含有氘代肌氨酸的磁共振成像药物及使用所述药物的诊断方法与流程

1.本发明涉及医学，即用于磁共振成像的方法。
现有技术
2.疾病的非侵入性诊断，包括早期诊断，是医疗保健的一个重点优先领域。用于诊断疾病的信息方法之一是磁共振成像(mri)。
3.临床实践中使用的大多数类型的mri都是基于记录人体水中所含质子(1h核)的磁共振信号。1hmri提供了高度的解剖细节。同时，从临床实践中了解到，mri并不总是提供关于疾病性质的明确数据。特别是，在肿瘤学中，对于正确区分恶性肿瘤与非危及生命的良性形成、炎症病灶等，仍然具有挑战性[参见，例如::baltzer,p.a.t.等人am.j.roentenology,2010,194,1658
‑
1663；shahid,h.等人.appl.radiol.2016,45,7
‑
13.]。在这方面，肿瘤疾病的早期诊断也很困难，因为假阳性结果的风险很高。
[0004]1hmri提供更多信息的主要方法是使用造影剂来改变其环境中水质子的弛豫时间[当前化学的主题，造影剂、磁共振成像(topicsincurrentchemistry,co ntrastagentsi,magneticresonanceimaging.krause),w.(ed.),springer,2002]。已知多种造影剂可以用于mri诊断，包括市售的钆配合物于mri诊断，包括市售的钆配合物和以及稳定的磁性纳米粒子的水悬浮液和re除了增强图像的对比度外，这些物质还可以评估灌注。
[0005]
一种替代使用造影剂的1hmri的方法是记录来自其它原子核的信号，特别是，处于临床试验的不同阶段，使用同位素
31
p、
13
c、
19
f、
23
na等方法。
[0006]
氘(2h)是氢的天然非放射性同位素，在生物体中的含量为氢总量的0.0156％。
[0007]
文件us5042488表明，在体内(大鼠肝脏中)注射d2o和1次氘代葡萄糖后记录氘信号的可能性。
[0008]
文件us20030211036a1提出了一种通过与顺磁造影剂类比，使用同位素标记的化合物(例如d2o)测量选定的组织切片中的灌注的方法。
[0009]
文件us20100322865a1描述了使用代谢水前体来估计代谢率。1,2,3,4,5,6,6氘代葡萄糖作为hod代谢前体的一个样品。在所述发明的框架内，仅记录了代谢水氘和脂肪酸脂肪链的nmr信号，没有氘代葡萄糖的nmr信号。
[0010]
尽管1hmri技术在临床上得到广泛应用，但仍然需要开发新的、更有效的mri诊断方法。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的是开发一种通过mri和/或mr波谱诊断疾病的新的有效诊断药物和涉及使用特定药物的诊断方法。
[0012]
本发明的技术成果是发明一种新的有效诊断药物，通过磁共振成像和/或氘磁共
振波谱，用于伴随细胞营养吸收水平的局部改变(增加或减少)的疾病和病理过程的非侵入性诊断，特别是肿瘤疾病。
[0013]
这一技术成果是通过开发与核磁共振方法(mri或mr波谱)基本物理限制相容的诊断药物来实现的。众所周知，氘核的旋磁比比氕小6.5倍。因此，氘信号的检测灵敏度约为氕信号检测灵敏度的0.01(即1％)[生物核磁共振(biological magnetic resonance),卷11,invivospectroscopy.berlinerl.j.,reuben,j.(eds.),springer,1992]。可以通过对几次相同扫描的信号进行平均来记录弱信号。然而，这样的平均需要增加扫描时间，并且信噪比非线性地增加(按比例，其中n是扫描次数；例如，如果扫描需要10分钟，并且信号噪声比应增加10倍，扫描时间将需要增加100倍，即最多16小时)。那时，活生物体中的扫描持续时间受到诊断药物的药代动力学和临床实践中的实际适用性(检查不应超过1
‑
2小时)以及患者在整个扫描过程中需要保持不动的限制。磁共振信号的强度还取决于磁场的强度。由于磁场强度不超过7t的mr断层扫描仪目前已获准用于临床，因此只有在7t提供足够信号强度的诊断药物才有实际应用价值。
[0014]
因此，本发明的诊断药物中的氘代化合物应具有这样一组物理化学和生物学特性，以确保氘的选择性累积和其在靶组织中的浓度维持足够用于信号记录的时间。在组织中达到的氘代化合物浓度越低，平均信号所需的时间就越长，因此，氘代化合物在组织中的时间越长，从而保持选择性分布。另一方面，增加诊断药物的剂量并不是一个普遍的解决办法，因为它的排泄可以加速(特别是通过超过肾脏的重吸收能力)，毒性风险增加，在各种组织中累积的选择性降低，而且剂量受溶解度的限制。
[0015]
对于包括氨基酸在内的大多数化合物，没有关于病理情况下组织中可达到的最大无毒浓度的数据。因此，满足上述标准的诊断药物的开发需要其在2hmri和/或活体mr光谱中的适用性。
[0016]
本发明的技术成果也是开发了一种新的有效且信息丰富的方法，通过磁共振成像和/或氘磁共振光谱，用于诊断伴随细胞营养吸收水平局部改变(增加或减少)的疾病和病理过程，尤其是肿瘤疾病，包括引入本发明的诊断药物，其能够在靶组织和器官中累积(尤其是在肿瘤组织中)，浓度足以记录活体内信息丰富的氘断层成像或2h
‑
nmr谱。本发明实施中的附加技术结果是能够获得关于扫描区域不同点的灌注水平的信息、关于肿瘤的结构、其边界、关于肿瘤的恶性或良性的信息。另一个附加技术结果是评估扫描区域内代谢过程的局部速率的可能性，这反过来使评估代谢活动和/或细胞增殖水平成为可能，肿瘤生长速率是一个额外的参数，可提高诊断的可靠性和有效性。
