一种基于氘代物检测代谢的核磁检测方法与流程

1.本发明涉及医学领域，尤其是一种具有高分辨率和高灵敏度的基于氘代物检测代谢的核磁检测方法。


背景技术：

2.人体代谢在许多疾病的起源或进展中起关键作用，包括神经退行性疾病，糖尿病和癌症等，对代谢途径和代谢状况的检测就有助于人们了解自身状况，从而有针对性的采取相应的措施。代谢成像则是其中一种检测方法，比如：广泛使用的
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f-fdg的pet检测，它提供癌症、神经变性和心脏疾病中葡萄糖摄取的高分辨率图，然而
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f-fdg的pet检测在糖酵解代谢的初始步骤后，无法得知葡萄糖摄取后下游的代谢状况，并且通常在具有内在高葡萄糖摄取的器官(例如脑)中不能提供清晰的结果，同时
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f-fdg是具有放射性的，在需要重复扫描时，会对人体造成伤害。常规磁共振成像(mri)能提供极好的解剖学细节，并且是非放射性的，但对代谢的了解有限；质子磁共振波谱成像(mrsi)是用于在一次采集中检测和量化多种内源性组织代谢产物，但它无法追踪代谢通量和途径。于是产生了利用
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c磁共振波谱(mrs)结合给予
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c标记的底物来观察下游
13
c标记的代谢物，然而，由于其固有的低灵敏度，体内
13
c的mrs被限制为相对较大的单一体积，检测受限。


技术实现要素：

3.针对现有的不足，本发明提供一种具有高分辨率和高灵敏度的基于氘代物检测代谢的核磁检测方法。
4.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
5.一种基于氘代物检测代谢的核磁检测方法，包括如下步骤：
6.s1，通过核磁共振波谱仪扫描受试者待检测部位并形成使用氘代物之前的1h的使用前图谱；
7.s2，获得使用前图谱后，给受试者使用2h标记的氘代物，在给定时间内通过核磁共振波谱仪在相同参数下再次扫描受试者待检测部位并形成使用氘代物之后的1h的使用后图谱；
8.s3，处理分析使用前图谱和使用后图谱数据，根据指定代谢物中1h的特征谱线获得使用氘代物之前和之后指定代谢物的浓度，所述代谢物在服用氘代物之前和之后的浓度差就是氘代物的转化，通过如下公式就获得指定代谢物富集的富集率：
9.富集率＝(使用前代谢物浓度-使用后代谢物浓度)/使用前代谢物浓度x100％
10.通过不同代谢物的富集就得出氘代物的代谢途径，并通过比对所测得的同一代谢物在受试者与正常组织功能下的值来得出待检测部位的代谢状况。
11.作为优选，所述氘代物是氘代葡萄糖、氘代乙酸盐中的任意一种或多种。
12.作为优选，所述氘代葡萄类是[6,6
′-2h2]葡萄糖、[2h7]葡萄糖中的任意一种或多种，所述氘代乙酸盐是[2,2,2
′-2h3]乙酸盐。
[0013]
作为优选，所述步骤s2中的给定时间是20至90分钟。
[0014]
作为优选，所述代谢产物是谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、乳酸中的任意一种或多种。
[0015]
作为优选，所述核磁共振波谱仪使用了套设在一起的均为环形结构的内线圈和外线圈，所述内线圈和外线圈均包括对应设置在环形结构两端的前线圈单元和后线圈单元、连接前线圈单元和后线圈单元的沿周向间隔排列的多根直导线，所述内线圈和外线圈上的直导线交错设置。
[0016]
作为优选，所述前线圈单元和后线圈单元均为圆环形并同轴设置，所述内线圈和外线圈也同轴设置，所述外线圈上的每一根直导线均设置于内线圈上对应相邻的两根直导线的正中间。
