一种基于氘光谱成像检测葡萄糖代谢的方法与流程

1.本发明涉及生物医学领域，尤其是一种具有高分辨率、高灵敏度和较快成像速度的基于氘光谱成像检测葡萄糖代谢的方法。


背景技术：

2.葡萄糖代谢是包括从分解代谢到合成代谢和大分子合成的多方面过程。具体的说，葡萄糖在被吸收到细胞中后，葡萄糖分解代谢分解碳链来提供能量，同时为生物合成包括核苷酸、氨基酸和脂肪酸在内的多种前体提供底物，这些合成代谢产品通过构建生物大分子(如核酸、糖原、蛋白质和脂质)进一步促进细胞的更新和繁殖，过量的葡萄糖也可以作为聚合物储存。而葡萄糖在合成各种大分子方面的分配则是细胞功能状态的重要体现。现有的葡萄糖代谢成像技术有：
18
f-fdg的pet检测，它提供葡萄糖摄取的高分辨率图；基于核磁共振的成像通过从羟基质子到水的饱和转移来测量葡萄糖积累；
13
c nmr光谱成像通过超极化的[
13
c]-葡萄糖解析可溶性糖酵解产物；dmi氘代谢成像核磁检测，能检测某些代谢物的代谢信息，但会产生核磁辐射，2h光谱峰线也比较宽，检测具有一定局限性；同位素标记葡萄糖成像质谱技术可对代谢物或从样品中解吸出来的离子碎片进行化学分析；荧光分析具有高分辨率，可使用不可代谢的葡萄糖类似物来确定葡萄糖的摄取活性。但这些成像技术都是只能检测到葡萄糖代谢的早期过程，包括摄取或转化为小分子代谢物，而对于葡萄糖合成代谢产物用于大分子合成的利用是无法检测的。


技术实现要素：

[0003]
针对现有的不足，本发明提供一种具有高分辨率、高灵敏度和较快成像速度的基于氘光谱成像检测葡萄糖代谢的方法。
[0004]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005]
一种基于氘光谱成像检测葡萄糖代谢的方法，包括如下步骤：
[0006]
s1，给定时间内给受试者服用给定浓度的d标记葡萄糖；
[0007]
s2，在待测部位采集组织样品；
[0008]
s3，处理分析s2中获得的组织样品，通过受激拉曼光谱仪检测组织样品中c-d键的成像光谱；
[0009]
s4，根据c-d键的成像光谱进行定性或定量分析葡萄糖代谢中合成的大分子，进而判断出葡萄糖的代谢水平。
[0010]
作为优选，所述d标记葡萄糖是[d7]葡萄糖、[6,6
′-
d2]葡萄糖中的任意一种。
[0011]
作为优选，所述给定浓度的d标记葡萄糖是重量浓度范围为2-10％的葡萄糖。
[0012]
作为优选，所述受激拉曼光谱仪是共焦显微拉曼光谱仪。
[0013]
作为优选，所述受激拉曼光谱仪上设置有相干拉曼散射内窥镜。
[0014]
作为优选，所述受激拉曼光谱仪上耦合有多通道受激拉曼散射显微镜。
[0015]
作为优选，所述受激拉曼光谱仪设有两个同步脉冲激光器，所述激光器发出的波
长范围是近红外或可见光范围。
[0016]
作为优选，所述给定时间是至少1天。
[0017]
作为优选，所述d标记的葡萄糖是[d7]葡萄糖和[6,6
′-
d2]葡萄糖，它们的重量浓度均为2-10％，并在相等的间隔时间内依次给受试者服用，所述间隔时间等分给定时间且每种葡萄糖服用的次数相同。
[0018]
作为优选，所述定量分析包括有如下几种方法：a，绝对拉曼光谱强度来比较不同条件下的代谢活性；b，通过不同的大分子之间的光谱强度比率用来指示葡萄糖的差异利用；c，通过c-d键和c-h键光谱强度的比率来反映特定生物分子的更新或转换。
[0019]
