一种集核酸提取和LAMP扩增于一体的可视化检测病毒的方法与流程

一种集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法。


背景技术：

2.在应对传染病的爆发过程中，对传染病病毒的早期筛查和检测十分重要。早期检测进行的越早，后期的控制和治疗越有利。因此，建立快速、方便、准确和高灵敏的检测病毒的方法具有重要的作用。
3.病毒核酸检测主要涉及三个主要过程：(1)核酸提取纯化；(2)核酸扩增；(3)扩增产物检测。对于核酸提取纯化，当前主要是借助裂解液破坏病毒颗粒释放核酸，而后再借助硅胶或表面改性的磁珠对核酸进行吸附而纯化。但是，核酸提取纯化往往操作步骤繁多，耗时耗力。因此，需要开发一种廉价、简便、快速的病毒核酸提取方法，不仅要减少人力物力的投入，而且要与后续核酸扩增和检测相兼容。
4.当前，全球对病毒核酸检测的金标准是实时荧光定量聚合酶链式扩增技术(rt
‑
pcr)，凭借其灵敏的检测限和成熟的应用使其成为病毒检测的首选方法，但是其也存在一定的局限，例如需要借助昂贵的仪器、专业的技术人员、对待检测的病毒核酸纯度要求较高、检测时间长、费用高等等。相较于pcr的温度循环扩增技术，等温扩增技术操作更便捷且省时省力，是病毒快速检测的很好选择。在众多的等温扩增技术中，环介导的等温扩增技术(lamp)特异性强、灵敏度高、扩增速度快、检测结果读取方便，同时对外来干扰物有很强的耐受能力，使其在病毒核酸检测方面有极大的应用潜力。


技术实现要素：

5.本发明的目的为简便、快速且灵敏的检测病毒。
6.本发明首先保护一种集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法，依次可包括如下步骤：
7.(1)将待测样本在高浓度胍盐溶液中释放核酸并被硅羟基磁珠捕获；
8.(2)向捕获了病毒核酸的硅羟基磁珠中加入进行lamp的试剂，得到lamp体系；
9.所述进行lamp的试剂包括进行lamp的反应液、用于检测病毒的lamp引物组和酸碱指示剂；
10.(3)进行lamp反应，之后观察溶液颜色变化：如果溶液颜色变色，则待测样本含有病毒，否则待测样本不含有病毒。
11.所述步骤(1)依次可包括如下步骤：
12.(1
‑
1)将裂解液和硅羟基磁珠混合均匀，裂解液和硅羟基磁珠的体积质量比为1ml:(0.8
‑
1.2)mg(如1ml:(0.8
‑
1.0)mg、1ml:(1.0
‑
1.2)mg、1ml:0.8mg、1ml:1.0mg或1ml:1.2mg)；
13.(1
‑
2)加入与裂解液等体积的待测样本，混合均匀，静置2min以上(如2min、3min、
4min)；
14.(1
‑
3)通过磁分离捕获磁珠；
15.(1
‑
4)用乙醇溶液洗涤磁珠，之后干燥。
16.所述步骤(1
‑
1)中，裂解液和硅羟基磁珠混合均匀具体可为500μl裂解液和50μl浓度为25mg/ml的硅羟基磁珠溶液混合。
17.所述裂解液的溶质及其浓度可为4
‑
6m(如4
‑
5m、5
‑
6m、4m、5m或6m)盐酸胍、1
‑
3m(如1
‑
2m、2
‑
3m、1m、2m或3m)nacl、2.0
‑
3.0mm(如2.0
‑
2.5mm、2.5
‑
3.0mm、2.0mm、2.5mm或3.0mm)edta和18
‑
22mm(如18
‑
20mm、20
‑
22mm、18mm、20mm或22mm)tris，溶剂可为超纯水，ph值可为4.8
‑
5.2(如4.8
‑
5.0、5.0
‑
5.2、4.8、5.0或5.2)。
18.所述步骤(2)中，进行lamp的试剂具体可由进行lamp的反应液、用于检测病毒的lamp引物组和酸碱指示剂组成。
19.所述酸碱指示剂可为苯酚红溶液。
20.当酸碱指示剂为苯酚红溶液，如果步骤(3)中溶液颜色变为黄色，表明待测样本含有病毒；如果步骤(3)中溶液颜色保持红色，表明待测样本不含有病毒。
21.所述苯酚红溶液具体可为0.4％(m/v)苯酚红溶液。
22.所述步骤(1
‑
4)中，乙醇溶液可为80％(v/v)乙醇水溶液。用乙醇溶液洗涤磁珠可为用500μl 80％(v/v)乙醇水溶液洗涤1次以上(如1次、2次、3次)。所述干燥可为室温干燥。
23.所述步骤(3)中，进行lamp反应的参数为63
‑
67℃(如63
‑
65℃、65
‑
67℃、63℃、65℃或67℃)保温20
‑
40min(如20
‑
30min、30
‑
40min、20min、30min或40min)。
24.上述任一所述的方法中，所述病毒可为sars
‑
cov
‑
2或shrimp virus。
25.上述任一所述裂解液也属于本发明的保护范围。
26.上述任一所述裂解液在集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
27.上述应用中，所述病毒可为sars
‑
cov
‑
2或shrimp virus。
28.上述任一所述sars
‑
cov
‑
2可为sars
‑
cov
‑
2假病毒。
29.上述任一所述shrimp virus可为wenzhou shrimp virus 8。
