3-O-氨基磺酸-16,16-二甲基-D-高马萘雌甾酮在治疗肿瘤疾病中的用途的制作方法

3
‑
o
‑
氨基磺酸
‑
16,16
‑
二甲基
‑
d
‑
高马萘雌甾酮在治疗肿瘤疾病中的用途
技术领域
1.本发明涉及医药领域以及化学和制药行业，并且涉及一种用于治疗癌症(包括乳腺癌)的药物。


背景技术：

2.乳腺癌是女性的一种主要的肿瘤疾病[parkin d.m.，bray f.，ferlay j.，pisani p.，ca cancer j.clin.，2005年，第55卷，第74
‑
108页]。根据世卫组织的数据，全世界有209万名患者，每年与乳腺癌相关的死亡人数为62.7万名妇女[http://www.who.int/news
‑
room/fact
‑
sheets/detail/cancer]。
[0003]
在这种位置出现的很大一部分肿瘤是在雌激素的作用下发展而成的[yue w.，yager j.d.，wang j.
‑
p.，jupe e.r.，santen r.j.，steroids，2013年，第78卷，第161
‑
170页]。免疫组织化学分析表明，乳腺癌表达雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和her2neu(使癌症具有“赫赛汀敏感性”)。很大一部分肿瘤具有er、pr和/或her2neu 3 。若某种肿瘤没有er和pr并且对赫赛汀不敏感(er0、pr0、her2neu 0
‑
1)，则被认为是三阴性形式(er
‑
/pr
‑
/her
‑2‑
)。这是最致命的乳腺癌形式之一，因为它没有抑制其生长的靶标。目前，世界上没有治疗这种形式的癌症的药物。
[0004]
雌激素在血液中循环，并以硫酸盐的形式积聚在肿瘤中，这种硫酸盐不能与雌激素受体结合，但在转化为游离激素后，它们会激活肿瘤生长。因此，一个有希望的策略性治疗方法包括使用抑制剂阻断这组中的游离激素在肿瘤中的形成。
[0005]
他莫昔芬是一种来自选择性雌激素受体调节剂的药物，可阻断雌激素对激素依赖性组织(包括乳腺组织)的作用。他莫昔芬是针对绝经前和绝经后妇女的一种激素治疗的标准。在使用他莫昔芬期间出现的最典型的副作用包括：静脉血栓形成的风险增加、心血管疾病(包括心绞痛发作)病程加重、子宫内膜肿瘤(息肉和子宫内膜癌)以及子宫纤维瘤的发展。他莫昔芬还有肝毒性。根据由gordon amidon等人在1995年开发的生物制药分类系统(bcs)，他莫昔芬被归入第二类，即，具有低溶解度和高渗透性的药物。
[0006]
芳香酶抑制剂已被证明比他莫昔芬更有效。目前，诸如来曲唑和阿那曲唑的芳香酶抑制剂已在本领域投入使用。根据bcs系统，它们被归入第一类，即，高溶解度和高渗透性的药物。芳香酶抑制剂的副作用包括骨质疏松症、潮热和头痛。
[0007]
除了上述药物之外，甾体硫酸酯酶也是一个备受关注的课题，因为丰富的循环雌酮硫酸酯库(pool)会在局部间质中形成雌激素。甾体硫酸酯酶催化雌酮硫酸酯水解为雌酮，并催化dhea硫酸酯水解为dhea(dibbelt i.，biol.chem.，霍佩塞勒，1991年，第372卷，第173
‑
185页；stein c.，j.biol.chem.，1989年，第264卷，第13865
‑
13872页)。
[0008]
最著名的甾体硫酸酶抑制剂是emate
‑‑
雌酮氨基磺酸酯(ahmed s.，curr.med.chem.，2002年，第9卷，第2期，第263
‑
273页)。但是，它有一个明显的缺点。含有氨基磺酸酯基团的雌酮硫酸酯酶抑制剂随着游离配体的释放而导致不可逆的酶失活
[howarth n.m.，purohit a.，reed m.j.，j.med.chem.，1994年，第37卷，第219
‑
221页]。尤其是，雌酮氨基磺酸酯抑制雌酮硫酸酯酶，但游离激素的释放导致强亲子宫活性(uterotropic)的出现[shields
‑
botella j.等人，j.steroid biochem.mol.biol.，2003年，第84卷，第327
‑
335页]。
[0009]
因此，在寻找新的抗癌药物时，需要考虑到雌酮硫酸酯酶抑制剂的氨基磺酸酯基团的载体不应具有激素(亲子宫)活性。
[0010]
已知的是，没有致癌特性的d
‑
马萘雌甾酮用作一种预防乳腺癌的药物。从马萘雌甾酮衍生物制备了具有降胆固醇作用但不具有亲子宫和高甘油三酯血症活性的制剂[urusova e.a.，gluzdikov i.a.，selivanov s.i.，starova g.l.，nikolaev s.v.，shavva a.g.，“synthesis and study of equilenin derivatives and its modified analogs”，russ.j.org.chem.，2004年，第40卷，第4期，第506
‑
512页]。
[0011]
马萘雌甾酮化合物是用于激素替代疗法的药物的成分。这些特性是理想的，因为甾体雌激素代谢抑制剂的使用意味着它们的长期应用。


技术实现要素：

[0012]
本发明的技术问题是提供化合物并开发一种合成这些化合物的高效方法，所述化合物可在诸如肝细胞癌、胃癌、肺癌、慢性髓细胞性白血病和乳腺癌(包括其最致命形式，例如三阴性乳腺癌(er
