一种降解尼古丁的产脲类节杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种降解尼古丁的产脲类节杆菌及其应用。


背景技术：

2.烟草作为一种特殊的农产品，国内产量高，其所产生的废料也多。其中，再造烟叶生产工艺中的废烟液提取液（tobacco waste extract, twe），是将烟草废弃物（烟梗、烟末以及部分低档次烟叶）经粉碎后，进行水提后固液分离并薄膜浓缩获得的液体匀浆，twe理化成分复杂，含有高浓度尼古丁，排放前需要进行尼古丁等有害物质的降解处理，避免破坏生态环境。
3.尼古丁（nicotine），又名烟碱，是一种存在于茄科植物（茄属）中的生物碱，也是烟草的重要成分之一。尼古丁作为一种生物碱，占烟草生物碱总量的95%，是造成香烟成瘾性的主要因素。作为一种剧毒的n
‑
杂环化合物，尼古丁可以穿过生物膜和血脑屏障，与乙酰胆碱受体作用，导致各种不良反应，甚至死亡。美国环境保护署（environmental protection agency, usepa）将尼古丁含量超过500 mg/kg的烟草生产废液指定为
ꢀ“
有毒释放清单”（tri）化学品（dorgan, c. a. statistical record of the environment, 3rd ed），欧盟也已出台了相关规定，规定当尼古丁含量高于 0.05%（w/w）时，将其列为有害危险废弃物，未经处理不得直接排放到环境中，且尼古丁废液需要单独处理，不允许和其他城市垃圾或者废水一起处理。
4.目前，工业上主要采用物理法、化学法和生物法处理各类废弃物中的尼古丁。其中物理法主要为吸附法和萃取法，但其并没有实质上改变尼古丁的结构；化学法种类很多，但其基本原理相同，即利用强氧化剂破坏尼古丁的官能团或化学键的性质从而降解尼古丁，然而尼古丁的性质稳定，沸点274
ꢀº
c，熔点
‑
79
ꢀº
c，导致化学法出现了耗能高、效率低且副产物多，操作不当极易造成二次污染等缺点，更需要注意的是化学法一般伴随着高温高热，甚至是明火，在生产过程中存在一定的安全隐患。在这种情况下，绿色环保可持续的生物法应运而生。生物法利用一些能以尼古丁作为碳氮源的微生物进行尼古丁降解，其具有成本低、易培养、安全环保等优势。
5.目前，国内关于高尼古丁耐受能力的微生物报道较少，相关研究也并未深入展开。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种降解尼古丁的产脲类节杆菌及其应用，产脲类节杆菌（paenarthrobacter ureafaciens）czy1是显示出较好的尼古丁耐受性同时具有一定的尼古丁降解能力。
7.一种降解尼古丁的产脲类节杆菌（paenarthrobacter ureafaciens）czy1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院；保藏日：2021年4月27日；保藏编号为cctcc no: m 2021466。
8.产脲类节杆菌czy1在再造烟叶生产工艺中废烟液水提取的尼古丁降解中的应用。
9.进一步地，应用包括活化、转接培养和接种降解，具体包括：1）活化：将菌株czy1在lb液体培养基中活化；2）转接培养：将活化好的菌株转接入新的lb液体培养基中，培养至对数生长期，离心搅拌，洗涤后重悬；3）将重悬菌液转接到含一定量尼古丁的bsm液体培养基中，在一定温度、ph和接种量条件下培养，取样测定尼古丁浓度和od
600。
10.进一步地，温度范围为30~40℃，ph范围为5~8，初始尼古丁的浓度为2~14g/l，接种量为1~6%（vol/vol）。
11.本发明的有益效果在于：筛选得到的产脲类节杆菌czy1具有高耐受性，可有效降解尼古丁。
附图说明
12.图1为菌株czy1的透视电镜图；图2为czy1系统发育进化树；图3为在尼古丁环境下，不同温度条件的菌株生长情况；图4为在尼古丁环境下，不同ph条件的菌株生长情况；图5为在尼古丁环境下，不同初始尼古丁浓度条件的菌株生长情况；图6为在尼古丁环境下，不同接种量条件的菌株生长情况；图7为菌株在培养基中的生长曲线和降解曲线。