30.本发明提供的集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法具有如下优点：1)硅羟基磁珠在3
‑
5min即可对大体积样本实现核酸富集；2)磁珠吸附的核酸无需洗脱，可直接加入lamp混合液进行扩增，同时借助苯酚红显色，只需恒温加热30min，即可可视化读取检测结果；3)整个检测流程操作简便快速，在35min内即可实现核酸提取到结果读取；4)不依赖于专业仪器设备，对检测环境要求不高且结果可靠；5)检测灵敏度高(检测sars
‑
cov
‑
2假病毒的灵敏度达到200拷贝数/毫升，检测wenzhou shrimp virus 8的灵敏度达到250拷贝数/毫升)；6)可避免传统检测可能造成的交叉感染，可用于便捷式或家庭病毒检测。本发明提供的方法对病毒尤其是具有较强传染性和/或潜在危险的病毒(如sars
‑
cov
‑
2、shrimp virus)的检测具有重要的应用价值。
附图说明
31.图1为集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒方法的流程图。
32.图2为采用实施例1建立的方法检测wenzhou shrimp virus的灵敏度。
33.图3为采用实施例1建立的方法检测sars
‑
cov
‑
2假病毒的灵敏度。
具体实施方式
34.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.wenzhou shrimp virus 8(记载于如下文献中：shi,m.,lin,xd.,tian,jh.et al.redefining the invertebrate rna virosphere.nature 540,539
–
543(2016).https://doi.org/10.1038/nature20167；ncbi reference sequence:nc_032852.1。)为发明人采用高通量测序技术从虾幼苗体内检测获得。
37.sars
‑
cov
‑
2假病毒购自中国计量研究院，编号为bim
‑
rm5203。
38.根据wenzhou shrimp virus 8的核苷酸序列，设计并合成用于检测wenzhou shrimp virus 8的lamp引物组，具体由wf3、wb3、wfip、wbip、wlf和wlb 6条引物组成。各个引物的核苷酸序列如下：
39.wf3：5
’‑
cactctcgcatcatgaccat
‑3’
(seq id no:1)；
40.wb3：5
’‑
tggatgagtctcgcgatga
‑3’
(seq id no:2)；
41.wfip：5
’‑
cttatgggaacggtcccgcgtttcaatcctgagtgggcaa
‑3’
(seq id no:3)；
42.wbip：5
’‑
aattcgctctctgctccttcggcgtagtcgaggggcttct
‑3’
(seq id no:4)；
43.wlf：5
’‑
gcagtcggcgacgtact
‑3’
(seq id no:5)；
44.wlb：5
’‑
aacggccaacgagatagtc
‑3’
(seq id no:6)。
45.根据sars
‑
cov
‑
2假病毒的核苷酸序列，设计并合成用于检测sars
‑
cov
‑
2假病毒的lamp引物组，具体由sf3、sb3、sfip、sbip、slf和slb 6条引物组成。各个引物的核苷酸序列如下：
46.sf3：5
’‑
cggtggacaaattgtcac
‑3’
(seq id no:7)；
47.sb3：5
’‑
cttctctggatttaacacactt
‑3’
(seq id no:8)；
48.slf：5
’‑
ttacaagcttaaagaatgtctgaacact
‑3’
(seq id no:9)；
49.slb：5
’‑
ttgaatttaggtgaaacatttgtcacg
‑3’
(seq id no:10)；
50.sfip：5
’‑
tcagcacacaaagccaaaaatttatctgtgcaaaggaaattaaggag
‑3’
(seq id no:11)；
51.sbip：5
’‑
tattggtggagctaaacttaaagccctgtacaatccctttgagtg
‑3’
(seq id no:12)。
52.裂解液的溶质及其浓度为5m盐酸胍、2m nacl、2.5mm edta和20mm tris，溶剂为超纯水，ph值为5。
53.实施例1、集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法的建立
54.本发明的发明人经过大量实验，建立了一种集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法。具体步骤依次如下：
55.一、将病毒在高浓度胍盐溶液中释放核酸并被硅羟基磁珠捕获
56.1、混合
57.取ep管，加入200μl裂解液和20μl浓度为25mg/ml的硅羟基磁珠溶液(biomag)，充分混合。
