缺血性脑卒中的诊断标志物的制作方法

1.本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及包括缺血性脑卒中的诊断标志物或其组合。


背景技术：

2.脑卒中系脑血管病的主要临床类型，是一种突发性脑组织血液循环障碍性疾病，因各种诱发因素引起的动静脉狭窄、闭塞或破裂致急性脑组织血液循环障碍，临床表现为短暂性或永久性神经功能缺损症状与体征的一组疾病。脑卒中为全球三大致死性疾病之一，其高发病率、高病残率和高病死率给患者、家庭和社会带来沉重负担和痛苦。临床以缺血性卒中相对常见，表现为局部脑组织缺氧、缺血和神经坏死的临床病理过程，其发病率占脑卒中的60％～80％。
3.缺血性卒中临床常用的诊断分类名词较多，包括脑梗塞(或称脑梗死)、脑血栓形成、脑栓塞等。脑出血患者多会表现剧烈头痛、频繁呕吐、半身瘫痪甚至昏迷不醒等症状，严重者甚至很快死亡。蛛网膜下腔出血最常见的原因是颅内动脉瘤破裂或脑血管畸形破裂引起，一般发病较急，头痛剧烈，以中青年人居多。发生缺血性卒中一般症状较平缓，绝大多数患者意识清楚，表现为半身瘫痪或无力、言语困难、肢体麻木等。
4.虽然脑卒中的诊断多为临床诊断，但神经影像学检查和床旁快速血糖检查还是很有必要的。在脑梗开始几小时内，即便是前循环大面积脑梗，其ct上的证据也是很微小的，包括受累区域脑沟或岛叶皮层带状结构的消失、灰白质交界的消失以及大脑中动脉的高密度影。在脑缺血6到12小时，中到大面积的梗死开始表现为ct可见的低密度灶；小的梗死(如腔隙性梗死)可能仅能在mri上发现。因此，当怀疑缺血性脑卒中时，在行最初的ct检查后可立即查弥散加权mri(对早期缺血灶敏感)。
5.脑卒中是中老年常见的急性脑血管病，并出现年轻化的趋势。据统计，中国每年死于脑血管疾病近300万人，高于欧美国家4到5倍，是日本的3.5倍，甚至高于泰国、印度等发展中国家；发病率以每年8.7％的速率上升，复发率超过30％，5年内再次发生率达54％；脑卒中患者幸存者中75％不同程度丧失劳动能力，40％重残。