‑
/pr
‑
/her
‑2‑
))的肿瘤疾病的单一疗法和辅助疗法中用作抗癌剂。
[0013]
此问题是通过使用抑制雌酮硫酸酯酶的式(3)的化合物3
‑
o
‑
氨基磺酸
‑
16,16
‑
二甲基
‑
d
‑
高马萘雌甾酮解决的。
[0014][0015]
下面示出了式(3)的目标化合物的合成方案。与现有技术相比，所提出的方案的一个显著优点是它允许将目标化合物(药物)的生产规模扩大到工业规模。
[0016]
[0017]
已知的异硫脲盐[al safar、zakharychev a.v.、ananchenko s.n.、torgov i.v.，synthesis of some 16,16
‑
dimethyl
‑
d
‑
homosteroids，reports of academy of sciences of the ussr.ser.chem.，1968年，第10期，第2326
‑
2332页]与2,4,4
‑
三甲基环戊烷
‑
1,3
‑
二酮的反应导致开环甾类化合物的形成，这些开环甾类化合物的环化脱水产生式(1)的五烯甲雌醇核。在以前提出的合成结构相似的d
‑
高类似物(homoanalogue)的条件下用ni/ra处理五烯甲雌醇核[gluzdikov i.a.，egorov m.s.，selivanov s.i.，starova g.l.，shavva a.g.，new analogues of d
‑
homoequilenene with substituents in the d ring，rus.j.org.chem.，2006年，第42卷，第11期，第1675
‑
1682页]，可分离出式(2)的16.16
‑
二甲基
‑
d
‑
高马萘雌甾酮的甲酯[gluzdikov i.a.，化学博士论文，2007年，圣彼得堡]。按照众所周知的方法获得式(3)的氨基磺酸酯[morozkina s.n.，gluzdikov i.a.，drozdov a.s.，selivanov s.i.，kovalev r.a.，filatov m.v.，shavva a.g.，russ.j.org.chem.，2015年，第51卷。第3期，第425
‑
430页]。
[0018]
甾体结合模拟的结果表明，这种甾体的结构与配体结合受体袋的几何形状的相容性很差。甾体酮基团中的氧与his524的nh之间的距离为这妨碍了氢键的形成。сз处的羟基与羧基glu353中的氧原子之间的距离经过计算大约为远大于含有天然激素雌二醇的复合物中的距离
[0019]
甾体的几何形状与负责配体结合的受体区之间的不相容会导致目标化合物对受体的亲和力很低，造成该甾体没有亲子宫活性。
[0020]
该化合物完全抑制肿瘤mcf
‑
7细胞的增殖。
[0021]
这种药物属于第四危害性类别(4
th hazard class)(ld
50
>300
‑
2000mg/kg)。所获得的数据允许将用于抗肿瘤活性研究的剂量确定为安全剂量。
[0022]
对与雌激素受体结合的研究表明，氨基磺酸酯在浓度为
‑
0.001和0.01、0.1和1.0μmol/ml时没有激素活性。
[0023]
在具有三阴性乳腺癌异种移植人类肿瘤的动物模型中，所提出的化合物(药物)比在临床实践中使用的他莫昔芬和芳香酶抑制剂来曲唑更有效。
[0024]
因此，该化合物可用于乳腺癌治疗领域，包括三阴性形式的乳腺癌。
[0025]
与抗肿瘤药物他莫昔芬(对照药物)平行对比，进行了乳腺癌模型中的特异性活性的临床前研究。对具有皮下(s.c.)移植的肿瘤细胞的雌性balb/c裸鼠进行了体内药物对比研究。实验在首次给药后持续29天(在肿瘤株移植后第5天开始给药)。
[0026]
药物和对照药物以每天30mg/kg和10mg/kg的剂量胃内多次给药，持续21天。
[0027]
对安慰剂组以相同的方案和相等的剂量给予1％淀粉溶液灌胃。每周测量2次肿瘤结节。通过标准肿瘤生长抑制(tgi)指数评估抗肿瘤活性。在治疗完成后，进行最后一次肿瘤测量，并对动物进行称重和实施安乐死。
[0028]
对动物的所有必要操作(测试、称重、测量和动物尸检)都是在上午9点到12点进行的。
[0029]
在实验的第一天对动物进行称重，然后根据研究方案在整个实验过程中每周称重2次。
[0030]
在整个实验过程中，在肿瘤移植后每周测量肿瘤结节2次。肿瘤结节体积按下式确
定：
[0031]
v＝π/6*l*w*h，其中l、w、h是肿瘤的线性尺寸。
[0032]
抗肿瘤活性的测定
[0033]
使用肿瘤生长抑制指数(tgi)作为研究药物疗效的标准，并通过下式计算：
[0034]
tgi(％)＝|v
对照
–
v
实验
|/v
对照
*100
[0035]
其中v
对照
和v
实验
分别是对照组和实验组中的平均肿瘤体积(mm3)。
[0036]
在疗程结束后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死。
[0037]
使用spss 21软件包(许可证号20130626
‑
3)进行统计数据处理。研究中的描述性统计包括以下内容：算术平均值、标准差(sd)、标准平均误差(se)、中位数、四分位数、四分位距。为了比较各组的量化特征，使用mann