[0017]
本发明的方法的另一个特点是，其在没有电离辐射有害影响的情况下进行(典型的，例如，ct、pet、spect成像)，这反过来增加了检查的安全性，使得能够进行更频繁的重复检查，尤其是，使该方法对儿科具有吸引力。本发明旨在获得类似于正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描方法的诊断信息(病理组织中药物累积的水平或速率偏离正常值或在相同组织/相同器官的周围部分中获得的值)，同时也消除了与放射性药物电离辐射相关的风险。此外，与pet放射性药物不同，本发明氘代药物的生产不限于小批量短寿命同位素的合成和物流(logistics)。
[0018]
通过开发含有肌氨酸的氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐或其混合物的诊断药物，通过磁共振成像和/或氘磁共振波谱诊断疾病，取得了特定的技术成果。
[0019]
因此，本发明的第一方面是诊断药物，其包含至少一种选自肌氨酸的氘代衍生物和/或肌氨酸氘代衍生物的药学上可接受的盐，用于通过磁共振成像和/或氘核磁共振波谱来诊断疾病或病理过程。
[0020]
在本发明的一些实施方案中，诊断药物还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些特定情况下，药学上可接受的赋形剂是载体、填充剂和/或稀释剂。
[0021]
在本发明的一些实施方案中，诊断药物还包含肌氨酸代谢抑制剂和/或肌氨酸膜转运抑制剂。在某些特定情况下，肌氨酸膜转运抑制剂是甘氨酸或脯氨酸。肌氨酸代谢抑制剂是肌氨酸去甲基化的药学上可接受的抑制剂，特别是乙酸或其盐。
[0022]
在本发明的一些实施方案中，氘代肌氨酸衍生物和/或其药学上可接受的盐，除了与碳原子键合的氘原子，包含部分或完全取代与氧和/或氮原子键合的可移动氢原子的氘原子。
[0023]
在本发明的一些实施例中，诊断药物包括：
[0024]
‑
在第2位和第4位都含有氘原子的肌氨酸的氘代衍生物，或其药学上可接受的盐；或
[0025]
‑
肌氨酸和/或其药学上可接受的盐的氘代衍生物的混合物，其中存在至少一种在第2位含有氘原子的氘代衍生物和至少一种在第4位含有氘原子的氘代衍生物。
[0026]
在本发明的一些具体实施方案中，氘代肌氨酸衍生物是肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3、肌氨酸
‑
2,2
‑
d2或肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5。
[0027]
在本发明的一些其他实施方案中，诊断药物包含至少两种不同选自下组的化合物的混合物：氘代肌氨酸衍生物和/或氘代肌氨酸衍生物的药学上可接受的盐。在本发明的一些具体实施方案中，诊断药物包含选自以下的至少两种化合物的混合物：肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3、肌氨酸
‑
2,2
‑
d2或肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5。
[0028]
本发明的另一方面是一种用于诊断受试者的疾病或病理过程的方法，包括以下步骤：
[0029]
‑
向受试者给予本发明的诊断药物；
[0030]
‑
在给予诊断药物后，在足以使其在靶组织中累积的时间后进行磁共振成像和/或氘磁共振波谱，分别获得断层扫描(氘断层扫描)和/或核磁共振波谱(光谱)。
[0031]
‑
根据观察到的氘核信号强度，反映诊断药物的累积水平，诊断是否存在疾病。
[0032]
在本发明的优选实施方案中，所诊断的疾病或病理过程伴随着细胞营养吸收水平的局部改变(增加或减少)。
[0033]
在本发明的一些实施方案中，病理过程是炎症过程、感染过程、伴随主动再生的过程、与器官和组织缺血相关的疾病、移植排斥反应、自身免疫性疾病。在本发明的一些其他实施方案中，该疾病是肿瘤疾病。在本发明的一些具体实施方案中，肿瘤疾病是实体瘤或肿瘤转移，包括淋巴结转移。
[0034]
在本发明的一些实施方案中，通过比较正在接受检查的受试者中氘核的信号强度与在健康受试者中观察到目标组织或器官中的的典型信号强度来诊断是否存在疾病。在本发明的一些其他实施例中，根据额外的医学检查结果，基于对应于正常组织和异常组织的区域中的氘核的信号强度的比较来诊断疾病的存在或不存在。在本发明的一些实施例中，基于以上比较的组合来诊断疾病的存在或不存在。
[0035]
在本发明的一些实施方案中，进行至少一种额外的医学检查，选自对除氘核之外的核的磁共振成像、超声检查、计算机断层扫描、射线照相、触诊、活组织检查、针对肿瘤标志物的生物流体分析、放射性核素诊断和/或目视观察。在本发明的一些实施例中，如上所述，的额外的医学检查在使用磁共振成像和/或氘磁共振波谱诊断疾病或病理过程之前进行。在本发明的一些其他具体实施例中，如上所述的额外的医学检查在使用磁共振成像和/或氘磁共振波谱诊断疾病或病理过程之后进行。
[0036]
在本发明的一些特定实施例中，基于接受检查的受试者的氘断层图像与受试者的氕磁共振成像结果获得的图像的比较来诊断疾病或病理过程是否存在。
[0037]
在本发明的一些实施例中，在氘断层图像上诊断药物累积增加的区域的空间分布被用于得出关于肿瘤的空间结构的结论。