58.2、裂解
59.加入200μl待测样本，混合均匀，室温静置3min(目的为裂解)。
60.3、捕获
61.通过磁分离溶液中的磁珠。
62.4、洗涤
63.洗涤磁珠2次；每次使用500μl 80％(v/v)乙醇水溶液洗涤。
64.5、干燥
65.敞开ep管上盖，室温干燥磁珠。
66.二、lamp反应
67.向捕获了病毒核酸的硅羟基磁珠中加入进行lamp的试剂(包括lamp反应液、用于检测病毒的lamp引物组和酸碱指示剂)，65℃保温30min，观察溶液颜色变化，如果溶液颜色变色，则待测样本含有病毒，否则待测样本不含有病毒。
68.所述酸碱指示剂可为0.4％(m/v)苯酚红溶液。当酸碱指示剂为0.4％(m/v)苯酚红溶液时，lamp反应完毕后，如果溶液颜色变为黄色，表明待测样本含有病毒；如果溶液颜色保持红色，表明待测样本不含有病毒。
69.集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒方法的流程图见图1。
70.实施例2、采用实施例1建立的方法检测wenzhou shrimp virus 8的灵敏度
71.一、采用实施例1建立的方法检测wenzhou shrimp virus 8的灵敏度
72.1、分别取18个无核酶的ep管(规格为1.5ml)，每管加入200μl裂解液和20μl浓度为25mg/ml的硅羟基磁珠溶液(biomag)。
73.2、取完成步骤1的18个ep管，分为8组，第1
‑
7组每组2管，第8组4管。进行如下操作：
74.第1组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约107个拷贝数)；
75.第2组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约106个拷贝数)；
76.第3组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约105个拷贝数)；
77.第4组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约104个拷贝数)；
78.第5组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约103个拷贝数)；
79.第6组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约102个拷贝数)；
80.第7组：每管加入200μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约101个拷贝数)；
81.第8组(阴性对照)：每管加入200μl去离子水；
82.之后盖紧所有ep管上盖，左右晃动使溶液混合均匀，室温静置3min。
83.3、完成步骤2后，分别通过磁分离溶液中的磁珠，同时弃上清。
84.4、完成步骤3后，分别洗涤磁珠2次；每次使用500μl 80％(v/v)乙醇水溶液洗涤。
85.5、完成步骤4后，分别敞开ep管上盖，室温干燥磁珠。
86.6、完成步骤5后，分别向ep管中加入25μl neb warmstart colorimetric lamp2
×
master mix、5μlprimer mix(primer mix由wf3、wb3、wfip、wbip、wlf和wlb混合而成，其中
wf3和wb3在primer mix中的浓度为2μm，wfip和wbip在primer mix中的浓度为16μm，wlf和wlb在primer mix中的浓度为4μm)、1μl 0.4％(m/v)苯酚红溶液和19μl无核酶水。最后加入100μl矿物油并盖紧上盖。
87.7、完成步骤6后，分别将ep管置于65℃保温30min，观察溶液颜色变化，并进行如下判断：
88.如果溶液颜色变为黄色，表明反应体系中的相应拷贝数可以被检测出来；
89.如果溶液颜色保持红色，表明反应体系中的相应拷贝数不能被检测出来。
90.检测结果见图2中a(ntc为阴性对照，其余数字为病毒的拷贝数)：第1组—第5组的ep管中溶液颜色均变为黄色，第6组—第8组的ep管中溶液颜色均保持红色。结果表明，采用实施例1建立的方法检测wenzhou shrimp virus 8的灵敏度达到103拷贝数/毫升。
91.二、优化实施例1建立的方法的样本和裂解液加入量后检测wenzhou shrimp virus8的灵敏度
92.1、分别取16个无核酶的ep管(规格为1.5ml)，每管加入500μl裂解液和20μl浓度为25mg/ml的硅羟基磁珠溶液(biomag)。
93.2、取完成步骤1的16个ep管，分为4组，每组4管。进行如下操作：
94.第1组：每管加入500μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约5
×
102个拷贝数)；
95.第2组：每管加入500μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约2.5
×
102个拷贝数)；