‑
whitney
‑
wilcoxon检验，而没有对多重比较进行校正。结果被认为具有统计学意义(p<0.05)。
[0038]
her
‑
2/neu转基因的雌性fbv/n小鼠的乳腺肿瘤(bt)是腺癌，其特征是雌激素受体(er)含量低(图1)，并且孕酮受体(pr)缺乏。可区分两种腺癌亚型，具体而言是er 、pr
‑
和er
‑
、pr
‑
[2]。乳腺肿瘤中的erα的免疫组织化学分析表明，在45个样本中，仅有10个样本的细胞核呈单一阳性染色(图1)。
[0039]
该模型对环磷酰胺、阿霉素、5
‑
氟尿嘧啶(caf)治疗敏感，能观察到肿瘤生长抑制，导致平均肿瘤体积稳定(图2)。实验第14天和第21天的肿瘤生长抑制(tgi)分别为63％和46％。
[0040]
由于动物可能患有多个肿瘤，因此在实验开始时分析小鼠的平均总肿瘤体积(图3)及其肿瘤体积的相对变化(图4)是合理的。肿瘤体积的相对增大图显现出该参数在对照组中是线性变化的，这表明该参数适合用于评估肿瘤对治疗的生物反应。例如，在近3周的时间内，用caf疗法进行的治疗未引起该参数的任何变化，这表明疾病稳定。到第21天，个体肿瘤稳定的频率大约为60％。
[0041]
此研究通过常规类别在her
‑
2/neu转基因的雌性fvb小鼠中进行的；该品系从charles river laboratories(意大利)小鼠库获得的。研究开始时，动物的年龄为21
‑
41周，体重为25
‑
30克。
[0042]
在实验中使用了他莫昔芬hexal(德国霍尔茨基兴市的hexal ag，83607，批号ha1575，2017年1月)，其代表一种药物的剂型，该药物配制成白色或微黄色包衣的圆形双凸面片剂，具有均匀光滑的表面，包含20mg活性化合物。
[0043]
饲养条件是根据《实验动物护理和使用指南》(the guide for care and use of laboratory animals)(ilar出版物，1996年版，美国国家学术出版社，1996年)中规定的标准选择的。
[0044]
在单独的房间中将动物分组(每组不超过5只动物)置于适合于实验室啮齿动物的独立t2型笼子中饲养。笼子的尺寸为268
×
215
×
141mm3(底面积为370cm2)，每个笼子配有聚碳酸酯桶、带饲料容器的不锈钢盖子和饮水瓶分隔器。
[0045]
笼内草垫是由无尘刨花制成的。
[0046]
这些动物可不受限制地获得针对实验室啮齿动物的混合全颗粒饲料。
[0047]
饮用水可从由tecniplast制造的标准190ml饮水瓶随意获取，该饮水瓶由高温聚砜制成，带有硅胶环和由aisi 316不锈钢制成的金属盖。
[0048]
室温保持在20
‑
26℃的水平，相对湿度为50
‑
70％。光照周期设定为用荧光灯人工照明12:12小时夜/天。
[0049]
在笼子上放置一张标识卡，上面有笼子/卡片编号、实验组编号、各组动物的数量、它们的编号和性别、研究编号、负责研究人员的姓名。每个动物的耳廓都用美国kent
‑
scientific镍合金制成的用于小型实验室啮齿动物的金属标示物夹住(标示物具有由制造商压印的三位数字)。
[0050]
在实验结束时，用二氧化碳对小鼠实施安乐死。对所有动物尸体进行尸检，然后进行了微观描述。
[0051]
使用oecd 423试验(oecd化学品试验指南
‑
急性口服毒性
‑
急性毒性分级法)测定了该药物在her
‑
2/neu转基因的fvb小鼠体内的ld
50
值。
[0052]
在实验中使用了12只雌性小鼠。
[0053]
在第一步中，给3只小鼠被给予剂量为300mg/kg的药物。使用金属无创伤性管饲法对所研究的药物进行胃内(i.g.)给药(该程序与临床环境中的口服给药对应)。为了进行胃内给药，将药物的活性化合物与橄榄油混合，以制备所需浓度的悬浮液，用于每10g动物体重给药0.1ml悬浮液。给药的剂型是临时制备的。
[0054]
由于在以300mg/kg的剂量给药后没有动物死亡，因此对另外3只动物给予了相同的剂量。在这组中也未发现死亡。因此，进一步以2000mg/kg的剂量分两步给药，每步中向3只动物给药。
[0055]
按照表1所示的方案进行临床观察并记录体重。每天对动物进行两次检查，在给药后的前60分钟内进行单独的临床检查，在前4小时内给予特别关注，在前24小时内和第二天进行定期检查，然后每周检查，最多14天。每只动物在观察者手中的笼子里被进行彻底检查。记录动物的整体状况，例如它们的行为特性、运动活动的强度和性质、毛和皮肤的外观。
[0056]
使用经过验证的高速电子实验室天平ohaus scout pro(美国)记录动物的体重，该天平的最大负载量为2000g、测量步长为0.1g。
[0057]
在第15天，对动物实施安乐死，并进行尸检分析，记录宏观变化。将数据收集在一个专用的个体尸检表格中。
[0058]
在研究结束时，对所有实验动物进行病理形态学检查。仔细检查被安乐死的动物的外部病理变化。检查胸腔和腹腔，并进行内脏的宏观分析。没有对实验动物的器官和组织进行微观分析，因为在整个观察期间没有记录到动物死亡。此外，对内脏的宏观分析没有反应出任何病理变化。
[0059]
表1.
