一种细胞内聚合抑制细胞活性的方法及实现该方法的前体药物与流程

1.本发明涉及药物技术领域，特别涉及一种抑制细胞活性的方法及实现该方法的前体药物，具体地说，是涉及一种通过在细胞内原位合成线性高分子聚合物对细胞造成毒性，从而抑制细胞活性及实现该方法的前体药物。


背景技术：

2.前体药物，即可以通过酶或化学刺激在生物体内原位激活(生成高活性药物分子)的低活性物质，通过对药物分子的针对性修饰，能够显著改善许多传统药物的水溶性，化学/生物稳定性、口服吸收效率、体内循环时间、全身毒性等诸多临床上出现的问题。目前市场上所有药物中的5-7％可以被认定为前体药物，并且此比例目前仍保持着增长的趋势，可见其在医药发展及应用中具有重要地位。
3.目前许多前体药物分子被研发出来并用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤治疗当中，其中大部分前体药物分子都是通过对已知活性药物分子的活性位点进行特异性修饰实现的，而通过其他机理原位生成大分子药物的实例却较少，利用在细胞内原位生成高分子聚合物结构来实现细胞活性抑制的前体药物暂时还没有相关报道。
4.研究发现通过自由基聚合在细胞内生成的高分子聚合物能够显著改变如细胞骨架生长、粘度和细胞结构等，并且能够影响细胞周期等生理性质。目前普遍认为高分子量聚合物相比于小分子具有更高的生物相容性，这是由于高分子量聚合物分子难以直接被细胞摄取，且分子量越大摄取效率越低，因此要通过聚合物实现对细胞的影响就需要在细胞内原位合成聚合物分子，但是到目前为止是否可以通过细胞内聚合对细胞产生毒性尚无相关报道。
5.由于自由基类反应本身的高活性，在细胞内所产生的聚合物分子量较小且分子量分布较宽，对细胞结构及功能所产生的影响较小，因此造成的细胞毒性也较低，而新型光控可逆加成断裂链转移(raft)聚合由于其独特的聚合反应机理，使其具有更强的时间/空间可控性、更稳定的活性中间体，因此可以在相对复杂的反应体系中可控的实现较高分子量聚合物的合成。同时由于所采用的raft聚合的引发效率显著高于传统自由基聚合，因此可以在保证生成聚合物分子的同时大幅减少单体及引发剂的用量，降低由于分子扩散对周围的其他细胞产生的毒性。
6.为了增加药物选择性，降低对于健康细胞和组织的伤害，通常会将刺激响应能力引入体系中，使细胞毒性仅在指定时间及位置产生。其中以光作为刺激信号的体系具有更高的时间/空间可调控性，能够主动控制药物激活，从而实现对生物体的无创治疗。通过光能引发实现的raft聚合反应具有反应条件温和、副反应少以及聚合反应效率高等特点，且可以在水相、有氧及多种生物分子存在的条件下在指定区域精准实现高效聚合反应，并且聚合反应本身对细胞影响较小，不容易由于反应物扩散引发全身毒性，因此适合用于在细胞内原位合成高分子聚合物并实现对细胞活性的抑制。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种基于原位光控raft聚合的前体药物及其制备方法，所述前体药物在光照条件下能够合成较高毒性的高分子聚合物，从而抑制细胞活性。
8.本发明公开了一种抑制细胞活性的方法及实现该方法的前体药物，本发明中的前体药物包括：n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)以及曙红y。把上述前体药物与细胞共同孵育，并以光照引发细胞内的聚合反应实现细胞内高分子聚合物的原位合成。细胞内原位合成的高分子聚合物能够有效抑制细胞活性，诱发细胞凋亡及自噬。
9.一种细胞内聚合抑制细胞活性的前体药物，包括n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y。
10.其中，n,n-二甲基丙烯酰胺作为单体，2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸为链转移剂，曙红y为光引发剂。
11.为了保证聚合反应效率及聚合物的生成量，单体n,n-二甲基丙烯酰胺的用量控制在毒性允许的最大剂量5mm；
12.聚合物分子量通过调控2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸及曙红y的用量来实现。2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸与曙红y的摩尔比为10：1；n,n-二甲基丙烯酰胺与2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸的摩尔比为(50-500)：1。
13.一种抑制细胞活性的高分子聚合物，由如下方法制备：
14.(1)将前体药物与细胞共同孵育，使细胞摄取所述前体药物，前体药物包括n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y；
15.(2)以光作为刺激信号，通过光照实现细胞内聚合反应。以光作为刺激信号，具有更高的时间/空间可调控性，能够主动控制药物激活，从而实现对生物体的无创治疗。
16.进一步的，所述步骤(1)中活细胞接种在细胞培养板中进行孵育，n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y按比例溶解于细胞培养基中，并加入清洗过的所述活细胞进行孵育；所述步骤(2)中用所述步骤(1)获得的细胞，加入细胞培养基，光照实现聚合反应。