[0038]
在本发明的具体实施方案中，使用诊断药物的累积增加的区域中的氘断层照片和/或nmr光谱(波谱)上的氘信号强度来得出关于肿瘤的恶性或良性的结论。
[0039]
在本发明的一些具体实施方案中，在给药后使用氘断层图像上的氘信号强度的变化速率和/或其施用后的nmr光谱(波谱)来得出关于扫描区域不同点处的灌注水平的结论。
[0040]
用于诊断与本发明相关的受试者的疾病或病理过程的方法的具体实施方案还包括本发明关于上述诊断药物的所有实施方案。
[0041]
在用于诊断受试者的疾病或病理过程的方法的一些实施方案中，待施用的诊断药物包括
[0042]
‑
在第2位和第4位都含有氘原子的肌氨酸的氘代衍生物，或其药学上可接受的盐；或
[0043]
‑
肌氨酸和/或其药学上可接受的盐的氘代衍生物的混合物，其中具有至少一种在第2位含有氘原子的氘代衍生物，和至少一种在第4位含有氘原子的氘代衍生物；
[0044]
同时，基于对氘代化合物的第2位和第4位氘核信号强度的比较，使用靶组织中的氘断层图和/或核磁共振谱(光谱)评估局部肌氨酸的代谢速率，这使得可以进行更准确的诊断，特别是评估肿瘤的生长速度或恶性程度方面。
[0045]
在本发明上述实施例的一些具体实施例中，氘代肌氨酸衍生物为肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3,肌氨酸
‑
2,2
‑
d2or肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5。在本发明上述实施例的一些具体实施例中，诊断药物包含至少两种不同化合物的混合物，所述化合物选自肌氨酸氘代衍生物和/或肌氨酸氘代衍生物的药学上可接受的盐。在本发明的一些具体实施方案中，诊断药物包含选自以下的至少两种化合物的混合物：肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3,肌氨酸
‑
2,2
‑
d2或肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5。
[0046]
在本发明的一些实施方案中，诊断药物经口给药于受试者。在本发明的一些其他实施方案中，将诊断药物经肠外途径给药于受试者。
[0047]
附图简述
[0048]
图1.a)肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)b)肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)；c)肌氨酸
‑
2,2
‑
d2和肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3混合物的样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。
[0049]
图2.1号乳腺癌4t1小鼠在施用30mg肌氨酸4,4,4
‑
d3后的氘断层图像：
[0050]
a)给药后不同时间点获得的2h断层图像；b)2h断层图像(左侧)、2h和1h断层图像的
叠加(中间)、1h断层图像(右侧)。
[0051]
图3.4t1乳腺癌小鼠在给药后的断层图像：a)30mg l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3；b)10mg l
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7。
[0052]
定义和术语
[0053]
为了更好地理解本发明，以下是本发明说明书中使用的一些术语。
[0054]
为了描述本发明的目的，术语“包括”和“包含”被解释为意味着“包括，此外”。这些术语不应被解释为“仅由
……
组成”。
[0055]
术语“受试者”包括所有哺乳动物物种，优选人。
[0056]
本文件中的术语“氘代衍生物”是指在至少一个位置含有与碳结合的氘的量超过其天然含量的化合物。在本发明的特定实施例中，至少在一个位置上的氘含量超过10％，在其他特定实施例中为
‑
90％。“至少两种不同的氘代衍生物的混合物”是指在不同位置含有氘的化合物的混合物，或在相同位置含有不同量的氘的化合物的混合物。本文件中的符号“d”(“d”)表示以超过其天然含量的比例由同位素2h表示的氢原子。
[0057]
氘代肌氨酸衍生物包括肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3,肌氨酸
‑
2,2
‑
d2,肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5,，以及其它衍生物，如肌氨酸
‑
2,4,4
‑
d3,肌氨酸
‑
2,2,4
‑
d3,肌氨酸
‑
2,4,4,4
‑
d4,肌氨酸
‑
4,4
‑
d2，但不限于此(本文采用的原子编号如下所示)。
[0058][0059]
本文中的术语“体素”是指扫描区域的最小体积元素，它对应于特定的氘信号强度值或特定的局部光谱。