[0060]
在评估急性毒性时对动物进行观察和称重的方案
[0061][0062]
使用金属无创伤性管饲法对所研究的药物进行胃内给药(该程序与临床环境中的口服给药途径对应)。该药物是以(20mg/kg体重)单次每日剂量和100mg/kg体重的5倍每日
剂量给药的。用于给药的药剂的临时溶液是以橄榄油(添加有未精炼的特级初榨橄榄油的精炼橄榄油，以global village“clasico”商标出售，批号为l:183351116，保质期到2020年4月26日，西班牙baieo)制备的。给药量为每10g小鼠体重0.1ml(每20g小鼠0.2ml即用型制剂)。在随机分组后24小时开始给药。给药疗程为27
‑
28天。
[0063]
对照药物他莫昔芬也是使用金属无创伤性管饲给药的(该程序与临床环境中的口服给药对应)，每日剂量为4.0mg/kg，这是根据临床剂量计算的[5]。该剂量与20mg/kg的人体每日剂量对应。将他莫昔芬片剂在捣碎器中粉碎，使用所得的粉末制备40ml橄榄油中的悬浮液，给药量为每10g小鼠体重0.08ml，给药持续时间与实验药物的持续时间相同，持续27
‑
28天。
[0064]
给对照组饲喂橄榄油(安慰剂)。
[0065]
评估标准包括临床观察数据、动物体重、死亡时间(若适用)、肿瘤随时间的生长、病理形态学检查数据(尸检期间肿瘤的验证、通过内部器官变化的宏观表现评估毒性作用)。
[0066]
使用经过验证的高速电子实验室天平ohaus scout pro(美国)在第一次给药前记录动物的体重，然后每周记录两次，该天平的最大负载量为2000g，测量步长为0.1g。
[0067]
在称重过程中，每周对动物体内的宏观上可检测到的的肿瘤结节测量一次。为每个结节记录两个线性尺寸，包括最大尺寸和相对于前者的最大矩形尺寸。最大尺寸作为肿瘤结节的长度(a)，第二个尺寸作为肿瘤结节的宽度(b)。肿瘤体积按如下表达式计算：
[0068]
v＝(a
×
b)2/2，
[0069]
通过记录每只小鼠的平均肿瘤体积的变化、肿瘤生长抑制(tgi)和平均总肿瘤体积及其随时间的变化来评估治疗的疗效。
[0070]
肿瘤生长抑制的百分比按如下表达式计算：
[0071]
tgi＝(v
对照
‑
v
实验
)/v
对照
×
100(％)，
[0072]
其中v
对照
是对照组的平均肿瘤体积，v
实验
是实验组的平均肿瘤体积。
[0073]
将各个表格的原始数据转移到微软excel 2007表中。为所有量化数据计算组算术平均值(m)和标准偏差(m)。使用统计软件graphpad prism6.0进行了统计分析。使用anova回归分析和费希尔精确检验评估各组之间的差异。
[0074]
在评估急性毒性时，在前60分钟内连续观察动物，然后在3小时内每小时检查一次，在24小时内再检查一次。在第二天，每天观察两次。然后每天观察一次。在活性化合物给药后，每隔一天对每只动物进行临床检查一次，然后每周检查一次。每只动物在观察者手中的笼子里被进行彻底检查。记录动物的整体状况，例如它们的行为特性、运动活动的强度和性质、毛和皮肤的外观。
[0075]
在实验期间，在以300mg/kg的剂量给药时，没有发现动物死亡。在整个观察期间，没有动物表现出中毒的视觉迹象。动物的外观和行为都和往常一样。当用手拿起时，这些动物表现出常规的微弱反应。在给药时或给药之后不久，没有发现动物发出声音。
[0076]
对动物的总体状况和行为反应的每日监测表明，单次口服试验药物不会影响暴露于中毒的实验动物的总体状况和活动。
[0077]
体重数据在表2和表3中示出。
[0078]
表2.