[0017]
作为优选，所述前线圈单元和后线圈单元直径相同，所述直导线与前线圈单元和后线圈单元垂直设置。
[0018]
作为优选，所述内线圈是非氢核发射接收线圈，所述外线圈是氢核发射接收线圈。
[0019]
作为优选，所述核磁共振波谱仪是具有多通道的核磁共振仪。
[0020]
本发明的有益效果在于：该发明通过量化由2h取代1h产生的质子磁共振波谱(mrs)中信号的减少来获得细胞代谢状况，利用1h质子磁共振波谱检测的普遍性及易于实施的优势，以及其出色的光谱分辨率，就可以追踪标记氘转移到的代谢物，检测分辨率和灵敏度更高，可以检测到单个代谢物的动态交换，通过测量1h质子磁共振波谱的变化，在高光谱分辨率下就能够检测到2h质子磁共振波谱无法检测到的代谢物，从而得出体内代谢循环的速率，一次采集就可提供几种代谢物的稳态信息和代谢率，同时该发明中所用的氘代物也易得易服用的，对于1h质子磁共振波谱的检测也可以使用标准的核磁共振仪，不需要专用设备，成本更低，通过使用标准的1h质子磁共振波谱采集硬件和信号处理就可以直接监测氘标记的转换，方法简单实用，精度高、结果可靠，可定量定位的分析代谢状况。
附图说明
[0021]
图1是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在中脑中测得的1h mrs谱图(10分钟采集，256个平均值)；
[0022]
图2是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在胶质母细胞瘤中测得的1h mrs谱图(5分钟采集，128个平均值)；
[0023]
图3是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在胶质母细胞瘤中测得的输注前后的1h mrs对比谱图(5分钟采集，128个平均值)；
[0024]
图4是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在正常脑组织中测得的2h mrs谱图(10分钟采集，256个平均值)；
[0025]
图5是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在正常脑组织中测得的1h mrs谱图(10分钟采集，256个平均值)；
[0026]
图6是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在正常脑组织中测得的输注前后1h mrs产生的差异谱图；
[0027]
图7是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在正常脑组织通过1h mrs谱图和2h mrs谱图测得的glx浓度变化的对比图；
[0028]
图8是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在正常脑组织通过1h mrs谱图和2h mrs谱图在每个时间点上与glx浓度的关系图；
[0029]
图9是本发明实施例60min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖在正常脑组织通过1h mrs谱图和2h mrs谱图测量的平均偏差和标准偏差图(实线：平均偏差；虚线：标准偏差)；
[0030]
图10是本发明实施例45min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖测得的glx的富集；
[0031]
图11是本发明实施例45min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖测得的glu的富集；
[0032]
图12是本发明实施例45min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖测得的gln的富集；
[0033]