[0060]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指适合用于与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应等，并且满足合理的风险收益比的那些盐。胺、羧酸、膦酸盐和其他类型化合物的药学上可接受的盐在医学中是众所周知的。盐可以在本发明化合物的分离或纯化过程中原位制备，也可以通过本发明化合物的游离酸或游离碱分别与合适的碱或酸反应而单独制备。药学上可接受的无毒酸盐的实例是氨基与无机酸如盐酸、磷酸或有机酸如乙酸、草酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、抗坏血酸、柠檬酸、丁酸、乳酸、葡萄糖酸形成的盐，或通过本领域中使用的其他方法获得，例如，使用离子交换。典型的碱金属和碱土金属盐包含钠、钾、钙、镁等。此外，如果需要，药学上可接受的盐可以包含使用抗衡离子如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐等获得的无毒铵、季铵和胺阳离子。
[0061]
本发明的诊断药物可以包括一种或多种适用于特定剂型的任何药学上可接受的赋形剂，特别是任何载体、稀释剂和/或填充剂，这样可以与构成本发明的本质的化合物一起给药于患者身体。其不会破坏该化合物，并且在给药时是无毒的。药学上可接受的赋形剂的非限制性具体实例包括氯化钠、葡萄糖、甜味剂、食用香料和着色剂等。
具体实施方案
[0062]
使用2hmri或mr波谱成功诊断疾病的基础是特定氘代化合物在各种组织中选择性
累积的能力。同时，从核磁共振方法的基本物理限制(回旋磁比、氘核的弛豫参数)的角度出发，产生足够强度的信号。在这种情况下，氘信号的强度：
[0063]
a)与组织中达到的氘浓度成正比(取决于剂量、膜转运动力学、组织的浓缩能力)，
[0064]
b)与扫描时间的平方根成正比(时间受限于氘代化合物的消除和/或代谢率，以及患者在整个扫描过程中需要保持不动)，
[0065]
c)取决于弛豫时间t1(确定最大平均速率，从而确定每单位时间接收的总信号强度；对于不同的化合物，其差异为几倍：参阅.生物磁共振(biological magnetic resonance,卷11,in vivo spectroscopy.berlinerl.j.,reuben,j.(eds.),springer,1992)。
[0066]
每种化合物都有独特的药代动力学参数(特别是化合物的浓度及其在血液、各种器官和组织中的变化速率)。在这种情况下，药代动力学以不明显的方式取决于使用的剂量(特别是，特定化合物的肾脏再吸收能力过大可能导致其加速排泄)。此时，剂量受到该化合物毒性和溶解性的限制。作者进行的实验以及对现有技术的参考表明，自由扩散的氘代化合物(如d2o)不会在受试者的各种器官和组织中表现出选择性累积。
[0067]
作者发现，作为本发明诊断药物的一部分的肌氨酸的氘代衍生物：
[0068]
‑
能够在动物组织中选择性累积，其浓度足以用于体内各种器官和组织通过2hmri或mr波谱的可视化，包括癌症肿瘤；
[0069]
‑
具有允许使用无毒剂量的药代动力学特性，同时成功记录2hmri和/或2hnmr光谱；
[0070]
‑
当浓度足以成功记录2hmri和/或2hnmr时，其特征是排泄和代谢相当缓慢，符合氘断层成像和mr光谱法的时间限制。
[0071]
尽管肌氨酸不是生理上重要的营养素，但作者发现它以足以通过mri成像的浓度选择性地累积在受试者的各种器官和组织中。反过来，这允许有效诊断伴随细胞营养吸收水平的局部改变(增加或减少)的疾病和病理过程，包括通过氘磁共振成像确定肿瘤疾病的存在和定位。同时，我们的实验证明了其他氨基酸，特别是甘氨酸
‑
d2、l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3和l
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7不具有合适的理化和生物学特性，因此不能用于通过2hmri或mr光谱诊断疾病。
[0072]
肌氨酸的氘代衍生物的一个显著特征是，当采用在第2位和第4位都含有氘原子的衍生物时，有机会在mri或mr光谱中同时观察到两个氘信号，例如，肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5(图1b)或肌氨酸的混合物，其中各个组分在第2位和/或第4位含有氘原子(除了仅在第2位(或仅在第4位)含有氘原子的组分的选项)，例如肌氨酸
‑
2,2
‑
d2和肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5的混合物或肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3和肌氨酸
‑
2,2
‑
d2的混合物。与基于放射性同位素的方法不同，除了氘代衍生物累积的水平外，这还允许根据药物氘信号强度的差异获得有关肌氨酸代谢的信息。在这种情况下，肌氨酸第2位和第4位氘原子的nmr信号强度比反映了扫描区域目标体素在肌氨酸氧化去甲基化(代谢的第一阶段)速率上的差异。已知肌氨酸在单碳片段的代谢系统中充当甲基供体((s.devogel等人.int.j.cancer,2014,134,1,197
‑
206)。单碳片段(主要与四氢叶酸和s
‑
腺苷甲硫氨酸相关)被人体使用，包括用于合成细胞增殖所需的dna。因此，肌氨酸的局部代谢率增加可能表明局部增殖率增加，特别是肿瘤或其个别部位的生长。使用这种关于肌氨酸代谢的附加诊断信息使得本发明的诊断方法更加可靠。肌氨酸第2位和第4位氘原子的核磁共振信号强度比可以通过一次扫描和多次扫描测量。与完整的氘