本发明的有益效果在于：该发明通过受激拉曼光谱仪对代谢合成中大分子的c-d键予以光谱成像，这样基于拉曼光谱和受激拉曼散射(srs)成像技术就能对葡萄糖衍生的大分子合成活性进行高空间分辨率的映射，亦即在大分子中c-d键的富集，而c-d键在“细胞沉默”窗口中会产生明显的拉曼峰，此时还不会受到内源性分子的干扰，利用c-d键拉曼光谱特征就可以区分各类型的葡萄糖衍生的大分子，同时在光-分子相互作用之后，入射光束的强度变化是与分析物浓度成正比，可以实现三维的光学切片，并通过在选定的频率下调整激光波长来获得一堆高光谱图像，这样通过在非高峰频率下获取图像来减去非振动共振背景，就提高了成像分辨率，就能对动物组织进行高分辨率成像，通过拉曼峰的峰强就可以得出对应大分子的浓度，就可以得知葡萄糖是如何分配给大分子的以及葡萄糖代谢中合成大分子的路径，具有高分辨率、高灵敏度和较快的成像速度。
附图说明
[0020]
图1是本发明实施例[d7]葡萄糖代谢时主要生物合成中氘转移的途径；
[0021]
图2是本发明实施例使用10％的[d7]葡萄糖或[6,6
′-
d2]葡萄糖喂养小鼠8小时后禁食过夜获得的肝糖原的c-d拉曼光谱，其中1为[d7]葡萄糖喂养，2为[6,6
′-
d2]葡萄糖喂养；
[0022]
图3是本发明实施例用0.45％的[d7]葡萄糖、[6,6
′-
d2]葡萄糖培养6天并在1450cm-1
处(c-h键弯曲)归一化的hela细胞脂质提取物的拉曼光谱，其中1为[d7]葡萄糖培养的细胞，2为[6,6
′-
d2]葡萄糖培养的细胞，3为从[d7]葡萄糖获得的信号减去[6,6
′-
d2]葡萄糖获得的信号；
[0023]
图4是本发明实施例用0.45％的[d7]葡萄糖、[6,6
′-
d2]葡萄糖培养6天的hela细胞蛋白质提取物的拉曼光谱，其中1为[d7]葡萄糖，2为[6,6
′-
d2]葡萄糖，3为从[d7]葡萄糖衍生信号中减去[6,6
′-
d2]葡萄糖衍生信号；
[0024]
图5是本发明实施例的检测装置原理图，其中1-二极管激光束，2-干涉滤波片，3-屈光镜，4-陷波滤波片，5-光谱仪，6-透镜，7-光束分配镜，8-物镜，9-目镜，10-摄像头，11-分色镜，12-针孔；
[0025]
图6是本发明实施例[d7]葡萄糖衍生的蛋白质、脂质和dna的拉曼光谱；
[0026]
图7是本发明实施例[d7]葡萄糖衍生的蛋白质、脂质和糖原的拉曼光谱；
[0027]
图8是本发明实施例[d7]葡萄糖衍生的大分子代谢物的标准化c-d拉曼光谱；
[0028]
图9是本发明实施例使用2％的[d7]葡萄糖喂养幼体小鼠30天，检测其大脑中cdp合成，其中m-分子层，g-颗粒细胞层，w-白质；
[0029]
图10是本发明实施例使用2％的[d7]葡萄糖喂养成年小鼠30天，检测其大脑中cdp合成，其中m-分子层，g-颗粒细胞层，w-白质；
[0030]
图11是本发明实施例5％的[d7]葡萄糖喂养小鼠1-6天内皮脂腺cd
l
和ch
l
的水时间的变化，其中s-皮脂，ig-內腺，og-外腺，g-腺体，比例尺50μm，虚线表示形态识别的边界；
具体实施方式
[0031]
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0032]
本发明实施例一种基于氘光谱成像检测葡萄糖代谢的方法，包括如下步骤：
[0033]
