负载mir
‑
375及ptx的四向接头rna纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属肿瘤靶向治疗领域，涉及用于肿瘤靶向治疗的rna纳米药物，具体涉及一种负载mir
‑
375及ptx的四向接头rna纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx及其制备方法和应用。
背景技术：
2.我国食管癌发病率、死亡率居全球首位，治疗仍以手术及传统的放化疗为主，其中化疗药物的应用在晚期食管癌治疗中仍是最为重要的治疗手段之一，但化疗药物治疗靶向性的缺乏及其严重毒副反应极大地限制了其治疗效果。寻求新的靶向治疗策略以提升疗效是当前食管癌研究的重点和难点。随着纳米科技的发展，纳米药物的开发成为肿瘤靶向治疗研究的热点。纳米药物须兼备实体瘤的高通透性和滞留效应(epr效应)介导的被动靶向效应及各种修饰介导的主动靶向效应以发挥其高效的抗肿瘤作用。目前临床常用的白蛋白以及脂质体纳米药物仅能通过其介导的被动靶向效应发挥作用，虽有所提高常规化疗药物的抗肿瘤效果，但与大多纳米载体一样，存在显著的非靶器官分布效应，药物靶向递送效率仍偏低。
技术实现要素：
3.本发明的第一个目的在于提供一种携带mir
‑
375及ptx的四向接头的rna 纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx；
4.本发明的第二个目的在于提供4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx的制备方法；本发明的第三个目的在于提供纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx在食管鳞癌治疗方面的应用。
5.本发明的技术解决方案是：一种负载mir
‑
375及ptx的四向接头rna纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，该纳米药物以四向接头rna纳米4wj为核心，负载了具有显著食管鳞癌细胞抑制作用的mir
‑
375及ptx。
6.更进一步的是，以该rna纳米药物为核心，制备靶向修饰的其它纳米药物体系。
7.更进一步的是，以该rna纳米药物为核心，制备负载其它治疗性制剂的纳米药物体系。
8.其中，该rna纳米药物的制备方法包括以下步骤：
9.(1)rna寡核苷酸合成：合成寡核苷酸rg、rg、rc、ru、2’f rc2’f ru 磷酰胺单体、2’o
‑
propargyl rc以及ru磷酰胺单体，将其通过脱盐柱进行脱盐处理后通过凝胶电泳进行分析纯化；
10.(2)ptx
‑
叠氮化合物合成：ptx、6
‑
叠氮己酸，n、n
′‑
二环己基碳二亚胺和 4
‑
(二甲氨基)吡啶以1:2:2:1摩尔比浓度加入10ml二氯甲烷中；混合溶液室温搅拌过夜16h，通过过滤和旋转蒸发得到粗产品；粗产品通过硅胶柱层析，由己烷：乙酸乙酯(5：5)洗脱液下来并随后旋转蒸发得最终ptx
‑
叠氮化合物产品；
11.(3)rna寡核苷酸
‑
ptx复合物合成：rna寡核苷酸
‑
6炔烃(2mm)与ptx
‑
n3(50 mm)按
体积比(5:2)充分混合在二甲亚砜/叔丁醇(体积比3:1)中，然后加入硫酸铜/三[(1
‑
苄基
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑
‑4‑
基)甲基]胺(tbta)和抗坏血酸钠(rna： ptx：cu 摩尔浓度比为1:15:20)，混合溶液在4℃下振荡16h；反应结束后，往混合溶液中加入1/10体积的0.3m的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇沉淀rna 寡核苷酸；rna寡核苷酸
‑
紫杉醇复合物纯度通过16％(w/v)8m尿素聚丙烯酰胺凝胶(page)；凝胶电泳使用tbe缓冲液(89mm三碱基硼酸盐，2mm edta)；
[0012]
(4)rna纳米药物的组装：
[0013]
4wja:5
′
^
‑
uua gg^u aaa g^cc acc ugc agg ugc uac^cga ug^u aau u^ca a
‑3′
；
[0014]
4wjb:5'^
‑
uug aa^u uac a^uc ggu agc acg ggc ugu g^cg agg^cug aa^c ag
‑
3'；
[0015]
4wjb
‑
mir375:5'^
‑
uug aa^u uac a^uc ggu agc acg ggc ugu g^cg agg^cug aa^c ag gcg acg agc ccc ucg cac aaa cc
‑
3'；
[0016]
4wjc:5
′
^
‑
cug uu^c agc c^uc gca cag cca gca^cgc ac^c uga a^ua ggu
‑3’
；
[0017]
4wjd:5’^
‑
ccu au^u cag g^ug cgu gcu ggg cug cag g^ug gcu u^ua cc^u aa
ꢀ‑3′
[0018]
mir375:5'
‑
uuu guu cgu ucg gcu cgc gug a
‑
3'
[0019]
^代表连接紫杉醇得位置；小写字母代表2’f修饰得碱基单体；将上述寡核苷酸链以相同摩尔浓度在tes缓冲液中混合(50mm tris ph＝8.0，50mm nacl，1mmedta)，在90℃下变性10min，并逐渐冷却至4℃；纳米颗粒组装效率和纯度通过12％(w/v)的非变性凝胶电泳验证；凝胶电泳环境使用1