[0079]
以300mg/kg的剂量给药后动物体重的变化
[0080][0081]
根据表2中的数据，在观察期间，接受300mg/kg剂量的药物的动物的平均体重稳定增加。
[0082]
由于给药剂量为300mg/kg时没有动物死亡，因此将给药剂量设为2000mg/kg。分两步给药，间隔3小时，每步时的剂量为每10g体重0.1ml，浓度为100mg/ml，这是因为油中的悬浮液在较高浓度时较稠，不能通过管饲法给药。在以2000mg/kg剂量给药后，没有发现中毒的临床迹象。不论是哪一组，在整个观察期间，动物的睑裂宽度几乎没有变化。未检测到眼睛的病理性分泌物。鼻子呈粉红色，适度湿润，无病理性分泌物。所有小鼠的毛都很整齐，有光泽，没有秃斑。观察到动物的平均体重在第2天比基线下降了1％，在第7天下降了2％(表3)。在观察期结束时，平均体重超出基线值3％。
[0083]
表3.
[0084]
以2000mg/kg的剂量给药后动物体重的变化
[0085][0086]
对所有计划在实验第15天实施安乐死的动物都进行了尸检。宏观检查没有发现内脏状况有任何异常。
[0087]
尸检数据如下：
[0088]
动物的毛外表整洁，光亮，无秃斑。动物的营养状况令人满意。
[0089]
自然孔口无病理性分泌物。
[0090]
颌下淋巴结呈圆形，淡粉色，密度适中。唾液腺形态正常，呈淡黄色，密度适中。
[0091]
腹膜光滑有光泽，腔内无游离液。
[0092]
脾脏未肿大，致密，包膜光滑有光泽。胰腺呈浅粉色，有叶状结构。
[0093]
肝脏的大小和形状无变化，肝包膜有光泽。肝组织呈褐色，质地中等致密。
[0094]
肾脏致密，包膜光滑、有光泽，肾脏周围有适度的脂肪组织增生。
[0095]
卵巢未增大，表面有光泽。
[0096]
胃有折叠的有光泽粘膜，内腔有少量粘液和食物。
[0097]
胸膜光滑有光泽，胸腔内无游离液。胸腺呈三角形，白色。肺部呈淡粉色，通气良好。
[0098]
因此，根据oecd 423试验，该药物可归入第五类或未分类类别，ld
50
等于或大于5000mg/kg，这与低危害化合物类别对应。
[0099]
动物令人满意地耐受了药物的给药，未观察到毒性的临床迹象。此外，接受药物的动物的毛有光泽，而对照组动物的毛有些凌乱。在对照组中，肿瘤结节也更明显。
[0100]
在实验结束时进行尸检分析后，未发现内脏器官有毒性损伤的特定迹象。与对照组动物相比，在以20mg/kg剂量给药时，尤其是以100mg/kg剂量给药时，肿瘤病变的体积明显较小。
[0101]
在整个观察期间，所有组的动物的体重都增加了。体重增加可能与小鼠体内的肿瘤结节体积增大有关(表4)。
[0102]
表4.
[0103]
在评估药物的抗肿瘤活性时小鼠的平均体重的变化(g)
[0104][0105]
对平均肿瘤体积变化的分析表明，20mg/kg和100mg/kg剂量的给药产生了统计上显著的抗肿瘤效果，因此在实验的第28天，20mg/kg剂量的tgi为27％，100mg/kg剂量的tgi为42％；这种效果是与剂量相关的。应说明的是，在28天的观察期间，100mg/kg的给药导致平均肿瘤体积仅从基线值增加了60％，而对照组中增加了155％(图5)。
[0106]
表5.
[0107]
在使用20mg/kg和100mg/kg的剂量评估药物的抗肿瘤活性时在实验开始时肿瘤的平均体积的变化(cm3)
[0108][0109]
m是平均值；m是平均误差；n是分析中包括的治疗开始时的肿瘤数目。
[0110]
#
对照药物组来自第三系列实验。
[0111]
*与对照组相比，p<0.05，
[0112]
a
与对照药物组相比，p<0.05。
[0113]
值得注意的是，每种剂量的药物的给药均导致到观察期结束时肿瘤生长抑制提高，但是在使用对照药物给药后，tgi效果在实验的第21天达到最大值。因此，延长给药时间有望提高药物的效果。
[0114]
对稳定频率的分析表明，通过以100mg/kg的剂量给药，该参数从对照组的8％显著增加到27％。此外，与对照组相比，在观察期间形成的新肿瘤的平均体积及其数量较小(表6)。
[0115]
表6.
[0116]
在评估药物的抗肿瘤活性时肿瘤稳定频率以及在实验结束时出现的新肿瘤的数量和平均体积
[0117][0118]
疾病稳定百分比是一个类似于recist标准的参数，它反映了肿瘤的发生频率，在观察结束时，肿瘤体积相对于治疗开始时的增加量不超过20％。
[0119]
*与对照组相比，p<0.05。
[0120]
#
对照药物组来自第三系列实验。
[0121]
从第14天到第28天，以20mg/kg和100mg/kg的剂量给药的小鼠的肿瘤平均总体积显著低于对照组的值。对于实验第28天的100mg/kg剂量，与对照药物相比，该参数在统计学上显著降低(表7，图6)。
[0122]
表7.