s1，给定时间内给受试者服用给定浓度的d标记葡萄糖；葡萄糖是动物的重要营养素，其在体内的代谢途径如图1所示，利用d标记，在其生物合成中d也随着进行了迁移，就能测量c-d键在迁移过程中浓度的变化。而葡萄糖作为营养来源，其可能会系统的改变新陈代谢，通过给受试者饮用2-10％浓度范围内的葡萄糖，测量在有或没有喝葡萄糖的情况下持续10天的受试者的食物和水的摄入量、体重增加和葡萄糖耐量，发现饮用葡萄糖并没有对葡萄糖耐量有扰动，因此给受试者服用d标记葡萄糖并不会影响的受试者的新陈代谢。该给定时间至少是1天，这样葡萄糖在体内才会有充足的代谢时间，此时受试者是可以正常饮食的，在给定时间内则可以按照饮食习惯予以服用，也可以在固定周期内多次服用，比如一天内每间隔6个小时服用一次。对于d标记葡萄糖来说，可以通过纯的d标记葡萄糖和水的混合来制得给定浓度的d标记葡萄糖，也可以是单一剂量单位形式的混合物，即该混合物可以是单剂量的或者是在一个容器内容纳一个或多个单位剂量，每一剂量含有的成分均相同，即每剂中d标记葡萄糖在该混合物中的浓度是给定浓度的，每剂可直接或稀释后给受试者使用，也可将该混合物制成不同的规格，依据受试者的不同，可以给予不同剂量的d标记葡萄糖，比如按照0.60-0.75克/千克体重，最大为60克的用量来使用，而为了使用方便，优选将该给定浓度的d标记葡萄糖制成给定浓度的溶液。而该给定浓度的d标记葡萄糖是重量浓度范围为2-10％的葡萄糖，这样就保证了在葡萄糖代谢中合成的大分子里具有足够浓度的c-d键的富集，即在大分子中至少富集有0.1-1％的氘，满足高空间分辨率的受激拉曼散射成像的检测限，即至少10mm的c-d键，同时也不会影响食物的摄入量，使得检测出的状况更符合实际。所述d标记葡萄糖是[d7]葡萄糖、[6,6
′-
d2]葡萄糖中的任意一种，这样就避免了c-d键在葡萄糖代谢中随着分解变为小分子而流失，确保其在大分子合成中的富集。而为了检测到葡萄糖的代谢梯度，所服用的d标记的葡萄糖包括有[d7]葡萄糖和[6,6
′-
d2]葡萄糖，它们的重量浓度均为2-10％，并在相等的间隔时间内依次给受试者服用，所述间隔时间等分给定时间且每种葡萄糖服用的次数相同，即在给定时间内给受试者先服用重量浓度为2-10％的[d7]葡萄糖，然后间隔一段时间后再服用重量浓度为2-10％的[6,6
′-
d2]葡萄糖，之后再间隔相同的时间服用重量浓度为2-10％的[d7]葡萄糖，依次服用两种葡萄糖，且两种葡萄糖的服用次数相同，这样通过服用两种不同葡萄糖的同位素异构体，在得到的光谱上就会表现出明显的强度差异，通过分析强度以及这些光谱中分配峰值的频率，就可以得知葡萄糖的代谢途径，代谢的异质性，从而得到葡萄糖在一定时间内的代谢梯度。如图2-4中
所示，在受试者(采用小鼠)的饮用水中依次使用了[d7]葡萄糖和[6,6
′-
d2]葡萄糖，每个24小时服用一次，共六天，收集的皮肤组织，其中葡萄糖几乎全部用于了皮脂腺的脂质合成，在图谱中也明显的显示出了皮脂腺中早晚合成的脂质，较早的迁移到更靠近中心的分泌管的位置。同时在对受试者(采用小鼠)依次服用[6,6
′-
d2]葡萄糖和[d7]葡萄糖后，每次间隔8小时，共六天，通过对肝糖原积累的检测得知，从门静脉到中心静脉形成的一般的营养梯度，肝脏的营养功能在整个营养梯度中均呈带状，通过这样的方法就能检测到同一肝脏组织内不同时间窗内合成的糖原的明确空间分布。
[0034]
s2，在待测部位采集组织样品；可以采用现有的医疗方法来获取，比如外科手术切除标本、活检标本等，这样就可以在确知患病的情况下对葡萄糖代谢在相应疾病中的病理进行了解，在不确定是否患病的情况下就可以了解对应部位的状况，代谢水平等。在采集样品时可以在服用d标记葡萄糖后的第二天，比如给定时间是一天，那么就可以隔夜后进行采集，给定时间是多天，就可以在每一天后进行采集，这样就可以得出多个样本，可以更全面的得出葡萄糖的代谢水平。
[0035]