具体实施方式
13.以下结合实施例和说明书附图对本发明做进一步说明。
14.样品来源：产脲类节杆菌（paenarthrobacter ureafaciens）czy1分离自杭州利群环保纸业有限公司的twe样品。
15.实施例1筛选得到产脲类节杆菌（paenarthrobacter ureafaciens）czy1：1）采集废烟液水提液样品：含高浓度尼古丁的废烟液水提液样品采自杭州利群环保纸业有限公司，用灭菌后的培养瓶密封，4℃下保存。
16.2）高耐受尼古丁降解菌株的筛选：对于高耐受尼古丁降解菌株的初步筛选，取25 ml 废烟液水提液用无菌水稀释成100 ml，常温下3000 rpm离心3 min，取上清液常温下5000 rpm离心2 min，弃上清，用5 ml无菌水重悬沉淀，常温下5000 rpm离心2 min，重复两遍，洗去残留的杂质。再用5 ml无菌水重悬沉淀，得到粗菌体。将粗菌体转接入100 ml含8 g/l尼古丁的基本无机盐（basic inorganic salt medium，bsm）液体培养基中，30 ℃下180 rpm培养4天。待培养基浑浊后，接种环蘸取少许菌液在同浓度的bsm固体平板上划线分离，30 ℃倒置培养。待单菌落长出后，将单菌落再次划线到同浓度的bsm固体平板上，30 ℃倒置培养至得到纯化后的单菌落，将纯的单菌落接种至100 ml含8 g/l尼古丁的bsm液体培养基中，30℃，180 rpm下培养4天
复筛验证。
17.实施例2分离菌株形态、生理生化鉴定：使用微生物学实验（第二版，赵斌、林会、何绍江主编）进一步鉴定细菌菌株特征，菌落形状为圆形，黄色，凸形，表面光滑，边缘不透明，革兰氏染色结果显紫色，说明是阳性，电镜图拍摄结果如图1显示，czy1为杆状，没有芽孢，无鞭毛。根据16s rrna确定菌株的菌属，根据伯杰细菌手册确定菌种，将菌株接入lb液体培养基中过夜活化，按照说明书使用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取（生工生物工程，中国上海）总基因组dna。通过使用通用引物，正向引物27f（5
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agagtttgatcctggctcag
ꢀ‑3’
）和反向引物1492r（5
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ggttaccttgttacgactt
‑3’
）扩增16s rrna，使用高保真聚合酶2
ꢀ×ꢀ
phanta master mix（takara）扩增细菌16s rrna序列，pcr反应体系如下：基因组dna 1 μl；2
ꢀ×ꢀ
phanta master mix 25 μl；引物 f（10 μm）2 μl；引物 r（10 μm）2 μl；ddh2o 补充至50 μl。pcr反应程序如下：初始温度95 ℃ 3分钟，95 ℃变性15秒，60 ℃退火15秒，72 ℃ 延伸15秒，循环数30，72 ℃最终伸长5分钟，最终保持在16 ℃，pcr反应液交由北京擎科生物进行测序，得到的序列通过ncbi与blast数据库进行比对，用mega
‑
x构建系统发生树，使用clusterw和邻接方法比对序列数据。
18.生化测试结果见表1：表1菌株czy1生理生化实验结果检测项目czy1菌落颜色淡黄革兰氏染色 最适ph7.0最适温度30过氧化氢酶活性 甲基红反应
‑
脲酶活性 淀粉酶活性
‑
吲哚生成
‑
葡萄糖发酵产酸
‑
果糖发酵产酸
‑
硝酸盐还原反应 明胶水解反应
‑
16s rrna测序结果：通过使用通用引物，正向引物27f（5
’‑ꢀ
agagtttgatcctggctcag
ꢀ‑3’
）和反向引物1492r（5
’‑ꢀ
ggttaccttgttacgactt
‑3’
）扩增16s rrna。pcr反应液测序结果如seq id no:1所示。
19.以此绘制进化树，具体结果如图2所示，结果显示，菌株czy1属于产脲类节杆菌。
20.实施例3分离菌株在尼古丁环境中的最适生长温度实验：采用实施例1的菌株在lb液体培养基中过夜活化后，转接入新的lb液体培养基中，