17.为了保证聚合反应效率及聚合物的生成量，单体n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)的用量控制在毒性允许的最大剂量5mm；
18.聚合物分子量通过调控2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)及曙红y的用量来实现。2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸与曙红y的摩尔比为10：1；n,n-二甲基丙烯酰胺与2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸的摩尔比为(50-500)：1。
19.进一步的，所述步骤(2)中光源的最大激发波长为470nm，蓝光照射对细胞损伤较小。
20.所述的抑制细胞活性的高分子聚合物，具有如下结构：
21.该化合物是具有较高毒性的高分子聚合物。
22.进一步的，所述步骤(1)中活细胞以2x 105的密度接种于细胞培养板中，并在37
℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y按比例溶解于细胞培养基中，并按每孔2ml的用量加入用pbs清洗过的细胞，37℃恒温孵育4h；所述步骤(2)中用pbs清洗所述步骤(1)获得的细胞，并于每孔加入1ml新鲜细胞培养基，从培养板下方用光源垂直照射10min实现聚合反应。
23.一种抑制细胞活性的高分子聚合物的制备方法，包括如下步骤：
24.(1)将前体药物与细胞共同孵育，使细胞摄取所述前体药物，前体药物包括n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y；
25.(2)以光作为刺激信号，通过光照实现细胞内聚合反应。以光作为刺激信号，具有更高的时间/空间可调控性，能够主动控制药物激活，从而实现对生物体的无创治疗。
26.进一步的，所述步骤(1)中活细胞接种在细胞培养板中进行孵育，n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y按比例溶解于细胞培养基中，并加入清洗过的所述活细胞进行孵育；所述步骤(2)中用所述步骤(1)获得的细胞，加入细胞培养基，光照实现聚合反应。
27.为了保证聚合反应效率及聚合物的生成量，单体n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)的用量控制在毒性允许的最大剂量5mm；
28.聚合物分子量通过调控2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)及曙红y的用量来实现。2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸与曙红y的摩尔比为10：1；n,n-二甲基丙烯酰胺与2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸的摩尔比为(50-500)：1。
29.进一步的，所述步骤(2)中光源的最大激发波长为470nm，蓝光照射对细胞损伤较小。
30.进一步的，所述步骤(1)中活细胞以2x 105的密度接种于细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y按比例溶解于细胞培养基中，并按每孔2ml的用量加入用pbs清洗过的细胞，37℃恒温孵育4h；所述步骤(2)中用pbs清洗所述步骤(1)获得的细胞，并于每孔加入1ml新鲜细胞培养基，从培养板下方用光源垂直照射10min实现聚合反应。
31.一种细胞内聚合抑制细胞活性的方法，包括如下步骤：
32.(1)将前体药物与细胞共同孵育，使细胞摄取所述前体药物，前体药物包括n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y；
33.(2)以光作为刺激信号，通过光照实现细胞内聚合反应。以光作为刺激信号，具有更高的时间/空间可调控性，能够主动控制药物激活，从而实现对生物体的无创治疗。
34.进一步的，所述步骤(1)中活细胞接种在细胞培养板中进行孵育，n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y按比例溶解于细胞培养基中，并加入清洗过的所述活细胞进行孵育；所述步骤(2)中用所述步骤(1)获得的细胞，加入细胞培养基，光照实现聚合反应。
35.为了保证聚合反应效率及聚合物的生成量，单体n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)的用量控制在毒性允许的最大剂量5mm；
36.聚合物分子量通过调控2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)及曙红y的用量来实现。2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸与曙红y的摩尔比为10：1；n,n-二甲基丙烯酰胺与2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸的摩尔比为(50-500)：1。