s3，处理分析s2中获得的组织样品，通过受激拉曼光谱仪检测组织样品中c-d键的成像光谱；此步骤中就将组织样品处理成对应的组织切片或光学切片，处理方法则采用现有的将组织处理成组织切片的方法进行。比如：首先将组织样品在多聚甲醛溶液(4％pfa)予以固定，固定时间在不少于12小时，优选在48小时以上，然后将组织包埋在4％的琼脂糖凝胶中，并使用振动切片机切成100微米厚的薄片，之后收集组织切片并密封在载玻片和盖玻片之间。此时若为了去除组织中的脂质，可以将组织切片在甲醇溶液中浸泡48小时，然后用pbs(磷酸缓冲盐溶液)洗涤；为了去除糖原，则可以将切片在冰冷的10％高氯酸中孵育1小时，然后再用pbs洗涤；为了从脂肪组织中提取脂质，收集1可脂肪组织，研磨并悬浮在1mlpbs中，然后与2.6ml氯仿和5.4ml甲醇混合，然后将悬浮液以4000rpm离心5分钟，将上清液转移至清洁试管中，并与2ml50mm柠檬酸、4ml水和2ml氯仿混合，短暂摇动并混合后，将试管以4000rpm离心10分钟以分离各相，收集含有脂质的下部氯仿相，并蒸发溶剂就获得组织脂质提取物。而光学切片则通过在受激拉曼光谱仪上使用两个同步的脉冲激光，以其不同的频率产生跳动场，就选择性的将匹配的分子振动跃迁加速，就实现了三维的光学切片。组织样品处理过后，通过受激拉曼光谱仪对样品中的c-d键的成像光谱进行检测。其检测装置原理如图5所示，所述受激拉曼光谱仪是共焦显微拉曼光谱仪，该光谱仪可配备有532nm二极管激光源，在室温下每毫米光栅具有1800条线，x50的物镜(0.75数值孔径)，激发功率约为42mw，在60s的采集时间在单个点收集所有样品的拉曼光谱，显微镜则采用导致的激光扫描显微镜，其能提供同步脉冲泵浦光束(可调的720-990nm波长，5-6ps脉冲宽度和80mhz的重复频率)和斯托克斯光束(固定波长1064nm，6ps脉冲宽度和80mhz重复频率)，斯托克斯束由电子光学调制器以8mhz的频率进行调制，通过一个高竖直孔径(1.4)的油冷凝器收集通过样品的前向泵浦和斯托克斯束的传输，高光密度带铜绿光片(890/220，色度)用于完全阻挡斯托克斯光束，并用于将泵浦光束传输到大面积额硅光电二极管上，以检测受激拉曼损耗信号，光电二极管的输出电流在8mhz出用锁相放大器中农之，滤波和解调，来确保散粒噪声限制的检测灵敏度，在激光扫描过程中，以每像素100μs的速度形成图像，在多通道成像时，则调整泵浦波长(λ
pump
)，以使泵浦和斯托克斯束之间的能量差与振动频率匹配，如下方程所述：
[0036][0037]
其中，ν是振动频率，单位为cm-1
，以每个所示的频率获取c-d通道。c-h通道分别在2845cm-1
和2940cm-1
处采集。所述受激拉曼光谱仪上设置有相干拉曼散射内窥镜，通过内窥镜与拉曼光谱仪的耦合来获取内部器官的成像光谱。所述受激拉曼光谱仪上耦合有多通道受激拉曼散射显微镜，由于不同大分子c-d拉曼光谱特征跨越几乎相同的频率范围，为了更好的区分它们，此时就可以以多种不同的频率(即通道)强度来对光谱谱线进行线性解混，调整波长在几个选定的频率来获取拉曼光谱成像，然后根据归一化标准光谱得出的系数就可以得到未混合的光谱图像。所述受激拉曼光谱仪设有两个同步脉冲激光器，所述激光器发出的波长范围是近红外或可见光范围，这样就能在选定频率下，调整激光波长来获得一堆高光谱图像，之后通过在非高峰频率下获取的图像来减去非振动共振背景，就得到高分辨率的成像，检测灵敏度提高，也能便于进行三维的光学切片。
[0038]
s4，根据c-d键的成像光谱进行定性或定量分析葡萄糖代谢中合成的大分子，进而判断出葡萄糖的代谢水平。对于定性分析来说，由于c-d键在“细胞沉默”窗口中有明显的拉曼峰，在细胞沉默区域(1800-2600cm-1
)约有2150cm-1
的谱带，表明了在细胞中形成有c-d键，而对于大分子来说，各自的特征谱峰约为，脂质2142cm-1