30 ℃，180 rpm培养至对数生长期，取部分菌液常温下5000 rpm离心2 min，用无菌水洗涤2次，最后用适量无菌水重悬，在初始ph 7.0、初始尼古丁浓度2 g/l、接种量2%（vol/vol）条件下，将重悬菌液转接入含2 g/l尼古丁的bsm液体培养基中，在不同温度（30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃）下180 rpm培养96 h，取样测定其od
600
，每组设置3个平行，确定最适温度，结果如图3所示，最适温度为30℃。
21.实施例4分离菌株在尼古丁环境中的最适生长ph条件：采用实施例3的重悬菌液，在温度30℃、初始尼古丁浓度2 g/l、接种量2%（vol/vol）条件下，在不同ph（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下180 rpm培养96 h，取样测定其od
600
，每组设置3个平行，确定最适ph，由图4所示，最适ph为7.0。
22.实施例5分离菌株在尼古丁环境中的最适初始尼古丁浓度条件：采用实施例3的重悬菌液，在温度30℃、ph7.0、接种量2%（vol/vol）条件下，在不同初始尼古丁浓度（2、4、6、8、10、12、14、16 g/l）下180 rpm培养96 h，取样测定其od
600
，每组设置3个平行，确定最适初始尼古丁浓度，由图5可知，最适初始尼古丁浓度为2 g/l。
23.实施例6分离菌株在尼古丁环境中的最适接种量：采用实施例3的重悬菌液，在温度30℃、ph7.0、初始尼古丁浓度2 g/l条件下，在不同接种量（2%、3%、4%、5%、6%，vol/vol）下180 rpm培养96 h，取样测定其od
600
，每组设置3个平行，确定最适接种量，由图6可知，最适接种量为2%（vol/vol）。
24.由实施例3到实施例6的实验可知，czy1最适生长条件为：温度30℃，ph7.0，接种量2%，初始尼古丁浓度2 g/l，同时初始尼古丁浓度实验结果显示，czy1最大尼古丁耐受能力为14 g/l。
25.实施例7将已在lb液体培养基中活化好的菌株（od
600
=0.6
±
0.05）转接入含2g/l尼古丁的bsm液体培养基中，在最适条件下180 rpm培养，每隔8h取样通过高效液相色谱（hplc）检测尼古丁剩余浓度并绘制降解曲线，同时每隔8h取样检测od
600
并绘制生长曲线。具体操作如下：（1）降解曲线的绘制
①
尼古丁标准溶液的配置及标准曲线的制作：量取一定量的尼古丁原液，使用up水进行稀释，分别配置成0.25 g/l、0.50 g/l、0.75 g/l、1.00 g/l的标准溶液，进样量为10 μl，用hplc分别测定各尼古丁标准溶液的峰面积，每个浓度三个平行，以尼古丁浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。hplc方法如下：使用agilent 1260 hplc检测，进样量为10 μl，流动相为 0.01 m kh2po4（使用up水配置，调节ph为3.0）：甲醇=90：10，流速为1.0 ml/min，色谱柱为agilent sb
‑
c18 column （4.6 mm
ꢀ×ꢀ
150 mm），柱温室温，使用二极管阵列（dad）检测器，检测波长为254 nm。
26.②
样品剩余尼古丁浓度的检测：每隔8 h（包括0 h）取2 ml菌液，常温下12000 rpm离心10 min，用一次性取样器吸取适量上清过0.22 μm滤膜，放入液相瓶中。通过
①
中的方法获得样品的峰面积，再通过尼古丁标准曲线计算得到剩余尼古丁浓度，并以此绘制尼古
丁降解曲线。
27.（2）生长曲线的绘制每隔8h（包括0h）取2ml菌液，常温下12000 rpm离心10 min，弃尽上清液。用相同体积（2ml）的无菌水重悬菌体，通过紫外分光光度计检测600 nm波长下的od
600
，并以此绘制生长曲线。
28.结果如图7所示，培养104h后，czy1可完全降解2g/l尼古丁，同时czy1可生长至od
600
≈3.0。