一种用于魔芋胶的蜡样芽孢杆菌简便识别方法与流程

1.本发明涉及一种用于魔芋胶的蜡样芽孢杆菌简便识别方法。


背景技术：

2.果冻是一种老少皆宜的休闲食品，因其独特的口感和滋味而深受人们的喜爱。果冻是以水、食糖为主要原料、辅以增稠剂等食品添加剂，经配料、溶胶、调配、灌装、杀菌、冷却等工序加工成的胶冻食品。
3.魔芋果冻中主要胶凝剂为魔芋粉(魔芋加工品)、原料魔芋胶种植于海拔250—2500米的山间土壤中，易受土壤、水源环境影响，其中蜡样芽孢杆菌是其主要的污染源。该菌为致病菌，其产生的肠毒素能致恶心呕吐及腹疼、腹泻两种类型的食物中毒。摄入的食品每克中活菌数在百万以上时，可导致食物中毒暴发，并可在群体中大规模暴发，中毒食品中菌数：≥100000(cfu/g)。
4.蜡样芽孢杆菌属于耐热性微生物，芽孢杆菌属通常可见于很多自然环境，如土壤和水中，<100℃的加工温度无法将其彻底杀灭。果冻生产工艺煮料、充填、杀菌等工序温度均低于100℃(85
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90℃之间)，不易将其杀灭，故由原料魔芋胶带入的蜡样芽孢杆菌容易污染到果冻终产品，导致终产品菌落总数超标，产生食品安全隐患。
5.如今对蜡样芽孢杆菌属检验鉴定需第三方专业检测机构，经分离、培养、鉴定时间需要10天以上，检验周期过长不利于进行规模化生产中质量预防管控。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于魔芋胶的蜡样芽孢杆菌简便识别方法。
7.本发明通过以下技术方案来实现：一种用于魔芋胶的蜡样芽孢杆菌简便识别方法，其特征在于，包括步骤如下：步骤1：制样：在无菌条件下，称取魔芋胶原料样品，加入生理盐水，搅拌溶解；步骤2：靶向菌预筛：将步骤1中已制备好的溶液置于恒温炉进行加热预煮，待温度升至88℃～92℃后进行保温预筛出芽孢菌属；步骤3：无菌接种：吸取经过步骤2预处理好的溶液于无菌培养皿中，加入复配培养基溶液，并转动培养皿使其混合均匀；步骤4：培养：琼脂凝固后，将平板翻转，在36
±
1℃下培养48
±
2h；步骤5：识别，经过培养后的试验菌落形态呈现出“雪花”或“梅花”形状的菌落。
8.较佳的，步骤2中，将步骤1中已制备好的溶液置于恒温炉进行加热预煮，待温度升至92℃后，保温5min。
9.较佳的，步骤3中，所述复配培养基溶液冷却至46℃时，将其倾注入培养皿内并混合均匀。
10.较佳的，步骤3中的复配培养基溶液为：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，l
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赖氨酸0.5g，氯化钾0.5g，蒸馏水1000ml。
11.较佳的，步骤3中，所述复配培养基溶液使用时需分步进行配制，先将所述胰蛋白
胨、酵母浸膏、葡萄糖和琼脂溶于煮沸的1000ml蒸馏水中，搅拌溶解，分装于锥形瓶并置于121℃高压灭菌15min备用；之后临用时再将配制好备用的琼脂培养基加热到溶解，再添加l
‑
赖氨酸和氯化钾混匀后使用。
12.较佳的，还包括采样步骤，利用灭菌后的采样器将魔芋胶原料样品采样至无菌袋内后进行封口。
13.较佳的，所述采样步骤为，利用消毒后的剪刀剪开无菌袋的袋口并经过消毒，之后利用勺子将魔芋胶原料样品采样至无菌袋内，最后再利用封口机进行封口。
14.较佳的，所述采样步骤在无菌采样间进行。
15.较佳的，该魔芋胶的蜡样芽孢杆菌简便识别方法，步骤如下：步骤1：制样：在无菌条件下，称取0.5g魔芋胶的原料样品，加入495ml的生理盐水中，搅拌溶解；步骤2：靶向菌预筛：将步骤1中已制备好的溶液置于恒温炉进行加热预煮，待温度升至92℃后保温5min；步骤3：无菌接种：吸取1ml经过步骤2预处理好的溶液于无菌培养皿中，加入15～20ml且冷却至46℃的复配培养基溶液，并转动培养皿使其混合均匀；步骤4：培养：琼脂凝固后，将平板翻转，在36
±
1℃下培养48
±
2h；步骤5：识别：经过培养后的试验菌落形态呈现出“雪花”或“梅花”形状的菌落。
16.本发明通过对魔芋的溶胶处理、样本靶向菌处理(对其进行工艺处理杀保留靶向菌)、接种培养(特定培养基)和定性识别(类似“雪花”或“梅花”形状的菌落)，在最短时间内及时筛查出可能存在风险的包含蜡样芽孢杆菌的原料，降低企业的损失和提高消费者食用安全，可操作性强，简易方便，成本低廉，能够提高企业的生产效率，实用性强。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
18.图1是本发明的各个步骤示意图。
19.图2是本发明培养后的试验菌落形态示意图。
20.图3是本发明在革兰氏染色镜检下的形态示意图。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.参考说明书附图1，一种用于魔芋胶的蜡样芽孢杆菌简便识别方法，包括步骤如下：