代衍生物相比，第2位与第4位的信号比降低表明去甲基化。因此，给定体素中这些信号的比率越低，其中肌氨酸的去甲基化速度就越快。
[0073]
包括在一种诊断药物中的两种不同肌氨酸氘代衍生物的重量比可为1:1至1:10，在优选实施方案中，是从1:1至1:3，但不限于此。
[0074]
从现有技术可知，由于n
‑
甲基氧化反应的动力学同位素效应，氘代肌氨酸的代谢不同于非氘代肌氨酸(r.h.abeles,w.r.frisell,c.g.mackenzie；j.biol.chem.1960,235,3,853
‑
856)。由于氘mri方法的基本局限性，这使得不可能将用超低剂量放射性标记的肌氨酸衍生物获得的结果直接外推到以超过10mg/kg的剂量使用的本发明的氘代肌氨酸衍生物。
[0075]
从现有技术可知，不同的氨基酸在动物和人体细胞中具有不同的累积动力学，并且在平衡状态下达到的浓度梯度也相差数十倍[johnstone,r.m.,scholefield,p.g.,adv.cancerres.1965,9,143
‑
226]。体内氨基酸的行为因全身水平的体内平衡和定向运输而进一步复杂化。特别是，众所周知，肌肉释放的过量丙氨酸会被肝脏主动吸收；在生理浓度下，谷氨酰胺会被多种类型的癌性肿瘤主动吸收。由于氘断层扫描或光谱学涉及的给药剂量比生理剂量高几倍，不同的器官和组织对各种氨基酸具有不同的累积动力学和能力，如果不进行直接实验，就不可能预测特定氨基酸的选择性累积。
[0076]
本发明的诊断药物的氘代组分(肌氨酸)的一个重要特性是在体内氘替换氕的代谢交换具有足够的抵抗力。这种交换降低了氘标记的浓度，同时增加了重水(doh)的背景信号，由于快速扩散，重水(doh)均匀分布在全身。这个过程会导致图像对比度的降低，并且还阻碍了与自然doh信号强度相比对氘代成分浓度的定量评估。我们的研究表明，一些氘代的天然氨基酸，特别是甘氨酸
‑
2,2
‑
d2和l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3，不能用于获得与本发明相关的具有诊断意义的图像，因为它们在体内很快失去氘。
[0077]
由于体内氘含量低(氢原子的0.015％)，2hmri的背景信号比1hmri低几个数量级。因此，即使在低浓度的诊断药物下，其信号也不会叠加在天然背景成分的信号上。由于存在大量天然低分子量化合物的背景信号，其强度可与非氘代诊断药物的最大可实现信号强度相媲美，因此难以开发基于1hmri的使用非氘代诊断药物的类似方法。
[0078]
本发明的方法可以诊断伴随实体瘤(原发性和转移性)的形成和/或淋巴结转移的肿瘤疾病的是否存在。可以用氘代诊断药物诊断的肿瘤疾病包括：乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、脑癌(包括从其他肿瘤的转移)、肾癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肉瘤，但不限于此。除肿瘤疾病外，本发明的方法还可用于诊断具有高代谢活性或细胞增殖特征的其他疾病：例如，在移植器官和细胞排斥的情况下，在自身免疫、炎症或感染性疾病中，在伴有主动再生的肝损伤中。还可以诊断由于各种器官(例如心脏、大脑、肾脏)的血液供应障碍(缺血)而导致的疾病。通过2hmri或mr光谱观察到，血液供应障碍坏会导致这些器官中氨基酸(包括肌氨)的吸收率和累积水平的降低。
[0079]
本发明的方法基于氘代诊断药物的使用和在氘频率下的断层图和/或核磁共振谱的记录。
[0080]
众所周知，在许多情况下，1hmri本身的诊断准确性不足。这同样适用于基于灌注参数测量的mri方法(例如，动态对比增强mri)。与灌注方法相反，本发明的诊断方法提供了关于细胞中膜转运速率和肌氨酸累积水平的数据，典型地，用于pet或spect，并且在实施
1
hmri的传统方法中是不可用的。因此，本发明的方法提供更准确的诊断信息。特别地，在肿瘤疾病的情况下，本发明的方法可以评估靶组织的代谢活性，并因此推断肿瘤是恶性的还是良性的，并评估其侵袭性。本发明的诊断药物的信号可观察至少3小时(见图2)。在长达3小时的重复扫描过程中，癌症肿瘤和各种内脏(肝、脾、胰、肾)信号强度的变化率反映了这些组织和器官的灌注和代谢活动水平，可以通过用于基于氘断层扫描和/或mr光谱进行更准确的诊断。
[0081]
在本实施例的具体情况下，利用诊断药物的氘信号的空间分布来推断肿瘤的空间结构。
[0082]
关于肿瘤的恶性程度/侵袭性的结论。恶性肿瘤的特征在于更活跃的代谢和增加的膜转运活性。因此，在恶性程度较高的肿瘤中，氘的信号强度会更高。
[0083]
在本发明的其他具体实施例中，通过诊断药物的氘信号强度的变化率来评估靶区中的灌注。在灌注程度较高的区域，氘信号随时间的变化率(从肿瘤组织中开始累积到完全消除)较高。
[0084]
以对诊断有效的量使用本发明的诊断药物。在这种情况下，有效量是指当最有可能发生预期效果时给患者服用的化合物(肌氨酸的氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐)的量
‑
可能通过磁共振成像和/或氘磁共振光谱实施本发明诊断方法。由于氘mri方法的基本限制，肌氨酸氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐的量不能超低且以几mg/kg体重的量使用，使用剂量超过10mg/kg，例如0.1
‑