ⅹ
tbe缓冲液(89 mm tris碱、200mm硼酸和2mm edta)。
[0020]
其中，该rna纳米药物应用于食管鳞癌治疗中。
[0021]
本发明的优点是：以较强酶热稳定性及低脱靶效应的新型四向接头rna纳米载体4wj为核心，构建了同时负载显著抑制食管鳞癌的核酸制剂mir
‑
375及化学药物ptx的纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，以期通过4wj载体介导分子药物 (mir
‑
375)和化疗药物(ptx)的协同作用，实现更为有效的食管鳞癌治疗效果，前期数据证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较ptx及4wj
‑
mir
‑
375更好的食管鳞癌抑制效果。
附图说明
[0022]
图1为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx的粒径及表面zeta电位鉴定；其中：a，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx的结构示意图；b,粒度仪检测其粒径分布约10nm；c，表面电势约
‑
15mv；
[0023]
图2为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx酶、热稳定性分析；其中：a， 4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较强的酶稳定性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较好的热稳定性；
[0024]
图3为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体外抑制食管鳞癌细胞增殖能力分析；其中：a，实时无标记细胞分析系统证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx有效抑制食管鳞癌细胞 kyse
‑
150的增殖活性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx有效抑制kyse
‑
150细胞的克隆形成能力；
[0025]
图4为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体内抗食管鳞癌效果分析；其中：a，各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；b，活体成像比较各组肿瘤大小。
1000mg/ml)于37℃条件下分别处理不同时间(0.5,1，2，4，8，10,12， 24，48h)或将预组装的纳米载体(终浓度1mm)分别与含质量浓度50％胎牛血清的细胞培养基在37℃条件下孵育不同时间(0.5,1，2，4，8，10,12，24， 48h)，然后通过质量浓度3％琼脂糖凝胶电泳观察纳米载体的完整性，使用imagej 进行定量分析，计算不同时间点完整纳米载体的百分比(某时间点的条带强度/ 未处理条带强度)。
[0042]
(3)热稳定性分析：将4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx等载体分别于4℃、37℃以及55℃条件下放置不同时间(0.5，1，2，4，8，10，12，24，48h)后，然后通过质量浓度3％琼脂糖电泳以及eb染色观察纳米载体完整性。
[0043]
如图2所示，纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx酶、热稳定性分析；其中：a， 4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较强的酶稳定性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较好的热稳定性。
[0044]
3、纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx对食管鳞癌细胞抑制作用检测
[0045]
(1)对食管鳞癌细胞增殖能力影响：将kyse
‑
150细胞培养于24孔细胞培养板中，24h后分别加入pbs，4wj，ptx，4wj
‑
mir
‑
375，4wj
‑
ptx以及 4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，实时无标记细胞分析系统记录细胞生长情况。
[0046]
(2)对食管鳞癌细胞3d克隆形成能力影响：将pbs，4wj，ptx，4wj
‑
mir
‑
375，4wj
‑
ptx以及4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，分别处理kyse
‑
150肿瘤微球，每5天观察并记录微球生长情况。
[0047]
如图3所示，纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体外抑制食管鳞癌细胞增殖能力分析；其中：a，实时无标记细胞分析系统证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx可有效抑制食管鳞癌细胞kyse
‑