[0123]
评估药物的抗肿瘤活性时小鼠体内的肿瘤的平均总体积(cm3)
[0124][0125][0126]
#
对照药物组来自第三系列实验。
[0127]
*与对照组相比，p<0.05。
[0128]
*与对照药物组相比，p<0.05。
[0129]
对平均总肿瘤体积的相对变化的评估已经证明了该药物的剂量依赖性效应和优于他莫昔芬的疗效(图7，表8)。
[0130]
表8.
[0131]
在评估药物的抗肿瘤活性时小鼠体内的平均肿瘤总体积与第1天相比的相对变化(以％表示)
[0132][0133]
为了评估药物的激素作用，在观察期的第28天测量无角子宫体的重量(表9)。未观察到此参数的显著差异。
[0134]
表9.
[0135]
在评估药物的抗肿瘤活性时患有乳腺肿瘤的小鼠的子宫体重量和体重
[0136][0137]
*包括1只处于发情后期的动物；e
‑
发情期；d
‑
间情期。
[0138]
剂量为20mg/kg和100mg/kg的药物具有显著的抗肿瘤作用，因此在实验的第28天，使用20mg/kg剂量和100mg/kg剂量的tgi为27％和42％，这种作用是与剂量相关的(差异具有统计学意义)。以100mg/kg的剂量给药显著提高了肿瘤稳定频率，从对照组的8％提高到27％。在第28天至观察期结束时，剂量为100mg/kg的药物在统计学上明显比对照药物他莫昔芬(4.0mg/kg)更有效。
[0139]
研究表明，此药物没有亲子宫活性。
[0140]
根据oecd 423试验，本药物可归入第五类或非分类类别，其ld
50
等于或大于5000mg/kg，这与经过批准的国家标准定义的低危害化合物类别对应。
附图说明
[0141]
本发明是通过以下附图示出的：
[0142]
图1示出了用erα抗体对乳腺肿瘤进行染色。
[0143]
辣根过氧化物酶 二氨基联苯胺的可视化，100倍放大倍率(a)。乳腺导管细胞核和单个肿瘤细胞核的特异性染色，400倍放大倍率(b)。
[0144]
图2示出了在实验开始时接受caf治疗的小鼠体内的肿瘤的平均体积。
[0145]
图3示出了在实验开始时接受caf治疗的小鼠体内的肿瘤的平均总体积。
[0146]
图4示出了在实验开始时接受caf治疗的小鼠体内形成的肿瘤的平均总体积的相对变化。
[0147]
图5示出了在评估药物的抗肿瘤活性时小鼠体内的肿瘤的平均体积。
[0148]
图6示出了在评估药物的抗肿瘤活性时小鼠体内的肿瘤的平均总体积。
[0149]
图7示出了在评估药物的抗肿瘤活性时小鼠体内的肿瘤的平均总体积的相对变化。
具体实施方式
[0150]
下面将通过本公开的实施例进一步说明本发明。
[0151]
实施例1
[0152]
对传代的mcf
‑
7人类细胞培养物(乳腺癌)进行了研究分析。使用早期传代的正常人类皮肤成纤维细胞(hdf)作为阴性对照。在37℃温度下在5％二氧化碳气氛中，在添加了1.0％不含抗生素的胎牛胚胎血清(biolot)的dmem/f12培养基(biolot)中，在卡雷尔瓶(carrel vial)中对细胞进行培养。
[0153]
以每瓶50x104个细胞的密度在卡雷尔瓶上接种细胞。为了研究细胞在硫酸酯酶抑制条件下的增殖活性，接种后24小时，将培养基替换为含有硫酸酯酶抑制剂的培养基，最终浓度为50μg/ml，然后将这些肿瘤细胞系孵育不同时间(24至72小时)。抑制剂溶解在二甲基亚砜(dmso)中。培养基中的dmso的最终浓度不超过0.5％。为了排除dmso的细胞毒性作用，制备了含有dmso但不含硫酸酯酶抑制剂的对照样品。为了排除化合物的非特异性损害作用，使用了正常人类皮肤成纤维细胞。然后使用乙二胺四乙酸
‑
胰蛋白酶(versene
‑
trypsin)溶液(biolot)分离细胞，放到含有新鲜的完全培养基的卡雷尔瓶上。在未处理的对照细胞达到培养瓶的单位表面积的最大细胞密度(单层)时，对细胞进行计数，并将它们的数量设为100％。以一式三份的形式测定了暴露于硫酸酯酶抑制剂的所有被研究的细胞培养物的增殖活性。
[0154]
对获得的氨基磺酸酯对传代的人类mcf
‑
7细胞培养物(乳腺癌)的增殖的影响的研究表明，浓度为20μg/ml的式(3)的甾体完全阻止了肿瘤细胞的增殖，但它不影响没有雌激素受体的人类皮肤成纤维细胞的生长。肿瘤细胞的增殖受到抑制的程度与已临床使用30多年的他莫昔芬的作用相同。这一点非常重要，因为氨基磺酸酯和他莫西芬有不同的作用机理，有可能将它们组合使用。