技术实现要素：

6.本发明的发明人通过对收集的患者样本测序分析和对数据集数据分析，筛选、验证、提供了可以高效准确诊断中枢神经系统疾病的标志物、标志物组合。同时提供了检测中枢神经系统疾病的试剂盒、系统及其应用。
7.一方面本发明提供了一种诊断中枢神经系统疾病的标志物组合，所述标志物组合中包含cacna1e、pdcd1、usp14中的任意两个或三个。
8.优选地，所述中枢神经系统疾病包括脑卒中、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、脱髓鞘病、多发性硬化、精神分裂症、抑郁症和中枢神经损伤。
9.优选地，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。
10.优选地，所述中枢神经系统疾病是缺血性脑卒中。
11.优选地，所述受试者为哺乳动物。例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。
12.优选地，所述受试者为人。
13.优选地，所述cacna1e在患者中高表达。
14.优选地，所述pdcd1在患者中低表达。
15.优选地，所述usp14在患者中低表达。
16.另一方面，本发明提供了检测前述标志物组合中至少任意一种标志物表达量的试剂盒。
17.优选地，所述至少任意一种包括两种、三种。
18.优选地，所述至少任意一种标志物包括以下的标志物或标志物组合cacna1e、pdcd1、usp14、cacna1e pdcd1、pdcd1 usp14、cacna1e usp14、cacna1e pdcd1 usp14；其中“ ”代表联合使用，在本文其他部分“_”也表示相同的含义。
19.优选地，所述表达量包括mrna表达量和/或蛋白表达量。
20.优选地，所述试剂盒中包括检测mrna表达量的试剂。
21.优选地，所述试剂盒中包括检测蛋白表达量的试剂。
22.优选地，所述检测mrna表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于pcr的定量检测方法、southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台。
23.优选地，所述检测mrna表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。
24.优选地，所述探针可以是dna、rna、dna
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rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15
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25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
25.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：蛋白质印迹(western blot法)、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片。
26.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括特异性抗体。
27.优选地，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。
28.优选地，所述抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或带有修饰的抗体，具体地，所述抗体包括嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
29.优选地，所述试剂盒中还可以包括mrna表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂、mrna表达量辅助检测仪器、蛋白表达量辅助检测仪器。
30.优选地，所述mrna表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂；rna提取试剂；逆转录试剂；cdna扩增试剂；制备标准曲线所用的标准品；阳性对照品；阴性对照品。
31.优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。
32.另一方面本发明提供了一种诊断中枢神经系统疾病的系统，所述系统包括用于输入前述检测标志物组合中至少任意一种标志物表达量的输入装置、用于输出诊断结果的输出装置。
33.优选地，所述系统还可以包括检测标志物组合的表达量的检测装置。
34.优选地，所述检测装置包括实时定量pcr仪、高通量测序平台、检测芯片和芯片信号读取器。
35.优选地，所述芯片包括检测标志物表达量的探针。
36.优选地，所述芯片上还包括内参探针。
37.优选地，所述内参包括gapdh或β
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actin。
38.优选地，所示芯片包括蛋白芯片和/或基因芯片。
39.优选地，所述系统还包括评估结果发送单元，所述评估结果发送单元可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
40.另一方面本发明提供了诊断中枢神经系统疾病的方法，所述方法包括检测检测检测前述标志物组合中至少任意一种标志物表达量。
41.优选地，所述方法还包括收集来着于受试者的步骤。
42.优选地，所述样品包括：组织、血液尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
43.优选地，所述血液包括：血清、血浆、全血。
44.优选地，所述血液是全血。
45.优选地，所述方法还包括在检测之后通过表达量的检测结果判断受试者的患病情况的步骤。
46.另一方面，本发明提供了检测前述cacna1e、pdcd1、usp14中至少任意一个的表达量的试剂、前述试剂盒、前述系统在制备诊断受试者是否患有中枢神经系统疾病的产品中的应用。
附图说明
47.图1为差异基因的差异箱线图，a是usp14，b是pdcd1，c是cacna1e。
48.图2为标志物usp14在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
49.图3为标志物pdcd1在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
50.图4为标志物cacna1e在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
51.图5为标志物组合pdcd1_usp14在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
52.图6为标志物组合cacna1e_usp14在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
53.图7为标志物组合cacna1e_pdcd1在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
54.图8为标志物组合cacna1e_pdcd1_usp14在诊断缺血性脑卒中时的roc曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
具体实施方式
55.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
56.实施例1、筛选并验证标志物组合的诊断效果
57.收集病患的血液样品，患者信息如表1所示，进行测序，筛选在健康者和患者间差异表达的基因；差异表达分析使用软件：ballgown(http://cole
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trapnell
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la b.github.io/cufflinks/cuffdiff/index.html)。用差异表达筛选标准进行筛选，得到差异基因479个，其中表达上调基因346个，表达下调的基因有133个。
58.表1.样本信息
[0059][0060]
下载网络数据库gse22255，其是缺血性中风的血液基因组表达谱，在数据库的基因表达谱中进行同样的差异分析；筛选在患者样本和数据库中检测的变化一致的标志物，筛选得到的部分标志物的差异表达箱线图如图1所述，其在患者体内的表达变化如表2所示。
[0061]
表2.差异表达基因
[0062] 前期研究gse22255cacna1eupuppdcd1downdownusp14downdown
[0063]
利用数据库的数据，对表2所示的标志物进行排列组合，进一步提高准确度，每个
标志物或标志物的组合在诊断时的auc值如表3所示，roc曲线依次如图2
‑
8所示。
[0064]
表3.诊断的auc值
[0065]
标志物/标志物组合auc图usp140.7572pdcd10.713cacna1e0.7574pdcd1_usp140.81755cacna1e_usp140.77756cacna1e_pdcd10.85257cacna1e_pdcd1_usp140.8488
[0066]
由表3的auc结果可知cacna1e、pdcd1、usp14每个标志物单独都可以作为诊断脑卒中的标志物，并且其组合后auc值会进一步升高，获得更高的诊断准确性，任意两两结合都有协同作用，即使单独的标志物的auc值都约大于0.7，其组合后都明显的提高。
[0067]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。