图13是本发明实施例45min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖测得的gaba的富集；
[0034]
图14是本发明实施例45min内输注[6,6
′-2h2]葡萄糖测得的naa的富集；
[0035]
图15是[6,6
′-2h2]葡萄糖和[2,2,2
′-2h3]乙酸盐在体内的代谢途径示意图；
[0036]
图16是本发明实施例核磁共振波谱仪中线圈的结构示意图，其中1-内线圈10-前线圈单元11-后线圈单元12-直导线2-外线圈3-内壳体4-外壳体；
具体实施方式
[0037]
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0038]
本发明实施例一种基于氘代物检测代谢的核磁检测方法，包括如下步骤：
[0039]
s1，通过核磁共振波谱仪扫描受试者待检测部位并形成使用氘代物之前的1h的使用前图谱；可以使用标准的核磁共振仪，如3t mri扫描仪或7t mri扫描仪，不会有暴露于电离辐射的风险，不需要专用设备，使用方便，其序列和成像参数则可以如下选择：使用press序列(tr/te＝2500/16ms，频谱宽度＝4khz，90脉冲带宽＝5400hz，180脉冲带宽＝2400hz，点数＝4006，vapor水抑制，平均＝128)。
[0040]
s2，获得使用前图谱后，给受试者使用2h标记的氘代物，该示氘代物可以是单一剂量单位形式的组合物，即该组合物可以是单剂量的或者是在一个容器内容纳一个或多个单位剂量，每一剂量含有的成分均相同，即每剂中包含相同重量的2h标记物质，每剂可直接或稀释后给受试者使用，也可将该组合物制成不同的规格，比如包含2h标记物质的不同规格，就可依据受试者的状况来给予不同规格组合物去使用，该组合物可制成液体或固体不同的形态，依据受试者的不同，可以给予不同剂量的氘代物，比如按照0.60-0.75克/千克体重，最大为60克的用量将其溶解在200至300毫升的水中来使用，根据氘代物的不同规格，可以是口服的非侵入式的使用方式也可以是注射的方式来使用，同时氘代物还可以是一种以散剂、片剂、丸剂、胶囊或液体中的任意一种形式存在的组合物。用2h标记就意味着用2h取代一个或多个1h原子，由此就会导致相应代谢物的1h mrs信号总体的降低，这样通过量化由2h取代1h产生的质子磁共振波谱中信号的减少就能获得氘代物转化的状况，从而得知细胞代谢状况。在给定时间内通过核磁共振波谱仪在相同参数下再次扫描受试者待检测部位并形成使用氘代物之后的1h的使用后图谱；该给定时间优选在20至90分钟，这样氘代物在体内就能经过充分的转化，有助于获得更准确的检测结果，体现代谢状况，在给定时间内可以间隔一定时间进行多次测量，比如每隔五分钟或十分钟获取该时间点的图谱数据，如图1-9中所
示，服用[6,6
′-2h2]葡萄糖后glu-h4峰随时间的变化，其振幅显著降低，并在差异光谱中在2.35ppm处形成清晰的峰。同时在检测1h mrs时，也同时检测2h mrs，然后通过频谱定量分析软件比如lcmodel对glx浓度进行定量分析，可以看出1h mrs和2h mrs在服用[6,6
′-2h2]葡萄糖后45分钟后初始的线性增加开始趋于平稳，两者具有良好的一致性，也就表明1h mrs能准确的反映服用氘化物后glx动态变化。由于2h具有较低的核磁共振频率，在核磁共振波谱上就会具有较宽的固有宽峰，使得氘成像受磁场不均匀性的影响最小，却使得2h的核磁共振波谱仅含有少量代谢物峰，1h mrs的灵敏度更高，就能单独检测出2h mrs无法获得的某些代谢物的图谱，从而得到更精确的检测结果，在提供几种代谢物的稳态代谢信息的同时，还可以在同一采集过程对关键代谢物的代谢动力过程予以检测。
[0041]
s3，处理分析使用前图谱和使用后图谱数据，根据指定代谢物中1h的特征谱线获得使用氘代物之前和之后指定代谢物的浓度，所述代谢物在服用氘代物之前和之后的浓度差就是氘代物的转化，通过如下公式就获得指定代谢物富集的富集率：
[0042]
富集率＝(使用前代谢物浓度-使用后代谢物浓度)/使用前代谢物浓度x100％
