结核菌UreC蛋白在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用的制作方法

结核菌urec蛋白在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及结核菌urec蛋白在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用。


背景技术：

2.结核分枝杆菌感染引起的结核病至今还是世界难题之一。在world health organization(who)全球结核病报告中指出，2019年全球有140万人死于结核病。结核病是全球十大死因之一，也是由单一病原感染引起的死亡人数最多的疾病，而我国是全球第二大结核病高负担国家。导致结核病不能被有效控制的主要原因是现有结核病疫苗
‑
卡介苗的保护效果有限和耐药结核与日俱增，而结核病机制研究可以为新疫苗和新药的开发提供有效靶点。在结核分枝杆菌感染宿主初期，巨噬细胞等天然免疫细胞识别结核分枝杆菌后激活下游级联信号，启动多种天然免疫反应抵抗结核菌感染。然而结核菌具备多种免疫逃避策略，其中最重要的机制之一是结核菌通过分泌系统使其大量蛋白穿过疏水和极低渗透性的菌壁结构，到达宿主细胞吞噬体甚至胞浆中，直接调控宿主的抗结核免疫反应。
3.目前所有临床抗结核药物的作用机制都是靶向结核菌呼吸链等对结核菌体外生长至关重要的关键环节，从而达到对其直接杀伤的作用。正在使用的抗结核病药物分为2类，分别是第一线抗结核病药和第二线抗结核病药。第一线抗结核药：异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素。第二线抗结核药物：对氨水杨酸、乙硫异烟胺、卷曲霉素、利福定等。一个正规用药周期长达6
‑
9个月，正是因为如此才会产生越来越多的耐药结核，临床耐药结核患者也在面临无药可用的困境。如果结核病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。近年来耐药结核逐年增加。2019年，全球已治疗结核患者中有18％(95％ci：9.7％
‑
27％)为耐多药/利福平耐药结核(mdr/rr
‑
tb)，即便是新诊断的tb患者中，也有3.3％(95％ci：2.3％
‑
4.3％)为mdr/rr
‑
tb，使得全球mdr/rr
‑
tb患者数量达到了46.5万(范围：40万
‑
53.5万)。中国是结核病高负担国家，同时也是耐药/耐多药结核病高负担国家。2019年，中国约有6.5万名mdr/rr
‑
tb患者(发病率为4.5/每10万人口)，占全球mdr/rr
‑
tb病例的14％；在rr
‑
tb病例中有74％为mdr
‑
tb。新诊断和已治疗结核病例中，耐药患者比例分别高达7.1％(5.6％
‑
8.7％)和23％(23％
‑
24％)。由于mdr
‑
tb传染性强，治疗成功率相对较低，其及时检测、诊断和治疗对我国国民健康的重要性不言而喻。因此急需寻找新的抗结核药物以及治疗策略和靶点。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中的缺陷，本发明人的研究思路是通过了解结核菌与宿主免疫应答的相互作用机制，寻找结核菌重要的毒力因子，作为新药研发的作用靶点，动员宿主抗结核免疫能力，使得宿主免疫主动清除结核菌。这将为耐药结核患者提供新的治疗方案，为新发结核患者缩短用药时间，具有很高的临床价值。具体地，本发明提供了结核菌urec蛋白在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面是提供结核菌urec蛋白在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用，该药物以结核菌urec蛋白为靶标抑制结核菌urec蛋白的酶活功能或表达。
7.进一步地，上述药物提高了宿主巨噬细胞对结核分枝杆菌清除的免疫应答。
8.本发明的第二方面是提供结核菌urec蛋白在制备治疗结核病药物中的应用，该药物以urec蛋白为靶标抑制urec蛋白的酶活功能或表达。
9.进一步地，上述药物的给药途径为静脉注射、肌肉注射、口服或透皮给药。
10.本发明的第三方面是提供一种筛选抗结核分枝杆菌药物的方法，以结核菌urec蛋白为靶点，筛选出抑制结核菌urec蛋白的酶活功能或表达的化合物即为抗结核分枝杆菌药物的主要活性成分。
11.本发明的第四方面是提供一种筛选治疗结核病药物的方法，以结核菌urec蛋白为靶点，筛选出抑制urec蛋白的酶活功能或表达的化合物即为治疗结核病药物的主要活性成分。
12.进一步地，上述药物的给药途径为静脉注射、肌肉注射、口服或透皮给药。
13.进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