150的增殖活性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx可有效抑制kyse
‑
150细胞的克隆形成能力。
[0048]
4、纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体内抗食管鳞癌能力检测
[0049]
(1)食管鳞癌细胞皮下荷瘤模型的建立：将表达荧光素酶报告基因的kyse
‑
150 细胞(5
ⅹ
106/50ml)接种于balb/c裸鼠皮下，肿瘤长至约100mm3时随机分组并给予后续药物处理；
[0050]
(2)药物处理方案：将皮下荷瘤以及肺转移模型小鼠分别随机分组，然后分别静脉注射pbs、4wj，ptx，4wj
‑
egfrapt、4wj
‑
mir
‑
375，4wj
‑
egfrapt
‑
mir
‑
375，4wj
‑
ptx，4wj
‑
egfrapt
‑
ptx，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx以及4wj
‑
egfrapt
‑
mir
‑
375
‑
ptx，每7天处理1次，共处理5次。
[0051]
如图4所示，纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体内抗食管鳞癌效果分析；其中： a，各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；b，活体成像比较各组肿瘤大小。
[0052]
结果显示：我们制备获得了粒径约10nm、表面zeta电位约
‑
15mv的rna 纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx；纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较强的酶、热稳定性，可有效抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成能力，小鼠食管鳞癌异种移植模型证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较ptx、4wj
‑
ptx以及4wj
‑
mir
‑
375更好的抑瘤效果，具有较好临床转化应用前景。
‑
375及ptx的四向接头rna纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属肿瘤靶向治疗领域，涉及用于肿瘤靶向治疗的rna纳米药物，具体涉及一种负载mir
‑
375及ptx的四向接头rna纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx及其制备方法和应用。
背景技术：
2.我国食管癌发病率、死亡率居全球首位，治疗仍以手术及传统的放化疗为主，其中化疗药物的应用在晚期食管癌治疗中仍是最为重要的治疗手段之一，但化疗药物治疗靶向性的缺乏及其严重毒副反应极大地限制了其治疗效果。寻求新的靶向治疗策略以提升疗效是当前食管癌研究的重点和难点。随着纳米科技的发展，纳米药物的开发成为肿瘤靶向治疗研究的热点。纳米药物须兼备实体瘤的高通透性和滞留效应(epr效应)介导的被动靶向效应及各种修饰介导的主动靶向效应以发挥其高效的抗肿瘤作用。目前临床常用的白蛋白以及脂质体纳米药物仅能通过其介导的被动靶向效应发挥作用，虽有所提高常规化疗药物的抗肿瘤效果，但与大多纳米载体一样，存在显著的非靶器官分布效应，药物靶向递送效率仍偏低。
技术实现要素：
3.本发明的第一个目的在于提供一种携带mir
‑
375及ptx的四向接头的rna 纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx；
4.本发明的第二个目的在于提供4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx的制备方法；本发明的第三个目的在于提供纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
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ptx在食管鳞癌治疗方面的应用。
5.本发明的技术解决方案是：一种负载mir
‑
375及ptx的四向接头rna纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，该纳米药物以四向接头rna纳米4wj为核心，负载了具有显著食管鳞癌细胞抑制作用的mir
‑
375及ptx。
6.更进一步的是，以该rna纳米药物为核心，制备靶向修饰的其它纳米药物体系。
7.更进一步的是，以该rna纳米药物为核心，制备负载其它治疗性制剂的纳米药物体系。
8.其中，该rna纳米药物的制备方法包括以下步骤：
9.(1)rna寡核苷酸合成：合成寡核苷酸rg、rg、rc、ru、2’f rc2’f ru 磷酰胺单体、2’o
‑
propargyl rc以及ru磷酰胺单体，将其通过脱盐柱进行脱盐处理后通过凝胶电泳进行分析纯化；
10.(2)ptx
‑
叠氮化合物合成：ptx、6
‑
叠氮己酸，n、n
′‑
二环己基碳二亚胺和 4
‑
(二甲氨基)吡啶以1:2:2:1摩尔比浓度加入10ml二氯甲烷中；混合溶液室温搅拌过夜16h，通过过滤和旋转蒸发得到粗产品；粗产品通过硅胶柱层析，由己烷：乙酸乙酯(5：5)洗脱液下来并随后旋转蒸发得最终ptx
‑
叠氮化合物产品；
11.(3)rna寡核苷酸
‑