[0155]
在患有乳腺肿瘤的her
‑
2/neu(er
‑
/pr
‑
/her2 )转基因的fvb小鼠的实验中，该药剂比临床使用的他莫昔芬更有效地抑制肿瘤的增殖，这表明它们作为乳腺癌治疗组合的潜在用途。
[0156]
在三阴性乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞系中，该化合物抑制细胞增殖达83％，这与在临床实践中使用的化疗药物依托泊苷类似。
[0157]
该药物对肝细胞癌sk
‑
hep
‑
1细胞(ic
50
＝53.4μm)、肺癌a549(ic
50
＝29.6μm)、胃腺癌snu638(ic
50
＝22.8μm)以及慢性髓细胞性白血病细胞(k562)具有活性。
[0158]
实施例2
[0159]
对照组：有10只小鼠，每组10个肿瘤。治疗开始时，v
平均
＝1.5
±
0.4mm3。在未经特定治疗的情况下，移植后第33天时肿瘤的尺寸达到v
平均
＝233.2
±
86.5mm3。在观察期结束前，该组的死鼠数量为10只中死亡2只。
[0160]
药物组，10mg/kg：有7只小鼠，每组7个肿瘤。
[0161]
在治疗开始时，v
平均
＝1.0
±
0.4mm3，与对照组无显著差异。在治疗开始后的第7天时，记录到不显著的tgi＝74.3％(v
平均
＝5.1
±
2.3mm3，而对照组的v
平均
＝20.0
±
6.0mm3，p<0.220)。在治疗开始后的第10天，tgi＝68.0％(v
平均
＝24.8
±
12.2mm3，而对照组的v
平均
＝77.3
±
32.0mm3，p<0.181)。在治疗开始后的第14天，观察到94.3％的最大显著tgi(v
平均
＝6.9
±
2.2mm3，而对照组的v
平均
＝120.6
±
44.4mm3，p<0.03)，到第17天和第21天，该值保持在大致相同的水平，为90.6％(v
平均
＝17.6
±
0.7mm3，而对照组的v
平均
＝186.4
±
65.0mm3，p<0.061)和90.2％(v
平均
＝26.l
±
12.l mm3，而对照组的v
平均
＝266.5
±
91.3mm3，p<0.061)。在观察期结束前，该组的死鼠数量为7只中死亡5只。
[0162]
他莫昔芬组，30mg/kg：有7只小鼠，每组7个肿瘤。在治疗开始时，v
平均
＝0.9
±
0.2mm3，与对照组无显著差异。在第7天，tgi为12.6％(v
平均
＝18.8
±
7.4mm3，而对照组的v
平均
＝20.0
±
6mm3，p<0.962)，并且到观察期结束时也未超过这些值。在治疗开始后的第17天和第21天，观察到负tgi值，在第21天达到最大值tgi＝
‑
44.2(v
平均
＝384.8
±
103.2mm3，而对照组的v
平均
＝266.5
±
91.3mm3，p<0.106)。在观察期结束前，该组的死鼠数量为7只中死亡6只。
[0163]
他莫昔芬组，10mg/kg：有7只小鼠，每组7个肿瘤。在治疗开始时，v
平均
＝0.7
±
0.1mm3，与对照组无显著差异。在治疗开始后的第7天时，记录到不显著的tgi＝63.9％(v
平均
＝7.2
±
3.9mm3，而对照组的v
平均
＝20.2
±
6.0mm3，p<0.364)。在治疗开始后的第10天，记录到tgi＝56.9％(v
平均
＝33.4
±
16.l mm3，而对照组的v
平均
＝77.3
±
32.0mm3，p<0.315)。从第14天到第17天，观察到tgi分别增加到60.6％(v
平均
＝47.5
±
16.8mm3，而对照组的v
平均
＝120.6
±
44.4mm3，p<0.193)和68.9％(v
平均
＝58.0
±
18.2mm3，对照组的v
平均
＝186.4
±
65.0mm3，p<0.070)。在治疗开始后的第21天以及直到观察期结束，tgi低于生物学上的显著值(<50％)。在观察期结束前，该组的死鼠数量为7只中死亡2只。
[0164]
测量的最终结果及其组间差异的统计学意义在表10和11中示出。
[0165]
表10.
[0166]
用sem观察时各组中的小鼠的平均肿瘤体积(m
±
m)
[0167][0168]
表11.