23.步骤1：采样
24.点燃酒精灯，把剪刀用75％酒精消毒后，开启或剪开无菌袋的袋口并经过消毒，用灭菌后的采样器，例如勺子或镊子等，进行采样至无菌袋内，魔芋胶原料样品的质量为100g
左右，采样完后使用封口机重新进行封口，贴好采样标签，结果合格后出库使用；由于原料样本的采样直接影响产品结果的有效性，在原料采样中要使用无菌采样，至少要创造采样区域局部无菌空间，每一取样步骤均需进行消毒操作，有条件的可以设立无菌采样间，最大程度避免采样过程带来的污染，保证结果的准确性。
25.步骤2：制样
26.将步骤1中采集好的原料样本送到实验室无菌操作间，称取0.5g魔芋胶的原料样本，加入495ml的生理盐水中，搅拌溶解。
27.步骤3：靶向菌的预筛
28.将步骤2已制备好的溶液置于恒温炉进行加热预煮，待温度升至88℃～92℃，保温5min。
29.由于魔芋胶本身除了可能携带本方法所需测验的的靶向菌外，还有其他普通菌，所以步骤3需要把普通菌落去除，留下靶向菌(即芽孢菌属)。芽孢菌属的特殊性有：含水率低(38％～40％)、芽孢壁厚而致密、dpa(芽孢耐热性所需物质)含量高且含有耐热性酶，因此该菌属在不良环境下例如高温、低温、干燥、光线和化学药物等具有很强的抵抗力，例如，芽孢在120～140℃还能生存几小时，这样，步骤3的预筛环节即可利用芽孢菌属与普通菌落的灭活差异性，通过特定温度进行筛选，将普通菌落进行灭活，预筛出魔芋胶中的芽孢菌属，以便对蜡样芽孢杆菌做进一步的筛查。
30.步骤4：培养基配制
31.本发明的培养基采用平板计数琼脂培养基，外加l
‑
赖氨酸和氯化钾复配而成，其中l
‑
赖氨酸是步骤3中的靶向菌的强化营养成分。
32.所述培养基的复配成分包括：
[0033][0034]
称取平板计数琼脂培养基23.5g，溶于煮沸的1000ml蒸馏水中，搅拌溶解，分装于锥形瓶并置于121℃高压灭菌15min备用。临用时将配制好备用的琼脂培养基加热到溶解，再添加l
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赖氨酸0.5g，氯化钾0.5g混匀。其中，步骤3中加入l
‑
赖氨酸和氯化钾的的复配培养基溶液温度在60℃左右可以开始操作，避免温度过低导致凝胶而无法进行下一步的操作。
[0035]
步骤4：无菌接种
[0036]
用移液枪(使用前先用酒精棉擦拭消毒)吸取1ml预处理好的魔芋胶液于无菌培养皿中，每个样品做至少2个培养皿，及时将已添加l
‑
赖氨酸和氯化钾的15～20ml且冷却至46℃的平板计数琼脂培养基，倾注入培养皿，并转动培养皿使其混合均匀；同时，分别吸取1ml
空白稀释液加入两个无菌培养皿内做空白对照。
[0037]
步骤5：培养
[0038]
琼脂凝固后，将平板翻转，在36
±
1℃下培养48
±
2h。
[0039]
步骤6：识别
[0040]
参见附图2，经过培养后的试验菌落形态呈类似“雪花”或“梅花”形状的菌落，而作为空白对照的无菌平皿内在同样条件下并无该形状的菌落样态呈现。
[0041]
通过不同的菌落形态图谱，识别出魔芋胶是否存在耐热性蜡样芽孢杆菌，从而预先在生产的原料环节控制并剔除导致终产品菌落总数超标的因素，该方法检验周期短，能够缩至2天，简单快速且测样成本低，提前发现魔芋胶中存在的蜡样芽孢杆菌风险，能够有效预防果冻食品安全隐患。
[0042]
由于不同特性微生物在培养基上会形成不同的菌落形态特征，本步骤中“雪花”或“梅花”形状的菌落为蜡样芽孢杆菌，该培养基上的菌落具有区别于其他菌落的形态，本试验下长出的“雪花”或“梅花”状的菌落为蜡样芽孢杆菌，其通过与专业实验室比对均得到了有效验证，其具体验证方式如下：
[0043]
1、同样液的myp琼脂培养
[0044]
按国标gb4789.14食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验执行，在针对性培养基平板表面涂布特定量的同样品的初始悬液，置于平板30℃培养18
‑
48小时，得到结果如下：每0.3ml原液中含有20个菌落；形成红色菌落，周围有晕圈，符合蜡样芽孢菌在myp琼脂上的典型特征。
[0045]
2、对菌落进行形态做观察
[0046]
用接种针挑取选出菌落做革兰氏染色镜检，蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链(如下图3所示)。
[0047]
3、动力试验
[0048]
用接种针挑取选出的菌落穿刺接种于动力培养基中，放置在30℃下培养24
±
2小时，蜡样芽孢杆菌有动力，沿穿刺线成扩散生长。
[0049]
这样，通过上述试验的多次重复和关联验证，确定了本试验方法下在培养基上所呈现出的“雪花”或“梅花”形态的菌属是蜡样芽孢杆菌，进而能够利用本发明的简便方法对魔芋胶在采购验收环节的安全性进行简便识别，实施过程管控，降低食品安全风险。
[0050]
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。