37.进一步的，所述步骤(2)中光源的最大激发波长为470nm，蓝光照射对细胞损伤较小。
38.进一步的，所述步骤(1)中活细胞以2x 105的密度接种于细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；n,n-二甲基丙烯酰胺、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸、曙红y按比例溶解于细胞培养基中，并按每孔2ml的用量加入用pbs清洗过的细胞，37℃恒温孵育4h；所述步骤(2)中用pbs清洗所述步骤(1)获得的细胞，并于每孔加入1ml新鲜细胞培养基，从培养板下方用光源垂直照射10min实现聚合反应。
39.所述的前体药物在抑制细胞活性方面的应用，所述细胞包括hela、1205lu、a375细胞系。
40.所述的前体药物在诱发细胞凋亡及细胞自噬方面的应用。
41.所述的前体药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
42.所述的高分子聚合物在诱发细胞凋亡及细胞自噬方面的应用。
43.所述的高分子聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
44.综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
45.1.本发明首次实现了细胞内可控raft聚合物的构建。
46.2.本发明的前体药物在细胞内原位合成raft聚合物，该高分子聚合物对细胞有直接毒性，能够降低细胞活性。
47.3.相比传统的抑制细胞活性的前体药物，本发明通过新型前体药物在细胞内合成高分子聚合物的机理实现了对细胞活性的抑制，对细胞耐药性提供了一种新的思路。
48.4.本发明所应用的单体、链转移剂以及光敏剂毒性均较低，因此在使用该前体药物时不会因前体药物的扩散造成全身毒性。
49.5.本发明通过光刺激引发聚合反应，在时间/空间层面实现了针对前体药物合成毒性高分子聚合物的高度可控性以及选择性。
附图说明
50.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
51.图1为前体药物在细胞内聚合反应示意图。
52.图2为470nm光照不同时间对hela细胞活性产生的影响(测试结果通过cck-8测试得到，n＝6)，ns：不显著，**：p<0.05。
53.图3为5mm n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)与不同浓度2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)及曙红y溶液(raftcta与曙红y的摩尔比为10：1，raftcta浓度为0.1，0.05和0.01mm)加入hela细胞后，光照10min/不光照后37℃孵育24小时后细胞活性的变化(测试结果通过cck-8测试得到，n＝6)，ns：不显著，****：p<0.0001。
54.图4为小鼠肿瘤生长曲线，其中470nm光照时间为10min，前体药物中含有5mm dma、0.05mm raftcta及0.005mm曙红y，给药剂量为5000μl/kg。
55.图5为给药14天后(与图4中肿瘤生长曲线中第14天相对应)处死小鼠取出的肿瘤
照片，每个肿瘤均取自不同小鼠。
56.图6为5mm dma与不同浓度raftcta及曙红y溶液(raftcta与曙红y的摩尔比为10：1，raftcta浓度为0.1，0.05和0.01mm)加入a375细胞后，光照10min/不光照后37℃孵育24小时后细胞活性的变化(测试结果通过cck-8测试得到，n＝6)，ns：不显著，****：p<0.0001。
57.图7为5mm dma与不同浓度raftcta及曙红y溶液(raftcta与曙红y的摩尔比为10：1，raftcta浓度为0.1，0.05和0.01mm)加入1205lu细胞后，光照10min/不光照后37℃孵育24小时后细胞活性的变化(测试结果通过cck-8测试得到，n＝6)，ns：不显著，***：p<0.001，****：p<0.0001。
58.图8为模拟前体药物细胞内聚合得到的poly(dma)聚合物溶解于氘代氯仿后测得的1hnmr图谱。
59.图9为模拟前体药物细胞内聚合得到的poly(dma)聚合物溶解于dmf后测得的gpc图谱。
具体实施方式
60.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
61.本发明的方法能够抑制细胞活性的原理
62.本发明所述抑制细胞活性的方法能够有效在细胞内部生成丙烯酰胺类高分子聚合物，由于此类聚合物特殊的线性链状结构，使其能与细胞内多种生物分子发生非特异性的如物理吸附、非共价键形式等相互作用，因此能通过抑制pi3k/akt/mtor及ampk信号通路，诱导细胞自噬并抑制细胞增殖，并通过激活内质网应激反应、线粒体外膜的透化，诱导细胞凋亡及程序性坏死等多种类型细胞死亡方式，达到抑制细胞活性的效果，而且这种效果对细胞具有普遍效果，并非只针对某一种细胞有效。