ptx复合物合成：rna寡核苷酸
‑
6炔烃(2mm)与ptx
‑
n3(50 mm)按
体积比(5:2)充分混合在二甲亚砜/叔丁醇(体积比3:1)中，然后加入硫酸铜/三[(1
‑
苄基
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑
‑4‑
基)甲基]胺(tbta)和抗坏血酸钠(rna： ptx：cu 摩尔浓度比为1:15:20)，混合溶液在4℃下振荡16h；反应结束后，往混合溶液中加入1/10体积的0.3m的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇沉淀rna 寡核苷酸；rna寡核苷酸
‑
紫杉醇复合物纯度通过16％(w/v)8m尿素聚丙烯酰胺凝胶(page)；凝胶电泳使用tbe缓冲液(89mm三碱基硼酸盐，2mm edta)；
[0012]
(4)rna纳米药物的组装：
[0013]
4wja:5
′
^
‑
uua gg^u aaa g^cc acc ugc agg ugc uac^cga ug^u aau u^ca a
‑3′
；
[0014]
4wjb:5'^
‑
uug aa^u uac a^uc ggu agc acg ggc ugu g^cg agg^cug aa^c ag
‑
3'；
[0015]
4wjb
‑
mir375:5'^
‑
uug aa^u uac a^uc ggu agc acg ggc ugu g^cg agg^cug aa^c ag gcg acg agc ccc ucg cac aaa cc
‑
3'；
[0016]
4wjc:5
′
^
‑
cug uu^c agc c^uc gca cag cca gca^cgc ac^c uga a^ua ggu
‑3’
；
[0017]
4wjd:5’^
‑
ccu au^u cag g^ug cgu gcu ggg cug cag g^ug gcu u^ua cc^u aa
ꢀ‑3′
[0018]
mir375:5'
‑
uuu guu cgu ucg gcu cgc gug a
‑
3'
[0019]
^代表连接紫杉醇得位置；小写字母代表2’f修饰得碱基单体；将上述寡核苷酸链以相同摩尔浓度在tes缓冲液中混合(50mm tris ph＝8.0，50mm nacl，1mmedta)，在90℃下变性10min，并逐渐冷却至4℃；纳米颗粒组装效率和纯度通过12％(w/v)的非变性凝胶电泳验证；凝胶电泳环境使用1
ⅹ
tbe缓冲液(89 mm tris碱、200mm硼酸和2mm edta)。
[0020]
其中，该rna纳米药物应用于食管鳞癌治疗中。
[0021]
本发明的优点是：以较强酶热稳定性及低脱靶效应的新型四向接头rna纳米载体4wj为核心，构建了同时负载显著抑制食管鳞癌的核酸制剂mir
‑
375及化学药物ptx的纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，以期通过4wj载体介导分子药物 (mir
‑
375)和化疗药物(ptx)的协同作用，实现更为有效的食管鳞癌治疗效果，前期数据证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较ptx及4wj
‑
mir
‑
375更好的食管鳞癌抑制效果。
附图说明
[0022]
图1为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx的粒径及表面zeta电位鉴定；其中：a，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx的结构示意图；b,粒度仪检测其粒径分布约10nm；c，表面电势约
‑
15mv；
[0023]
图2为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx酶、热稳定性分析；其中：a， 4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较强的酶稳定性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较好的热稳定性；
[0024]
图3为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体外抑制食管鳞癌细胞增殖能力分析；其中：a，实时无标记细胞分析系统证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx有效抑制食管鳞癌细胞 kyse
‑
150的增殖活性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx有效抑制kyse
‑
150细胞的克隆形成能力；
[0025]
图4为纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体内抗食管鳞癌效果分析；其中：a，各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；b，活体成像比较各组肿瘤大小。
1000mg/ml)于37℃条件下分别处理不同时间(0.5,1，2，4，8，10,12， 24，48h)或将预组装的纳米载体(终浓度1mm)分别与含质量浓度50％胎牛血清的细胞培养基在37℃条件下孵育不同时间(0.5,1，2，4，8，10,12，24， 48h)，然后通过质量浓度3％琼脂糖凝胶电泳观察纳米载体的完整性，使用imagej 进行定量分析，计算不同时间点完整纳米载体的百分比(某时间点的条带强度/ 未处理条带强度)。