[0043]
通过不同代谢物的富集就得出氘代物的代谢途径，并通过比对所测得的同一代谢物在受试者与正常组织功能下的值来得出待检测部位的代谢状况。如图10-14中所示，在服用[6,6
′-2h2]葡萄糖前后多种代谢物的浓度变化状况，在图中使用了如下校正因子予以校正，以1.33ppm来调整[6,6
′-2h2]葡萄糖服用后单个或两个2h基团从乙酰基-coa转移至下游代谢产物的量，从图中就可以看出服用[6,6
′-2h2]葡萄糖后glx逐渐富集并最终达到平稳状态的过程，服用45分钟后，glx增加了0.89
±
0.23mm(约9％的富集)，经过单独的定量分析可以看出，glu增加了0.68
±
0.15mm(约11％富集)，gln增加0.21
±
0.12mm(约8％的富集)，同时对于gaba的变化，其增加0.25
±
0.10mm(约富集10％)。众所周知，一些病变组织，尤其是肿瘤的发展均与细胞的代谢是密切相关的，肿瘤细胞更依赖于糖酵解来支持细胞生长、增值和生存，由warburg效应得知，这种低效代谢过程的标志就是glc的吸收增加，随后转化为lac,与正常生理条件相比，lac的产量会显著增加，通过这些代谢物浓度的变化，就可以清晰准确的得出组织的代谢状况。正常组织功能的值则可以采用医学上所规定的值或者采取若干健康样本得出的平均值来使用。
[0044]
进一步的改进，所述氘代物是氘代葡萄糖、氘代乙酸盐中的任意一种或多种，糖类物质作为人体最大的能量来源，其在体内被水解为葡萄糖，继而进入血液循环，被输送到身体各部，葡萄糖则通过糖酵解、糖的有氧氧化和磷酸戊糖等途径，释放出来能量，保证生命活动，就可以通过对其的追踪来监测体内的不同部分，再通过检测到的氘的量就可以知道检测部位的状况；乙酸盐主要通过神经胶质细胞来运送，其中的乙酰基，是生物化学中所有生命的基础，当它与辅酶a结合后，就成为了碳水化合物和脂肪新陈代谢的中心。
[0045]
进一步的改进，所述氘代葡萄类是[6,6
′-2h2]葡萄糖、[2h7]葡萄糖中的任意一种或多种，所述氘代乙酸盐是[2,2,2
′-2h3]乙酸盐。[6,6
′-2h2]葡萄糖和[2,2,2
′-2h3]乙酸盐在体内的代谢过程如图15中所示，因此优先检测作为重要的代谢产物，它们是谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、乳酸中的任意一种或多种。在第六碳位置标记的葡萄糖优于[1-2
h]的葡萄糖，因为氘含量较高(两个2h原子)并且成本优于[1,2,3,4,5,6,6
′-2h7]葡萄糖，降低成本和最小化2h核磁共振波谱的复杂性，就更利于提高其检测精度和准确度。如图1所示，在健康受试者服用[6,6
′-2h2]葡萄糖60分钟前后大脑中的1h mrs，在图中可以清楚的观察到
glu-h4振幅在2.35ppm处降低，从服用葡萄糖之前的光谱中减去服用后的1h mrs图谱中，除了几个谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、γ-氨基丁酸(gaba)和天冬氨酸(asp)共振外，2.35ppm处glu-h4共振显著增加，远高于背景信号，在3.3和3.6ppm之间存在差异谱的大幅降低，这是由于服用的[6,6
′-2h2]葡萄糖上的非氘化质子共振产生，在3.6和4.0ppm之间则有相当大的增加，其对应于氘标记的glc-h6共振(3.9ppm)，glu gln-h2(glx-h2；3.8ppm)，由于检测的高灵敏度，同时在1.33ppm处lac-h3共振出现轻微降低，其是由于服用的葡萄糖导致脑组织产生的少量未标记lac。在服用[6,6
′-2h2]葡萄糖时，对于人类受试者则采用口服[6,6
′-2h2]葡萄糖，以0.75克/千克体重的用量，溶解在200-300毫升水中，最大的用量不超过60克，对于大鼠则将[6,6
