平衡。百分比≥q30是指具有30或更高质量phred评分的碱基的百分比。它是鉴定生成
的核酸碱基的质量的量度。phred评分与错误概率对数相关。等于30的phred评分意指1000中1的不正确碱基分配的概率，因此碱基判定准确率为99.9％。关于illumina规范，评分应为最小80％。
[0173]
数据分析
[0174]
具有非常低计数的基因不太可能在组之间差异表达。我们通过在至少8个样本中仅选择具有至少5个读数的基因来过滤低表达基因。样本数量的阈值确保基因将在最小的组(其包含8个样本)中表达。对考虑库大小的cpm值进行过滤步骤。在我们的情况下，其对应于cpm值上2.427的阈值。我们还丢弃了没有注释的基因。我们保留了具有这些过滤标准的11523个特征。我们使用tmm方法进行归一化。
[0175]
结果
[0176]
与髓鞘形成相关的多个基因的表达在接受不含6’sl的乳的小鼠中在生命早期期间仅在前额皮质中降低，这在成年期和在任意两个年龄的海马体中都未观察到。图4示出在接受不含6’sl的乳的小鼠中，髓鞘碱性蛋白(mbp)和髓鞘相关糖蛋白(mag)(髓鞘的两种关键蛋白)的表达降低50％(相对于对照小鼠以倍数变化量化的基因表达)。当我们研究在生命早期不存在6’sl对kyoto encyclopedia of genes and genomes途径影响时，我们鉴定出在接受不含6’sl的乳的小鼠中髓鞘形成和髓鞘途径均下调。这同样仅在生命早期期间在前额皮质中可见，在成人前额皮质和海马体中都不可见(在成年或生命早期年龄)。这些结果清楚地表明，母乳中存在6’sl对于在生命早期观察前额皮质的最佳髓鞘形成是必要的。有趣的是，前额皮质已知为介导执行功能的关键脑区域。