14.进一步地，上述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂或滴剂。
15.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
16.本发明通过实验验证了urec是结核菌重要的毒力因子，决定结核菌在宿主体内的存活，并且证实了抑制urec可以提高宿主抗结核免疫能力，达到对结核菌清除的效果，为开发抗结核分枝杆菌和治疗肺结核的药物提供了新的靶标和方向。
附图说明
17.图1是本发明一实施例中敲除引物设计示意图；
18.图2是本发明一实施例中针对h37rv菌株urec编码基因rv1850设计敲除引物的示意图；
19.图3是本发明一实施例中构建urec编码基因rv1850敲除菌株中所采用的替换序列的示意图；
20.图4显示了本发明一实施例中pcr扩增左右臂的结果，其中，第1列表示左臂dna片段，第2列表示右臂dna片段，m表示dna maker；
21.图5是本发明一实施例中噬菌粒酶切验证电泳的结果图；其中，1
‑
3列表示噬菌粒酶切结果，m表示dna maker；
22.图6是本发明一实施例中基因敲除及验证引物设计示意图；
23.图7是本发明一实施例中pcr验证rv1850基因敲除菌株的结果图；
24.图8是本发明一实施例中利用全长法验证基因敲除的引物设计示意图；
25.图9是本发明一实施例中利用全长法pcr验证rv1850基因敲除菌株的结果图；
26.图10是本发明一实施例中验证urec对结核菌小鼠感染致病力的作用的结果；其中，图a为h37rv及δurec感染小鼠肺部荷菌量检测结果，图b为h37rv及δurec感染小鼠肺脏he和抗酸染色结果；
27.图11是本发明一实施例中h37rv及δurec感染小鼠腹腔巨噬细胞后检测胞内存活情况的统计图；
28.图12是本发明一实施例中h37rv及δurec菌株体外生长曲线。
具体实施方式
29.本发明提供了urec蛋白在制备抗结核分枝杆菌药物和治疗结核病药物中的应用，具体而言，该药物以结核菌urec蛋白为靶标抑制urec蛋白的酶活功能或表达。
30.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
31.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
32.实施例1
33.本实施例利用温敏噬菌体法构建h37rv的urec基因敲除株(h37rvδurec)，具体的构建过程和验证结果如下：
34.1.1基因敲除相关引物设计序列定位
35.如图1，假设浅灰色条带为待敲除的基因(目的基因)，深灰色条带分别为待敲除基因的上下游序列基因片段，称之为左臂(l)和右臂(r)，分别设计引物对lfp/lrp和rfp/rrp，扩增左臂和右臂(约600
‑
1000bp)，其中引物lrp和rfp需包含待敲除基因左端和右端的部分dna序列。在lfp的上游处和rrp的下游处设计验证引物，验证引物(lyzfp/ryzrp)用于后续pcr验证阶段。上述步骤中使用的具体引物的序列如下表1。
36.表1基因敲除相关引物的序列信息
37.[0038][0039]
如图2所示，浅灰底为基因的orf，前后1000bp为上下游序列，方框内为左右臂pcr引物，深灰底背景标注为验证引物序列。构建成功的基因敲除菌株其基因第二个方框到第三个方框间的dna被如图3所示的序列(主要是潮霉素b抗性基因及sacb基因用于后续抗性消除，全长约3.7kb)替换。
[0040]
1.2pcr扩增左右臂
[0041]
使用thermo scientific公司的phusion高保真dna聚合酶扩增mycobacterium tuberculosis h37rv中urec(rv1850)基因左右臂dna片段，分别用引物对lfp/lrp和rfp/rrp，扩增左臂(718)和右臂(657)。
[0042]
左臂dna序列如下：
[0043]
tggcaggatcgcagagcatgcgcctgacgccgcacgaacaggagcgtttgctgttgtcctacgccgccgagttggcccgccggcgtcgggcccgcggcctgcgcctcaatcatccggaagccatcgcggtgatcgccgaccacatcctggaaggcgcgcgtgacggccgcaccgtcgcagagttgatggcatccgggcgtgaggtgctcggccgtgacgatgtgatggagggagtgccggagatgctcgccgaggtacaggtggaggcgacgtttccggacggcaccaagttggtcaccgtgcatcagccgatcgcatgattcccggagaaatcttttacggcagtggtgatatcgagatgaacgccgcggcactctcccgcctgcagatgcggatcatcaacgccggcgatcgtccggtgcaggtcggtagccacgtccatctcccgcaggccaatcgggcgctgtcattcgaccgtgcgacggcccacggctaccgtctggacatcccggcggcgacagcggtgcgcttcgagccgggcattccccaaatcgtcgggttggttccgttgggcggacggcgcgaggtacccggtctgacgctaaatccgcccggacggttggaccgctgatggcgcgactgtcaagggagcgctacgcacagctgtacggacctaccaccggcgaccggatacggctggccgacaccaacctgctgg(seq id no.9)；
[0044]
右臂dna序列如下：
[0045]
gtcaatcccgaccccgcaaccggtgctcccgcgaccgatgttcggcgcggccgcggcaaccgcggcggcgacctcggtgcacttcgtcgcgccgcaatccatcgacgcgcgcctggcggaccggctcgcggtcaatcggggactagcgccggtggccgacgtgcgcgcagtgggcaagaccgacctgccgctcaatgatgccctaccgagcatcgaggtcgatcccgacaccttcaccgtgcgaatcgacggccaggtgtggcaaccgcagccggccgccgaactacctatgacacaacggtatttcctgttctaatgacctcgctggccgtgctgctcaccctcgccgactcgcggctgcccacgggtgcgcacgtgcactcgggcggcatcgaagaagccatcgccgccggcatggtgaccggcctggccaccctggaagcgttcctgaaacggcgggtccgcacccacggcctgctgacggcgtccatcgcggccgcggtgcaccggggcgagctggccgtcgacgacgccgaccgggaaaccgacgcgcgcacaccggctcccgcggccagacacgcctcacgcagccagggccgc
gggctgatcaggctggcacggcgggtgtggcccgattccggctgggaggaactgggc(seq id no.10)。
[0046]
扩增结果如图4所示，由结果可知，目的dna片段扩增成功。
[0047]
1.3构建噬菌粒
[0048]
左右臂pcr产物经bgli酶切后回收并与van91i酶切的质粒p0004s连接并转化e.coli dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆子并测序。将鉴定获得的阳性克隆子进一步经限制性内切酶(paci)酶切并回收，并与同样paci酶切的质粒phae159连接、包装并转化e.coli hb101细胞，筛选获得阳性噬菌粒(phasmid)，paci酶切验证结果如图5所示。
[0049]
1.4构建分枝杆菌噬菌体
[0050]
取适量构建成功的噬菌粒dna电转化感受态mycobacterium smegmatis mc2155细胞，铺板，培养2
‑
3天后观察噬菌斑(空斑)是否形成。筛选噬菌斑，扩增制备高滴度噬菌体。获得的噬菌体侵染mycobacterium smegmatis mc2155所形成的噬菌斑。
[0051]
1.5mycobacterium tuberculosis h37rvδrv1850菌株的构建
[0052]
高滴度噬菌体感染mycobacterium tuberculosis h37rv后，涂布7h10(补加10％oadc 0.5％甘油)固体平板(含75μg/ml潮霉素b)，37℃培养4
‑
5周后，挑取生长出来的单克隆接种7h9(补加10％oadc 0.5％甘油 0.05％tween
‑
80)液体培养基(含75μg/ml潮霉素b)，37℃培养4
‑
5周后，提取基因组，pcr验证基因是否敲除成功。
[0053]
1.6两片段法pcr验证基因敲除菌株
[0054]
如图6所示，基因敲除验证引物在lfp引物匹配序列上游100
‑
200bp处设计上游验证引物(lyzfp)，并在rrp引物匹配序列下游100
‑
200bp处设计下游验证引物(ryzrp)，lyzrp引物设计于sacb基因上，ryzfp引物设计于hyg基因上。在sacb基因内部设计上游引物koyzfp，hyg基因内部设计下游引物koyzrp。
[0055]
如图7所示，pcr验证使用引物对lyzfp/lyzrp和ryzfp/ryzrp并以敲除菌株基因组(mut strain)为模板时均能够扩增出1040bp和1113bp大小的dna片段，而当对照以野生型菌株基因组(wt strain)为模板，pcr使用同样引物对时则无目的dna片段扩增出来。