63.一种细胞内聚合抑制细胞活性的方法，主要包括如下步骤：
64.(1)将前体药物与细胞共同孵育，使细胞摄取所述前体药物，前体药物包括n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)、2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)、光引发剂曙红y；
65.活细胞以1x 104每孔的密度接种于96孔细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h以保证细胞贴壁；dma、raftcta以及光引发剂曙红y按比例溶解于高糖dmem细胞培养基中(含有10％小牛血清、100uni/ml的青霉素和链霉素)，并按每孔0.1ml的用量加入用pbs清洗过的(3次)细胞，37℃恒温孵育4h，实现细胞对前体药物的摄取。
66.其中，为了保证聚合反应效率及聚合物的生成量，单体n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)的用量控制在毒性允许的最大剂量5mm；
67.聚合物分子量通过调控2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)及曙红y的用量来实现。2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸与曙红y的摩尔比为10：1；n,n-二甲基丙烯酰胺与2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸的摩尔比为(50-500)：1。
68.(2)以光作为刺激信号，通过光照实现细胞内聚合反应。以光作为刺激信号，具有
更高的时间/空间可调控性，能够主动控制药物激活，从而实现对生物体的无创治疗。比如可以针对肿瘤区域照射，使聚合仅发生在肿瘤内，达到选择性抑制肿瘤细胞活性的目的。
69.摄取了前体药物的细胞用pbs清洗3次以除去表面黏附的反应物，并于每孔加入0.1ml新鲜dmem培养基，以470nm led蓝光光源(功率：260mw/cm2)从培养板下方垂直照射10min实现聚合反应。所述波段的光源对细胞损伤较小，通过实验证明用405nm和530nm的光源都不能引发所述细胞内聚合反应。
70.实施例1：raft链转移剂2-(丁基硫代羰基硫代硫基硫基)丙酸(raftcta)的合成步骤
71.在30min内，向含有9.0g koh的150ml thf悬浊液中逐滴加入50ml含有16.0g正丁醇的thf溶液，室温搅拌30min，再逐滴加入50ml含有17.0g cs2的thf溶液，室温搅拌24h后减压浓缩至50ml，搅拌下将50ml含有22.4g正丙基溴化铵的thf溶液逐滴加入上述浓缩液中，室温搅拌24h后减压去除溶剂即得目标粗产物，进一步通过硅胶柱色谱纯化即得亮黄色晶体状目标产物。
72.实施例2：cck-8测试表征细胞活性
73.cck-8测试中，首先将hela细胞以1x 104的密度接种于96孔细胞培养板中并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h，保证细胞贴壁；然后对细胞进行不同浓度给药或光照(5
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20min，260mw/cm2)等处理，并继续恒温孵育24h；24h后将原培养基吸出并用pbs清洗细胞3次，每孔加入稀释的cck-8溶液(与培养基比例为1：10)100μl，恒温孵育4h后用酶标仪检测各孔内450nm处的紫外吸收，处理过的细胞与未处理细胞进行吸光度比较即可得到细胞活性值。
74.实施例3：470nm光照不同时间对hela细胞活性产生的影响
75.hela细胞以1x 104的密度分别接种于三块96孔细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；然后以470nm led蓝光光源分别从三块培养板下方垂直照射5、10、20min。
76.按上述方法，光照前后的细胞活力可以用cck-8测试进行定量表征。(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐，可被细胞线粒体内酶催化还原，还原量与细胞数量成正比，因此被广泛用于细胞活性的测试)。
77.如图2所示，对细胞进行5-10min蓝光照射后细胞活力均保持在88％以上，说明蓝光照射对细胞损伤较小，可以作为细胞内聚合的光源使用；而照射20min后细胞活性降低至76％，因此本发明激活前体药物的光照时间选择在10min。
78.以下以肿瘤细胞为例，展示细胞内聚合对细胞活性的抑制作用。
79.实施例4：细胞内聚合对hela细胞的抑制作用