′-2h2]葡萄糖以1m的浓度溶解在水中，以1.95g/kg体重的用量进行注射，通过股静脉或腹膜内的静脉进行输注，或者采用[2h3]乙酸盐以2μm的浓度溶解在水中，并如葡萄糖一样进行注射，得到总共2g/kg体重的[2h3]乙酸盐。同时也可以采集待检测部位的细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，在标准培养条件(37℃和5％co2)下与含有100％[6-13
c]葡萄糖或[6-13
c，6,6
′-2h2]在dmem中一起培育，6小时后，收集培养基，并加入[2-13
c]甘氨酸作为内标形成样品，然后将样品(5ml)在冷冻干燥机上冷冻干燥，再在冷冻干燥的样品中加入600μl作为化学位移参考和内部浓度标准的混合溶液，该混合溶液是含有磷酸盐缓冲液(100mm)、d2o(10％)、甲酸钠和咪唑的水的混合物。在实施例中我们对受试者予以静脉注射[6,6
′-2h2]葡萄糖，15秒内注射250μl，然后将输注速率降低至191μl/min，在指数降低后每30s手动降低一次，直至最初8min的最终输注速率为13.7μl/min，在70min中内输注完毕，然后通过核磁共振波谱仪对中脑进行扫描获取1h mrs，使用press(tr/te＝2500/16ms，频谱宽度＝4khz，90脉冲带宽＝5400hz，180脉冲带宽＝2400hz，点数＝4006，vapor水抑制，平均＝128)的对照组中脑(6.5x6.5x2.5mm3，n＝6)和胶质母细胞瘤(4x4x4mm3，n＝3)；此后使用lcmodel软件对测量的体内1h mrs来定量代谢物的浓度，此时使用未抑制的水峰作为浓度标准，lcmodel应用9.4t自选回拨(te＝16ms)基础集，并包含有ala、asp、肌酸、磷酸肌酸、gaba、glc、gln、glu、甘油磷酸胆碱、碳酸胆碱、谷胱甘肽、肌醇、naa、naa glu、糖基肌醇和牛磺酸、脂质共振分别为0.9、1.3和2.0ppm，大分子共振为0.9、1.2、1.4、1.7和2.0ppm，之后从输注前的水平中减去输注后的水平，并将代谢物水平的变化除以输液前的值来计算每种代谢物的富集。
[0046]
进一步的改进，如图16中所示，所述核磁共振波谱仪使用了套设在一起的均为环形结构的内线圈1和外线圈2，所述内线圈1和外线圈2均包括对应设置在环形结构两端的前线圈单元10和后线圈单元11、连接前线圈单元10和后线圈单元11的沿周向间隔排列的多根直导线12，所述内线圈1和外线圈2上的直导线12交错设置。这样就可以将其用于超高场(大于3t)磁共振成像系统，实际我们在小于11.7t的范围内使用，内外线圈设置在一圆筒形壳体的夹层内，意即壳体是由同为圆筒形的内壳体3和外壳体4形成，内外壳体间形成的夹层构成容置空腔，内外线圈也就大致呈筒形结构。壳体的内孔则构成用于加载受试者的检查空间。所述前线圈单元10和后线圈单元11直径相同，所述直导线12与前线圈单元10和后线圈单元11垂直设置。在检测时将待测物布置于上述壳体的内孔中，在交流电压驱动下，根据磁共振系统主磁场强度及拉莫尔频率，外线圈2产生一定频率的交变磁场(发射)，激发待测物体内氢原子产生磁共振信号，并且该信号被外线圈2检测到(接收)；基于同样的激发和接收原理，内线圈1接收其他原子产生的磁共振信号，经整合后传输给磁共振系统完成磁共振
信号采集与图像重建。此时，就可以使得所述内线圈1是非氢核发射接收线圈，所述外线圈2是氢核发射接收线圈。我们就可根据不同的应用要求来选择具有相应共振频率的内线圈1(一般的内线圈的具体结构被确定后其便具有固定的共振频率；故而，我们可通过改变内线圈具体结构的方式来获得所需要的共振频率)，进而使其接收到相应非氢原子(如磷(
31
p)、钠(
23
na)、钾(
39