1.5g/kg。特别是，在计算不同物种哺乳动物的药物剂量时，通常使用的不是重量，而是身体的表面积，其非线性依赖于重量。所需的确切剂量可能因受试者而异，具体取决于哺乳动物种类、年龄、体重和患者的一般状况、疾病的严重程度以及给药方法。
[0085]
从现有技术中还知道，同一化合物的半衰期在不同物种之间可能不同(通常，较大物种的半衰期更长)，因此，不同哺乳动物给药和扫描之间的最佳时间可能显著不同。给药和扫描之间的最佳时间取决于疾病的性质和受试者身体的部位。如图2所示，在肿瘤中肌氨酸的累积达到最大值之前，通过氘断层图像可以观察到受试者的内脏器官(肝脏、胰腺、脾脏等)。
[0086]
本发明的诊断药物可以通过对诊断有效的任何给药途径给予患者，例如，它可以口服给药、肠外给药、局部给药等。
[0087]
肌氨酸的膜转运是由与甘氨酸和脯氨酸转运相同的转运蛋白进行的(f.h.glorieux等人.j.clin.investigation,1971,50,2313
‑
2322)。甘氨酸和脯氨酸与其浓度成比例地抑制肌氨酸的转运，其特征在于与肌氨酸不同的生物分布。因此，甘氨酸和/或脯氨酸与本发明的药物或在本发明的药物组合物中同时给药能够改变受试者各种器官和组织中肌氨酸累积的水平。如果受试者的扫描器官和组织在不同程度上累积肌氨酸、甘氨酸和/或脯氨酸，则这种变化可以增强氘成像的对比度。
[0088]
由于肌氨酸的膜转运是由对不同氨基酸具有不同亲和力的几种转运蛋白进行的，因此使用与肌氨酸相同的转运蛋白(特别是甘氨酸和脯氨酸)以及肌氨酸的氘代衍生物，可以抑制单个转运蛋白对肌氨酸的运输，从而选择性地可视化由其他转运蛋白进行的累积。抑制剂的使用，例如甘氨酸和/或脯氨酸，可以在不改变氘代肌氨酸衍生物结构的情况下提高诊断图像的对比度。由于在从2
‑
脱氧
‑2‑
[
18
f]氟葡萄糖过渡到甲基4
‑
脱氧
‑4‑
[
18
f]氟葡
萄糖苷期间选择性使用某些类型的转运蛋白，诊断图像的对比度得到了改善(v.kepe等人.j.neurooncol.,2018,138,5,557
‑
569)，但是，与这项工作相反，本发明的方法允许在不改变活性物质的化学结构的情况下改变运输的选择性。
[0089]
肌氨酸的氧化去甲基化被几种化合物抑制，例如乙酸盐和甲氧基乙酸盐(w.r.frisell,c.g.mackenzie,j.biol.chem.1955,217,1,275
‑
285)。与诊断药物同时或作为诊断药物的一部分向受试者给予醋酸盐或其他药学上可接受的肌氨酸去甲基化抑制剂减缓了氘代肌氨酸衍生物的氧化，从而增加了氘代衍生物的信号强度和/或其足以记录氘核磁共振成像或光谱的浓度的可用性的持续时间。
[0090]
在本发明的一个实施例中，诊断过程包括mri，并按如下方式执行：
[0091]
a)在本发明的一些实施例中，进行氕核(1h)mri。1hmri的记录首先允许对氘信号进行解剖标记，其次，识别疑似病理的区域，特别是恶性肿瘤(在其他实施例中，2hmri的区域可以通过其他方式确定，特别是通过超声波、计算机断层扫描、射线照相术、触诊、活组织检查、生物液体肿瘤标记物分析、放射性核素诊断和/或目视观察)；
[0092]
b)给予诊断药物；
[0093]
c)在足以使诊断药物在受试者的靶组织中累积的时间之后，以诊断药物氘核的进动频率记录断层图；
[0094]
d)对获得的氘断层图进行分析，以发现具有异常高或低强度的区域，从而对应于诊断药物的选择性累积。特别是，可以比较1h和2h的断层图像：如果1h和2h的异常区域重合，可以说病理学的可能性更大。
[0095]
在本发明的另一个实施例中，诊断过程包括进行氘mr波谱并如下进行：
[0096]
a)进行1hmri，然后识别出疑似病理的区域，尤其是恶性肿瘤(在本发明的其他实施例中，2hmri区域的确定可以通过其他方法进行，尤其是通过超声检查、计算机断层扫描、射线照相、触诊、活组织检查、肿瘤标志物生物液体分析、放射性核素诊断和/或目视观察)；
[0097]
b)给予诊断药物；
[0098]
c)在足以使诊断药物在受试者的靶组织中与可疑病理区域对应的体素中累积(例如，根据1hmri的结果)的时间之后，记录氘光谱(特别是，使用局部光谱的方法)；任选地，记录相邻的体素的光谱以比较信号强度；
[0099]
d)比较疑似病理区域对应的体素中的信号强度，特别是，与：(i)给定器官或组织的典型值(应在健康受试者中提前确定)和/或(ii)与相同器官或组织且1hmri无异常的对应的相邻体素中的信号强度进行比较。信号强度的增加或降低表明诊断药物的选择性累积，因此，存在病理，尤其是恶性肿瘤。
[0100]
本发明的上述两个实施例中的步骤“a)、b)、c)”的顺序可以更改为“b)、a)、c)”或“b)、c)、a)”。还可以并行记录信号1h和2h(即，同时进行阶段“a)”和“c)”)。
[0101]
在本发明的特定实施例中，在识别具有可疑恶性形成的区域后，选择位于可疑区域内和外的单个体素(具体而言，可以选择位于穿过可疑区域边界的同一条线上的一系列相邻体素)。记录选定体素的2h或局部2h光谱的积分信号与其强度的后续比较，可以快速且更高灵敏度地检测诊断药物累积的区域。
[0102]
mri图像和mr光谱可在任何配备有记录氘信号设备的mri扫描仪上获得。
[0103]
本发明的作者进行的实验表明，动物对诊断药物具有良好的耐受性，当在任何配
备有记录氘信号的设备的mri扫描仪上以指定剂量使用时，没有明显的副作用。从现有技术已知，当肌氨酸以高剂量(ld50>5g/kg)给药时是安全的。考虑到天然肌氨酸的有效分解代谢，同时以doh的形式释放氘(在极高剂量下无毒，可替换体内高达10