80.hela细胞以1x 104的密度接种于96孔细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；5mm dma、0.1mm raftcta以及0.01mm曙红y，或5mm dma、0.05mm raftcta以及0.005mm曙红y，或5mm dma、0.01mm raftcta以及0.001mm曙红y按比例溶解于高糖dmem细胞培养基中(含有10％小牛血清、100uni/ml的青霉素和链霉素)，并按每孔0.1ml的用量加入用pbs清洗过(3次)的hela细胞，37℃恒温孵育4h，hela细胞用pbs清洗3次以除去表面黏附的反应物，并于每孔加入0.1ml新鲜dmem培养基，以470nm led蓝光光源从培养板下方垂直照射10min实现聚合反应。
81.按上述方法，光照前后的细胞活力可以用cck-8测试进行定量表征。如图3所示，光照前细胞内不生成聚合物，因此细胞活性高，说明聚合之前反应物本身不具有细胞毒性，并且470nm光照不会影响细胞活性(实施例3)，而光照后细胞活力显著降低，说明细胞内生成的聚合物对细胞活性产生了直接影响。
82.从cck-8测试结果(图3)可以看出，光照引发聚合反应前细胞活性保持在95％以上(灰色柱)，说明前体药物毒性低；而加入0.1mm和0.05mm raftcta的实验组中，通过光照聚合后细胞活性分别降低至48％和50％，说明两种条件配比下细胞内都生成了聚合物，且聚合物对细胞活性产生了显著抑制作用。
83.而在加入0.01mm raftcta的实验组中，通过光照聚合后细胞活性仅降低至92％，说明由于链转移剂及光敏剂浓度较低，细胞内产生的聚合物较少，并没有显著影响细胞活性。
84.实施例5：以小鼠为模型验证细胞内聚合对肿瘤生长的抑制作用
85.以1x 106hela细胞每鼠的密度在3周龄小鼠大腿外侧皮下接种肿瘤，并饲养7天，待肿瘤体积约为25mm3时开始给药。前体药物按5mm dma、0.05mm raftcta、0.005mm曙红y的浓度溶解于pbs中，并按5000μl/kg的剂量瘤内给药，给药24小时后以470nm蓝光(功率：260mw/cm2)对肿瘤进行10min光照实现聚合。给药及光照每7天进行一次，光照后7天及14天时对肿瘤体积进行测量，在14天时处死小鼠，取肿瘤拍照。其中对照组仅向肿瘤注入pbs，光照组注射pbs后24小时进行10min光照(470nm)，前体药物组仅向瘤内注射80μl前体药物溶液，不进行光照(重复组n＝4)。
86.从肿瘤生长曲线及去除肿瘤的照片(图4、图5)可以看出加入前体药物或光照10min对肿瘤生长速度影响较小，而同时实施两者使肿瘤内生成聚合物则可以非常显著的抑制肿瘤生长速率，实现抑制肿瘤生长的目的。
87.实施例6：细胞内聚合对a375细胞的抑制作用
88.a375细胞以1x 104的密度接种于96孔细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；5mm dma、0.1mm raftcta以及0.01mm曙红y按比例溶解于高糖dmem细胞培养基中(含有10％小牛血清、100uni/ml的青霉素和链霉素)，并按每孔0.1ml的用量加入用pbs清洗过(3次)的hela细胞，37℃恒温孵育4h，hela细胞用pbs清洗3次以除去表面黏附的反应物，并于每孔加入0.1ml新鲜dmem培养基，以470nm led蓝光光源从培养板下方垂直照射10min实现聚合反应。
89.从cck-8测试结果(图4)可以看出，光照引发聚合反应前细胞活性保持在90％以上，说明前体药物反应物毒性低，而聚合后细胞活性降低至22％，说明细胞内发生了聚合反应且生成的高分子聚合物显著抑制了细胞活性。与实施例3相比，聚合后实施例6中细胞活力降低比实施例3降低更为显著，说明本方法在不同细胞内都能生成聚合物，且聚合物对不同细胞活性产生了显著抑制。
90.实施例7：细胞内聚合对1205lu细胞的抑制作用
91.1205lu细胞以1x 104的密度接种于96孔细胞培养板中，并在37℃，4％二氧化碳条件下恒温孵育18h；5mm dma、0.1mm raftcta以及0.01mm曙红y按比例溶解于高糖dmem细胞培养基中(含有10％小牛血清、100uni/ml的青霉素和链霉素)，并按每孔0.1ml的用量加入用pbs清洗过(3次)的hela细胞，37℃恒温孵育4h，hela细胞用pbs清洗3次以除去表面黏附
的反应物，并于每孔加入0.1ml新鲜dmem培养基，以470nm led蓝光光源从培养板下方垂直照射10min实现聚合反应。
92.从cck-8测试结果(图5)可以看出，光照引发聚合反应前细胞活性保持在90％以上，说明前体药物毒性低，而聚合后细胞活性降低至61％，说明细胞内发生了聚合反应且生成的聚合物显著抑制了细胞活性。与实施例3相比，聚合后实施例7中细胞活力降低与实施例3降低程度类似，说明本方法在不同细胞内都能生成聚合物，且聚合物对不同细胞活性产生了显著抑制。
93.实施例8：细胞内前体药物生成高分子聚合物的结构分析
94.通过紫外可见吸收光谱定量分析细胞裂解液的吸收光谱并与对应化合物的标准进行比较可得被摄取到细胞内的前体药物各组分的浓度，其中dma为28.1mm，raftcta为1.6mm，曙红y为0.82mm。
95.按照细胞内浓度在体外以pbs为溶剂，通过透析法(mwco＝1000da)对聚合物进行提纯后，通过1hnmr测试分析组成(如图8所示)，并通过gpc测试分析聚合物相对分子质量(mn＝26kda)及分子量分布(d＝1.09)，如图9所示。
96.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。