[0042]
(3)热稳定性分析：将4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx等载体分别于4℃、37℃以及55℃条件下放置不同时间(0.5，1，2，4，8，10，12，24，48h)后，然后通过质量浓度3％琼脂糖电泳以及eb染色观察纳米载体完整性。
[0043]
如图2所示，纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx酶、热稳定性分析；其中：a， 4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较强的酶稳定性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx具有较好的热稳定性。
[0044]
3、纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx对食管鳞癌细胞抑制作用检测
[0045]
(1)对食管鳞癌细胞增殖能力影响：将kyse
‑
150细胞培养于24孔细胞培养板中，24h后分别加入pbs，4wj，ptx，4wj
‑
mir
‑
375，4wj
‑
ptx以及 4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，实时无标记细胞分析系统记录细胞生长情况。
[0046]
(2)对食管鳞癌细胞3d克隆形成能力影响：将pbs，4wj，ptx，4wj
‑
mir
‑
375，4wj
‑
ptx以及4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx，分别处理kyse
‑
150肿瘤微球，每5天观察并记录微球生长情况。
[0047]
如图3所示，纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体外抑制食管鳞癌细胞增殖能力分析；其中：a，实时无标记细胞分析系统证实4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx可有效抑制食管鳞癌细胞kyse
‑
150的增殖活性；b，4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx可有效抑制kyse
‑
150细胞的克隆形成能力。
[0048]
4、纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体内抗食管鳞癌能力检测
[0049]
(1)食管鳞癌细胞皮下荷瘤模型的建立：将表达荧光素酶报告基因的kyse
‑
150 细胞(5
ⅹ
106/50ml)接种于balb/c裸鼠皮下，肿瘤长至约100mm3时随机分组并给予后续药物处理；
[0050]
(2)药物处理方案：将皮下荷瘤以及肺转移模型小鼠分别随机分组，然后分别静脉注射pbs、4wj，ptx，4wj
‑
egfrapt、4wj
‑
mir
‑
375，4wj
‑
egfrapt
‑
mir
‑
375，4wj
‑
ptx，4wj
‑
egfrapt
‑
ptx，4wj
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mir
‑
375
‑
ptx以及4wj
‑
egfrapt
‑
mir
‑
375
‑
ptx，每7天处理1次，共处理5次。
[0051]
如图4所示，纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
‑
ptx体内抗食管鳞癌效果分析；其中： a，各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；b，活体成像比较各组肿瘤大小。
[0052]
结果显示：我们制备获得了粒径约10nm、表面zeta电位约
‑
15mv的rna 纳米药物4wj
‑
mir
‑
375
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ptx；纳米药物4wj
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mir
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ptx具有较强的酶、热稳定性，可有效抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成能力，小鼠食管鳞癌异种移植模型证实4wj
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mir
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ptx具有较ptx、4wj
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ptx以及4wj
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375更好的抑瘤效果，具有较好临床转化应用前景。
再多了解一些
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