‑
30％的水，且其也以约为1x10
‑2mol/l的浓度存在于体内的水中)，我们认为施用多个氘原子不会产生相应副作用。
[0104]
本发明的方法在没有电离辐射有害影响的情况下进行(典型的，例如，ct、pet、spect)，这反过来增加了检查的安全性，使得能够进行更频繁的重复研究，特别是，使该方法对儿科具有吸引力。
[0105]
基于1hmri和/或其他诊断方法的结果，本发明的诊断方法可用于，尤其是各种定位的恶性肿瘤、转移性病变的早期诊断、肿瘤对治疗反应的评估和关于治疗有效性的结论，以阐明对疾病的诊断。
[0106]
本发明的方法扩展了非侵入性诊断的现有可能性，并允许有效诊断肿瘤疾病。
[0107]
肌氨酸氘代衍生物的药学上可接受的盐具有用于本发明诊断药物所需的所有性质。
[0108]
本发明的实施例
[0109]
实施例中给出的可靠数据证实了使用本发明时技术结果客观体现的可能性，这些数据包含在根据本领域应用的方法进行研究过程中获得的实验数据。附图说明了本发明的本质。
[0110]
应当理解，申请材料中给出的这些和所有实施例都不是限制性的，仅用于说明本发明。
[0111]
本文件中给出的实施例例用于说明所开发方法的操作原理，并且不限制使用的剂量范围，以及服用诊断药物和记录氘信号之间的时间范围，因为，根据所用设备的灵敏度和其他参数、诊断的疾病和受试者(人类或实验动物)的性质，药物累积所需的剂量和时间可能有所不同。具体而言，从现有技术可知，同一化合物的半衰期可在不同动物物种之间变化，并且当从一种动物变化到另一种动物或人类时，剂量往往与体表面积成比例，而不是与体重成比例。氘信号的记录也可以在诊断药物给药结束之前进行。此外，用于记录光谱和断层图的上述参数(包括信号累积时间)是本发明特定实施例的一部分，并且可以根据所使用的设备和特定诊断任务而变化。
[0112]
n
‑
(cd3)
‑
甘氨酸(肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3)的合成。
[0113]
n
‑
甲苯磺酰甘氨酸是根据文献(a.cohen等人.j.标记化合物和放射性药物(labelled compounds and radiopharmaceuticals),1986,24,5,587
‑
597)中描述的方法获得。
[0114]
将3.29g甲苯磺酰甘氨酸(0.014mol)溶解在17.2ml 3m naoh中。将所得溶液置于玻璃高压釜中并在冰浴中冷却。在搅拌下，向甲苯磺酰甘氨酸的的碱的冷中加入3.25g(0.022mol)cd3i。将反应混合物置于预热至85℃的水浴中并在给定温度下剧烈混合8小时。然后将混合物冷却至室温并在冰箱中放置过夜。将反应混合物在冰浴中冷却并在搅拌下加入4ml冷的浓hcl。将所得悬浮液在冰浴中搅拌1小时，然后滤出淡黄色沉淀。n
‑
甲苯磺酰肌氨酸
‑
4,4
‑
d3的产量：3.15g(92％)。
[0115]1нnmr波谱(600mhz,dmso
‑
d6,ppm):δ＝7.67(2h,d,3j＝8.2hz,2,6
‑
ar),7.71(2h,
d,3j＝8.2hz,3,4ar),3.84(2h,s,ch2),2.39(3h,s,arch3)。
[0116]
т
m.
＝149
–
151℃.
[0117]
将甲苯磺酰肌氨酸
‑
d
3 2.8g(0.011mol)溶解在12ml浓hcl中，在100℃下剧烈混合14小时。此后，将混合物冷却至室温并用水稀释。将所得溶液在旋转蒸发仪(38℃水浴)上浓缩，用水重新稀释，并再次浓缩以除去盐酸。如下使用离子交换色谱法从由产物本身、残余盐酸和tsoh组成的反应混合物中分离产物：以每分钟0.1床体积的速率将稀释水溶液(200ml)形式的混合物通过含有46ml(88meq)dowex 50树脂柱。用水洗涤柱子直到出现300ml的中性洗脱液。产物用250ml 1mnh4oh溶液洗脱并在旋转蒸发仪上干燥。肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3的产量：0.86g(85％)。
[0118]1нnmr波谱(600mhz,d2о,ppm):δ＝3.59(s,ch2).
[0119]
т
m.
＝202
–
204℃
[0120]
肌氨酸
‑
2,2
‑
d2的合成。
[0121]
将0.47g(0.002mol)对甲苯磺酰甘氨酸溶解在由3.5ml d2o和0.29g(0.007mol)naoh制备的d2o的碱溶液中。将所得溶液置于玻璃高压灭菌器中，并在冰浴中冷却。向对甲苯磺酰甘氨酸的碱性冷溶液中加入0.46g(0.003mol)ch3i，并进行磁搅拌。将反应混合物置于预热至85℃的水浴中，并在给定温度下剧烈混合8小时。然后将混合物冷却至室温，并放置在冰箱中过夜。在冰浴中冷却反应混合物，并在搅拌时添加0.7ml冷浓缩hcl。将所得悬浮液在冰浴中搅拌1h，然后过滤掉浅黄色沉淀物。进一步的反应不需要纯化产物。n
‑
对甲苯磺酰肌氨酸
‑
2,2
‑
d2的收率：0.44g(90％)。
[0122]1нnmr波谱(600mhz,dmso
‑
d6,ppm):δ＝7.67(2h,d,3j＝8.2hz,2,6
‑
ar),7.71(2h,d,3j＝8.2hz,3,4ar),2.74(3h,s,nme),2.39(3h,s,arch3).