k))的磁共振信号，就可以同时获得氢核和非氢核的磁共振信号，实现双核信号的同时采集，从而得到质量更高、信息更全的磁共振图谱，避免对氢核图谱的干扰因，分析结果更精确。当外线圈2和内线圈1在圆周方向相互错位布置时，大大减小了外线圈2与内线圈1之间的信号耦合(去耦合)，明显提升磁共振的成像质量。同时由于外线圈2和内线圈1的结构形式基本相同，二者均包括有同为圆环形结构的前线圈单元10和后线圈单元11，前线圈单元10和后线圈单元11大小一致且同轴布置，并且前线圈单元10和后线圈单元11之间连接有多根间隔布置的直导线12，各根直导线12沿着圆周方向均匀间隔排布，同时每根直导线12均与前线圈单元10和后线圈单元11垂直。不难看出，在上述这种线圈结构中，外线圈2和内线圈1均包含多个(法线)正交布置的线圈单元，并且外线圈2中的线圈单元与内线圈1中对应线圈单元也正交布置，即其任意相邻的两条直导线12与两侧前线圈单元10和后线圈单元11所围合呈的环形结构(近似矩形环)都会构成一个线圈单元，而且该线圈单元与前线圈单元10和后线圈单元11的电磁分量相互正交，大大减小了射频线圈信号之间的相互串扰，进一步提升成像质量。在这样的结构中，外线圈2和内线圈1均采用近似“鸟笼状”的结构。而且在实际应用时，外线圈2既作为发射线圈，又作为接收线圈，可同时发射和接收信号；同样，内线圈1也可以既作为发射线圈，又作为接收线圈，亦可同时发射和接收信号。这种线圈结构及其工作方式，具有最优的射频发射、接收效率和最优的射频发射场均匀性，结构简洁，适用性高。外线圈2和内线圈1是套设在一起的，也就意味着外线圈2的直径大于了内线圈1的直径，并且外线圈2同轴套设在内线圈1外围，这样就使得外线圈2(氢核发射接收线圈)距离待测物尽可能远，可以有效减弱射频发射场产生的射频加热效应对被测物的影响。同时工作时内线圈1(非氢核发射接收线圈)的信号强度弱于外线圈2，将内线圈1布置于内侧，会更加贴近待测物，可弥补其信号较弱的缺陷，有利于提升非氢核成像质量。当然，我们也可以将非氢核发射接收线圈做大，并将其布置在氢核发射接收线圈外围。不过这种方式会存在较强的射频加热效应，影响内部被测物的耐受性，甚至对被测物造成伤害，而且非氢核成像质量也会非常差。在检测时首先选择设备和相应的参数，对于动物的检测上，采用能产生11.7t的磁体上进行，该核磁共振系统配备有直径为9.0cm能在180μs并以440mt/m转换的梯度磁场系统和为1h和2h射频传输的0.5-kw射频放大器。对于大脑的检测则使得mri和匀场的射频发射和接收是在调谐到质子nmr频率(499.8mhz)用正交驱动的两个正交20mm表面线圈进行的，表面线圈则是采用调至76.7mhz的两圈直径直径为14mm表面线圈，并与质子的射频线圈集成而成。对于肝脏的检测则用5.9cm直径的质子体积线圈(6.1cm长)进行mri和匀场，用5.0cm直径的氘体积线圈(6.1cm长)进行2h的mrs/mrsi,其中2h线圈安装在1h线圈内。射频屏蔽罩则是1h线圈的组成部分，用于管理高质子频率(499.8mhz)的电容，同时使用针对1h和其它原子核的采集优化的5mm探针。而对于人体的检测，则采用产生4t、7t或9.4t的磁体上进行，该系统配备67cm直径的梯度磁场，能够在1.1毫秒内切换30mt/m，梯度系统则包括一整套三阶匀场线圈，1h和2h的射频传输使用4kw射频放大器。实施例中采用28.5cm直径的横向电磁(tem)体积线圈进行大脑检测，调谐到质子频率(170.5mhz)用于mri和匀
场，探头则由直径9cm的2h表面线圈和一对圆形直径11cm的1h线圈正交排列的方式组成。
[0047]
进一步的改进，所述前线圈单元10和后线圈单元11均为圆环形并同轴设置，所述内线圈1和外线圈2也同轴设置，所述外线圈2上的每一根直导线12均设置于内线圈1上对应相邻的两根直导线12的正中间。这样外线圈2和内线圈1就具有相同数量的直导线12，会进一步提升外线圈2与内线圈1之间的信号的去耦合效果。
[0048]
进一步的改进，所述核磁共振波谱仪是具有多通道的核磁共振仪，其磁共振中央控制器具有的通道数就决定了整个磁共振设备的运行，通道数越高，波谱仪控制和信号处理能力就越强，平台线圈单元数更多，采集数据的精度更高，获得的信号更多，获得更高图像分辨率，数据处理单元更多，处理速度更快，处理数据量更多，数据处理的能力更强。
[0049]
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。