，蛋白质2192cm-1
，糖原和核酸2124cm-1
、2170cm-1
、2234cm-1
，见图6-7所示，通过这些特征谱线就可以区分出葡萄糖代谢中合成的大分子种类。而对于定量分析来说，所述定量分析包括有如下几种方法：a，通过绝对拉曼光谱强度来比较不同条件下的代谢活性；b，通过不同的大分子之间的光谱强度比率用来指示葡萄糖的差异利用；c，通过c-d键和c-h键光谱强度的比率来反映特定生物分子的更新或转换。在拉曼光谱中，入射光的强度和分析物的浓度是成正比的，其公式如下：
[0039]
iν＝klci0[0040]
其中：i
ν
为给定波长处的峰强，k为仪器和样品的系统参数，l为光路长度，c为样品中特定组分的摩尔浓度，i0为激光强度。
[0041]
首先采用标准浓度的特定组分，测出其在给定波长处的峰强，亦即先获取葡萄糖衍生的大分子代谢物的标准化c-d拉曼光谱，这里我们使用10％的[d7]葡萄糖喂养小鼠48小时后，隔夜禁食测得其肝脏糖原中c-d拉曼光谱，从用0.45％[d7]葡萄糖培养六天的hela细胞中提取的蛋白质、脂质、dna和rna来测得相应的c-d拉曼光谱，其中细胞的培养在则是，先将细胞在常规培养基中培养至50％融合，然后在规定时间内用0.45％[d7]葡萄糖(0.45％，w/v)的无葡萄糖dmem代替培养基培养，其中培养物中的血清降低至2-5％，每两天用新鲜培养基替换一次，六天后将细胞解离并收集，此后将细胞用4％pfa固定30分钟，固定在盖玻片上，将测得的这些光谱作为标准化的光谱来使用，如图8中所示，然后在相同的测试条件下再测出待测样品中给定波长处的峰强，通过两者的对比就得出待测样品中特定组分的浓度。在a方法中，需要针对某一特定大分子时，就通过测定在不同条件下的拉曼光谱，通过光谱强度得出不同条件下的待测组分的浓度，从而就判断出其代谢活性。在b方法中，是用来比较在相同条件下葡萄糖代谢中合成不同大分子时，对葡萄糖利用的差异，比如通过对两个大分子通道如脂质合成(cd
l
)、蛋白质合成(cd
p
)、dna合成(cd
d
)中任意两个的测定，然后对它们进行比较，就可以得知在相同条件下，葡萄糖代谢中合成大分子时，哪一个
利用葡萄糖多，哪一个少。比如在代谢功能一致的心肌和脂肪组织中对于cd
p
/cd
l
的测定后，就发现在心肌中是葡萄糖代谢侧重于高蛋白质合成，脂肪组织中葡萄糖代谢则是侧重于脂质合成的，同样的对于沿胃肠道的组织主要是蛋白质合成，而支持组织或导管则主要是脂质合成。比如给受试者服用10天的[d7]葡萄糖，然后禁食过夜后急性刺激并标记8小时，来自急性糖原合成(cd
g
)与cd
p
和cd
l
得以分离，同时由于体积的稀释，在具有浓缩染色体的有丝分裂细胞中可检测到dna合成，在非有丝分裂细胞中未检测到dna合成，因此就可以忽略非有丝分裂细胞中的dna信号，在这些通道中就可以获得不同的空间模式，cd
l
信号就显示出脂质小滴中脂质代谢产物的积累，cd
g
信号则显示细胞质中糖原的积累，如图9-10所示。在c方法中，针对c-h频率的受激拉曼光谱(脂质ch
l
；蛋白质ch
p
)就能得出脂质或蛋白质中未标记的c-h件的浓度，相应的c-d和c-h通道之间的轻度比就反映了特定大生物分子的更新和转换。例如，皮脂腺中脂质的产生和分泌会利用全分泌机制，其中外周皮脂细胞破裂并释放其在中央导管中的含量，通过对cd
l
和ch
l
的比较，发现葡萄糖提供的脂质更新实际上首先是出现在腺体的周围，然后逐渐迁移到中心，体现出了代谢中全质分泌的过程，如图11所示。
[0042]
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。