96.第3组：每管加入500μl病毒液(含wenzhou shrimp virus 8约1.2
×
102个拷贝数)；
97.第4组(阴性对照)：每管加入500μl去离子水；
98.之后盖紧所有ep管上盖，左右晃动使溶液混合均匀，室温静置3min。
99.3、完成步骤2后，分别通过磁分离溶液中的磁珠，同时弃上清。
100.4、完成步骤3后，分别洗涤磁珠2次；每次使用500μl 80％(v/v)乙醇水溶液洗涤。
101.5、完成步骤4后，分别敞开ep管上盖，室温干燥磁珠。
102.6、完成步骤5后，分别向ep管中加入25μl neb warmstart colorimetric lamp2
×
master mix、5μlprimer mix(primer mix由wf3、wb3、wfip、wbip、wlf和wlb混合而成，其中wf3和wb3在primer mix中的浓度为2μm，wfip和wbip在primer mix中的浓度为16μm，wlf和wlb在primer mix中的浓度为4μm)、1μl 0.4％(m/v)苯酚红溶液和19μl无核酶水。最后加入50μl矿物油并盖紧上盖。
103.7、完成步骤6后，分别将ep管置于65℃保温30min，观察溶液颜色变化，并进行如下判断：
104.如果溶液颜色变为黄色，表明反应体系中的相应拷贝数可以被检测出来；
105.如果溶液颜色保持红色，表明反应体系中的相应拷贝数不能被检测出来。
106.检测结果见图2中b(ntc为阴性对照，其余数字为病毒的拷贝数)：第1组和第2组的ep管中溶液颜色均变为黄色，第3组的4个ep管中3个ep管的溶液颜色变为黄色、1个ep管的溶液颜色保持红色，第4组的ep管中溶液颜色均保持红色。结果表明，当采用实施例1建立的方法检测wenzhou shrimp virus 8时，样本的体积从200μl增加至500μl且裂解液的体积从200μl增加至500μl，检测的灵敏度达到250拷贝数/毫升。
107.据此，将实施例1建立的方法中的样本体积和裂解液体积均由200μl优化为500μl。
108.实施例3、采用优化后的方法检测sars
‑
cov
‑
2假病毒的灵敏度
109.1、分别取12个无核酶的ep管(规格为1.5ml)，每管加入500μl裂解液和20μl浓度为25mg/ml的硅羟基磁珠溶液(biomag)。
110.2、取完成步骤1的12个ep管，分为6组，每组2管。进行如下操作：
111.第1组：每管加入500μl病毒液(含sars
‑
cov
‑
2假病毒约1600个拷贝数)；
112.第2组：每管加入500μl病毒液(含sars
‑
cov
‑
2假病毒约800个拷贝数)；
113.第3组：每管加入500μl病毒液(含sars
‑
cov
‑
2假病毒约400个拷贝数)；
114.第4组：每管加入500μl病毒液(含sars
‑
cov
‑
2假病毒约200个拷贝数)；
115.第5组：每管加入500μl病毒液(含sars
‑
cov
‑
2假病毒约100个拷贝数)；
116.第6组(阴性对照)：每管加入500μl去离子水；
117.之后盖紧所有ep管上盖，左右晃动使溶液混合均匀，室温静置3min。
118.3、完成步骤2后，分别通过磁分离溶液中的磁珠，同时弃上清。
119.4、完成步骤3后，分别洗涤磁珠2次；每次使用500μl 80％(v/v)乙醇水溶液洗涤。
120.5、完成步骤4后，分别敞开ep管上盖，室温干燥磁珠。
121.6、完成步骤5后，分别向ep管中加入25μl neb warmstart colorimetric lamp2
×
master mix、5μl primer mix(primer mix由sf3、sb3、sfip、sbip、slf和slb混合而成，其中sf3和sb3在primer mix中的浓度为2μm，sfip和sbip在primer mix中的浓度为16μm，slf和slb在primer mix中的浓度为4μm)、1μl 0.4％(m/v)苯酚红溶液和19μl无核酶水。最后加入50μl矿物油并盖紧上盖。
122.7、完成步骤6后，分别将ep管置于65℃保温30min，观察溶液颜色变化，并进行如下判断：
123.如果溶液颜色变为黄色，表明反应体系中的相应拷贝数可以被检测出来；
124.如果溶液颜色保持红色，表明反应体系中的相应拷贝数不能被检测出来。
125.检测结果见图3(ntc为阴性对照，其余数字为病毒的拷贝数)：第1组——第4组的ep管中溶液颜色均变为黄色，第5组1个ep管的溶液颜色变为黄色、1个ep管的溶液颜色保持红色，第6组的ep管中溶液颜色均保持红色。结果表明，实施例1建立的方法优化后检测sars
‑
cov
‑
2假病毒的灵敏度达到200拷贝数/毫升。
126.上述结果表明，采用优化后的集核酸提取和lamp扩增于一体的可视化检测病毒的方法分别检测sars
‑
cov
‑
2假病毒和shrimp virus，不仅操作简便、耗时短且检测灵敏度高。本发明提供的方法对病毒检测具有重要的应用价值。
127.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。