[0056]
1.7全长法pcr验证基因敲除菌株
[0057]
按照如图8所示的示意图进行设计引物和进行扩增：pcr验证使用引物对lyzfp/ryzrp并以敲除菌株基因组(mut strain)为模板扩增时能够得到5465bp大小的dna片段，而同时以野生型菌株基因组(wt strain)模板作为对照时，pcr扩增得到3112bp大小的dna片段。结果如图9所示，mycobacterium tuberculosis h37rv菌株中rv1850基因成功敲除，获得mycobacterium tuberculosis h37rvδrv1850菌株。
[0058]
实施例2
[0059]
本实施例验证urec对结核菌小鼠感染致病力的作用，具体的操作步骤和结果如下：
[0060]
将6
‑
8周雌性c57bl/6小鼠进入absl
‑
3适应1周后，分别以相同剂量滴鼻感染h37rv及urec基因敲除株，8周后处死。通过检测以下指标，明确urec对mtb小鼠感染致病力的作用：
[0061]
1.不同脏器荷菌量：c57bl/6小鼠经滴鼻途径分别感染2个菌株4周后(约1
×
105cfu/只小鼠)，处死小鼠，无菌条件下收集肺组织，加入pbs匀浆，10倍稀释后接种于7h10琼脂培养基上，37℃培养4周，观察不同菌株生长情况，计算活菌cfu数，统计肺组织的荷菌
量。如图10a所示，结果发现感染h37rv后小鼠肺组织荷菌量log10为5.83，而urec敲除菌(δurec)小鼠的肺组织荷菌量log10为0.65，相差5个数量级以上。
[0062]
2.肺部组织病理学检测：c57bl/6小鼠经滴鼻途径感染后，处死小鼠，无菌条件下收集肺脏，肉眼观察病变范围，并记录病变情况。之后将肺组织用4％多聚甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片，h&e及抗酸染色，显微镜观察肺部组织病理学变化，如图10b所示，结果发现感染δurec小鼠的肺组织与感染对照菌株的小鼠相比，免疫细胞浸润和肺组织损伤也明显减少。
[0063]
上述结果表明，urec是结核菌重要的致病毒力因子。
[0064]
实施例3
[0065]
本实施例在获得结核菌urec基因敲除株的基础上，通过原代巨噬细胞体外感染结核菌实验，明确urec对结核菌胞内存活的影响，具体的实验步骤和结果如下：
[0066]
1.分离小鼠腹腔巨噬细胞：给予6
‑
8周spf级c57bl/6小鼠腹腔注射肉汤培养基，48小时后颈部脱臼处死小鼠。利用10ml注射器向小鼠腹腔注射10ml全无1640培养基后回吸，提取小鼠腹腔原代巨噬细胞，铺于12孔板内，待进行cfu分析实验。
[0067]
2.cfu分析实验：用野生型h37rv及urec敲除菌株感染铺于12孔板内的小鼠腹腔原代巨噬细胞，moi＝5。于感染3小时及24小时两个时间点，分别用含有0.1％的triton 100的无菌pbs溶液裂解巨噬细胞。然后对含有菌的裂解液进行10倍稀释后接种于7h10琼脂培养基上，37℃培养4周，观察不同菌株生长情况，计算活菌cfu数，结果如图11。
[0068]
结果显示，巨噬细胞感染h37rv及δurec后3小时，两组的荷菌量巨噬细胞的进入量没有显著差异。感染24小时后，h37rv在巨噬细胞内的存活略微下降，然而δurec已经完全被巨噬细胞清除。以上数据提示urec是结核菌在宿主巨噬细胞内存活的重要毒力因子。
[0069]
实施例4
[0070]
本实施例体外培养结核菌对照菌株和urec基因敲除菌株，绘制体外生长曲线，确认urec基因对结核菌体外生长的功能影响，具体的实验步骤和结果如下：
[0071]
应用bioscreen全自动生长曲线分析仪，将h37rv或h37rvδurec菌株稀释至一定浓度加入检测板中，设3复孔对照，37℃培养两周，每2h检测一次od590，绘制生长曲线(如图12)，分析野生型及urec基因敲除菌株在有氧培养条件下的生长活性差异。
[0072]
结果发现urec基因敲除株在正常有氧培养条件下的urec对结核菌的体外生长几乎没有显著的影响。结合之前的urec敲除菌在巨噬细胞及小鼠肺组织内存活能力显著下降的表型，排除是由于urec对结核菌自身生长功能的影响，提示urec可能抑制了宿主巨噬细胞对结核菌清除的免疫应答，使结核菌免疫逃逸。
[0073]
因此，靶向结核菌urec设计或筛选小分子抑制剂可能并不会抑制结核菌的生长繁殖速度，但是可以解除urec对宿主的免疫抑制功能，提高宿主的抗结核免疫应答，达到清除结核菌的目的。而且考虑到靶向结核菌urec设计抗结核药物的思路，明显区别于传统抗结核药直接杀伤结核菌的机制，降低耐药菌的产生可能性。
[0074]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。