[0169]
在整个观察期间药物和他莫昔芬对skbr
‑
3生长抑制的影响，tgi％
[0170][0171]
实施例3
[0172]
对照组：有12只小鼠，每组12个肿瘤。在治疗开始时，v
平均
＝3.8
±
1.0mm3。在未经特定治疗的情况下，移植后第30天时肿瘤的尺寸达到v
平均
＝299.l
±
100.5mm3。在观察期结束前，该组的死鼠数量为12只中死亡6只。
[0173]
药物组，10mg/kg：有10只小鼠，每组10个肿瘤。在治疗开始时，v
平均
＝1.6
±
0.4mm3，与对照组无显著差异。在治疗开始后的第7天时，记录到显著的tgi＝66.1％(v
平均
＝27.0
±
5.l mm3，而对照组的v
平均
＝79.6
±
14.2mm3，p<0.002)。在治疗开始后的第10天，记录到tgi＝78.7％(v
平均
＝21.6
±
4.9mm3，而对照组的v
平均
＝101.2
±
22.5mm3，p<0.007)。在治疗开始后的第14天时，记录到最大不显著tgi＝83.1％(v
平均
＝27.6
±
2.6mm3，而对照组的v
平均
＝163.3
±
31.0mm3，p<0.06)。在治疗开始后的第17天，tgi降低到76.1％(v
平均
＝46.3
±
5.3mm3，而对照
组的v
平均
＝193.6
±
39.6mm3，p<0.04)。在观察期结束前，该组的死鼠数量为10只中死亡10只。
[0174]
他莫昔芬组，30mg/kg：有10只小鼠，每组10个肿瘤。在治疗开始时，v
平均
＝4.1
±
1.2mm3，与对照组无显著差异。在第7天以及直到观察期结束，tgi低于生物学上的显著阈值，并且未超过44.5％(v
平均
＝44.1
±
8.8mm3，而对照组的v
平均
＝79.6
±
14.2mm3，p<0.10)。在观察期结束前，该组的死鼠数量为10只中死亡4只。
[0175]
他莫昔芬组，10mg/kg：有10只小鼠，每组10个肿瘤。在治疗开始时，v
平均
＝2.3
±
0.8mm3，与对照组无显著差异。在该组中，在整个观察期间未检测到肿瘤生长抑制。在观察期结束前，该组的死鼠数量为9只中死亡6只。
[0176]
测量的结果及其组间差异的统计学意义在表12和13中示出。
[0177]
表12.
[0178]
用sem观察时各组中的小鼠的平均肿瘤体积(m
±
m)
[0179][0180]
表13.
[0181]
在整个观察期间药物和他莫昔芬对tnbc_kad生长抑制的作用，tgi％
[0182][0183]
在两种不同表型的人类skbr
‑
3和tnbc
‑
kad乳腺癌的皮下移植物模型中，对无胸腺的免疫缺陷balb/c的裸鼠多次给药后，进行了该药物的抗肿瘤活性的比较研究。
[0184]
与他莫昔芬(剂型)相比，药物在skbr3模型中的抗肿瘤活性的初步实验表明，在所有研究的治疗方案中，以10mg/kg的剂量使用药物的治疗是最有效的：在治疗开始后的第10天，显现出显著的抗肿瘤作用，即，最大tgi＝91.2％(v
平均
＝2.2
±
2.0mm3，而对照组的v
平均
＝24.9
±
12.5mm3，p<0.018)，同时药物的耐受性较好。10mg/kg剂量的他莫昔芬没有效果：在整个观察期内未达到生物学上显著的tgi值。相反，在治疗开始后的第10至17天，记录到肿瘤生长刺激。
[0185]
与他莫昔芬(对照药物)相比，在同一个skbr3模型中对所述药物的抗肿瘤活性的重复实验表明，10mg/kg剂量的药物具有很高的抗肿瘤作用，在第14天(94.3％，p<0.03)和第24天(86.3％，p<0.04)达到最大显著tgi，这再现了在第一个实验中获得的结果。
[0186]
与他莫昔芬(对照药物)相比，在tnbc_kad模型中对所述药物的抗肿瘤活性的实验表明，在治疗开始后的第7天和第10天，10mg/kg剂量的药物抑制肿瘤生长66.1％和78.7％
(观察到与对照组和30mg/kg他莫昔芬组之间的显著差异)。该作用持续10天，大致处于相同水平。30mg/kg剂量的他莫昔芬在第7天时产生了较弱且不显著的肿瘤生长抑制作用，抑制率为44.5％，这种抑制作用到观察结束时降低。10mg/kg剂量的他莫昔芬在此模型中没有效果。
[0187]
工业实用性
[0188]
所进行的实验表明，所述化合物的要求保护的用途的特征在于：
[0189]
‑
没有亲子宫活性，
[0190]
‑
广泛的抗癌活性，包括抗三阴性乳腺癌的活性，
[0191]
‑
没有毒性，
[0192]
‑
有降胆固醇活性，并且对血清中的甘油三酯含量没有影响，
[0193]
‑
对子宫内膜没有不良影响。
[0194]
本发明可用于：
[0195]
‑
绝经后妇女的早期激素阳性乳腺癌的单一疗法和辅助疗法；
[0196]
‑
已使用他莫昔芬治疗2
‑
3年的绝经后妇女的激素阳性乳腺癌的早期单一疗法和辅助疗法；
[0197]
‑
晚期乳腺癌的治疗；
[0198]
‑
三阴性乳腺癌的治疗；
[0199]
‑
肝细胞癌的单一疗法和辅助疗法；
[0200]
‑
胃癌的单一疗法和辅助疗法；
[0201]
‑
肺癌的单一疗法和辅助疗法；
[0202]
‑
慢性髓细胞性白血病的单一疗法和辅助疗法。