[0123]
т
m.
＝149
–
151℃
[0124]
水解过程与上述肌氨酸
‑
4,4
‑
d3的步骤类似。肌氨酸
‑
2,2
‑
d2产量：84％。
[0125]1нnmr波谱(600mhz,d2о,ppm):δ＝2.68(s,ch3).
[0126]
т
m
.＝200
–
203℃
[0127]
肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5的合成
[0128]
获得n
‑
对甲苯磺酰肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5的方法与前一实施例类似，但使用cd3i代替ch3i。收率：88％。
[0129]1нnmr波谱(600mhz,dmso
‑
d6,ppm):δ＝7.67(2h,d,3j＝8.2hz,2,6
‑
ar),7.71(2h,d,3j＝8.2hz,3,4ar),2.39(3h,s,arch3).
[0130]
т
m
.＝150
–
152℃.
[0131]
水解过程与上述肌氨酸
‑
4,4
‑
d3的步骤类似。肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5的产率：85％
[0132]1hnmr波谱(600mhz,d2o,ppm):波谱仅包含溶剂残留质子的信号。.
[0133]
т
m
.＝200
–
203℃
[0134]
在下面的示例中，使用具有7.05t恒定场的brukerbiospecbc70/30usr断层扫描仪，配备调谐到1h(发射/接收)和2h(发射)的谐振腔，以及直径为5cm的表面接收线圈。
[0135]
使用flash(快速低角度拍摄)脉冲序列记录氘断层图像。激发频率由2hnmr谱测定，并在仪器上用：sfo1≈46.17452mhz，矩形激发脉冲2560hz宽，11.2db功率，偏转角fa＝300，重复时间tr＝11.8ms，回波时间te＝4.07ms，扫描区域10cmx10cm，扫描矩阵50x50，切
片厚度3cm，带宽12500hz，总扫描时间9分34秒(1024次累积)。
[0136]
实施例1.记录含有氘代肌氨酸稀溶液的样品的氘断层图和2hnmr光谱
[0137]
为了证明对氘代肌氨酸稀释溶液进行氘断层扫描的基本可能性，进行了以下实验。
[0138]
将含有5ml肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3(5mg)或肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5(5mg)或肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3(5mg)和肌氨酸
‑
2,2
‑
d2(5mg)的混合物的蒸馏水溶液的玻璃瓶置于断层扫描仪磁铁的中心。将直径为5cm的表面线圈水平放置在小瓶正上方。
[0139]
图1a显示了肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。图1b显示了肌氨酸
‑
2,2,4,4,4
‑
d5样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。图1c显示了肌氨酸
‑
2,2
‑
d2和肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3混合物的样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。
[0140]
实施例2.采用含肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3的诊断药物，使用氘断层扫描可视化小鼠体内的4t1乳腺癌
[0141]
在本实施例中，采用移植有4t1乳腺癌的balb/c小鼠进行实验(实验前12天在左前爪下注射5x105细胞/60μl)。将体重为20g的动物腹腔注射30mg肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3的0.5ml水溶液。注射后10分钟内，用异氟醚固定动物，并将其放置在断层摄影机的加热床上。如图2虚线所示，将表面2h接收线圈从背侧定位在动物身体前部上方。
[0142]
图2显示，观察到氘代肌氨酸衍生物在施用后几分钟内开始在肿瘤组织中累积，随着时间的推移，氘代肌氨酸衍生物在肿瘤组织中累积，在给药后约90
‑
140分钟观察到氘信号的最大强度。从给出的数据可以看出，氘信号持续了几十分钟；因此，肌氨酸
‑
4,4,4
‑
d3有良好的药代动力学，可用于2hmri和mr波谱分析。
[0143]
从上述结果可以看出，基于氘代肌氨酸衍生物的诊断药物能够在病理(肿瘤)组织中以足以在体内记录信息丰富的氘断层图或2h
‑
nmr谱的浓度累积，因此通过2hmri和/或mr波谱分析，可用于包括肿瘤在内的疾病的非侵入性诊断。
[0144]
实施例3.使用含l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3和l
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7的诊断药物，使用氘断层扫描可视化小鼠体内4t1乳腺癌
[0145]
在本例中，在移植有4t1乳腺癌的balb/c小鼠上进行实验(实验前12天在左前爪下注射5
·
105细胞/60μl)。向体重为20g的动物腹腔注射溶液：
[0146]
a)30mgl
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3的0.5ml水溶液；或
[0147]
b)10mgl
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7的1.0ml水溶液(由于苯丙氨酸的低溶解度，相当于氘的较低剂量的苯丙氨酸，因此，不可能在不损害受试者健康的情况下引入更大体积的诊断药物)。
[0148]
在注射后10分钟内，用异氟醚固定动物并放置在断层扫描仪中的加热床上。接收2h线圈的表面位于动物身体前部的背侧，如图3中的虚线所示。
[0149]
图3显示，丙氨酸和苯丙氨酸的氘代衍生物不会在肿瘤组织中累积，也不会在各种器官中显示出累积选择性。这表明，氘代丙氨酸和苯丙氨酸衍生物不能通过2hmri或mr波谱诊断肿瘤疾病。
[0150]
尽管已经参考所公开的实施例描述了本发明，但是对于本领域的专家来说，应当清楚的是，提供详细描述的特定实验仅仅是为了说明本发明，并且不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改。