一种新型虫草素烷酰胺衍生物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及虫草素烷衍生物领域，特别是一种新型虫草素烷酰胺衍生物及其制备方法和在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用。


背景技术：

2.虫草素(cordycepin)又称虫草菌素、蛹虫草菌素、3
’‑
脱氧腺苷，是第一个从真菌分离出来的核苷类抗菌素。自1951年cunningham等从蛹虫草的培养菌液中分离得到虫草素以来，其多种生物活性逐渐被人们所认识，近年来成为研究热点之一。
3.虫草素的分子式为c
10
h
13
n5o3，是腺苷的类似物，显碱性，为针状或片状结晶，现代药理学表明，虫草素及衍生物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自由基等作用，因此，通过对虫草素化合物结构进行改造，寻找活性更强的虫草素衍生物的研究工作具有重大意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是要提供一种新型虫草素烷酰胺衍生物及其制备方法和应用。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.一种新型虫草素烷酰胺衍生物，所述新型虫草素烷酰胺衍生物的架构式如(i)所示：
[0007][0008]
其中，r为：
[0009]
的一种。
[0010]
进一步地，所述新型虫草素烷酰胺衍生物的具体化合物的结构式为：
[0011][0012][0013]
本发明的新型虫草素烷酰胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
s1、将虫草素、叔丁基二甲基氯硅烷、4
‑
二甲氨基吡啶溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在碱性条件下反应，得到化合物(ii)：
[0015][0016]
s2、将化合物(ii)、r、2
‑
(7
‑
氮杂苯并三氮唑)
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯、1
‑
羟基苯并三唑、n,n
‑
二异丙基乙胺溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺和二氯甲烷中，得到通式(iii)化合物：
[0017][0018]
其中，r为：
[0019][0020][0021]
中的一种；
[0022]
s3、所得反应体系经浓缩，饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯、饱和盐水萃取，有机相干燥，过滤，浓缩，得反应粗品；
[0023]
s4、所得反应粗品经柱层析分离，梯度洗脱得化合物iii1‑
iii6：
[0024][0025][0026]
s5、将化合物iii1‑
iii6中的任意一个与1.0m四丁基氟化铵在四氢呋喃试剂溶于四氢呋喃中，得到通式(i)所示的化合物：
[0027][0028]
s6、所得反应体系经浓缩，乙酸乙酯和饱和盐水萃取，有机相干燥，过滤，浓缩，得反应粗品；
[0029]
s7、所得反应粗品经柱层析分离，梯度洗脱得化合物i1‑
i6：
[0030][0031]
优选地，所述虫草素来源于化学合成或从蛹虫草和冬虫夏草中提取分离。
[0032]
优选地，所述r来源于化学合成或天然植物提取分离。
[0033]
本发明的新型虫草素烷酰胺衍生物在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用。
[0034]
与现有技术相比，本发明在虫草素的伯胺基处通过酰胺键连接不同的烷基链和芳香基团，首次合成了一系列新型虫草素烷酰胺衍生物，合成步骤简单，总产率较高。本发明制备的新型虫草素烷酰胺衍生物对hela细胞的增殖抑制表现出更好的活性。
具体实施方式
[0035]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
[0036]
[0037]
实施例1制备嘌呤
‑6‑
花生四烯酰胺基
‑9‑
n
‑
(3
’‑
脱氧)呋喃核糖苷(i1)
[0038]
将虫草素(590mg，2348mmol)、咪唑(15.50mmol)及4
‑
二甲氨基吡啶dmap(0.235mmol)溶解于dmf(5ml)中，0℃下在上述溶液中添加叔丁基二甲基氯硅烷tbscl(7.748mmol)，反应在室温下搅拌16h。用饱和的nh4cl水溶液使反应猝灭，用etoac萃取粗混合物。合并的有机层用h2o洗涤，饱和的nacl水溶液，然后在真空中浓缩。通过快速层析法纯化(etoac：己烷＝1：2)得到白色固体化合物ii，产率85％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.33(d,j＝2.0,4.0hz,2h),6.01(s,1h),5.72(s,2h),4.62
‑
4.63(m,1h),4.54
‑
4.58(m,1h),4.12(dd,j＝4.0,12.0hz,1h),3.78(dd,j＝4.0,8.0hz,1h),2.22
‑
2.29(m,1h),1.83
‑
1.88(m,1h),0.95(s,9h),0.90(s,9h),0.14(d,j＝4.0hz,9h),0.08(s,3h).
[0039]
将花生四烯酸(381mg，1.251mmol)溶解于无水二氯甲烷(4ml)和dmf(0.02ml)的混合溶液中，加入1
‑
羟基苯并三唑水合物(1.50mmol)、2
‑
(1h
‑7‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1，1，3，3
‑
四甲基六氟磷酸脲(1.50mmol)、ii(1.251mmol)和二异丙基乙胺(3.98mmol)。反应混合物在室温下搅拌72小时，在真空中浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并提取物用盐水洗涤，mgso4干燥，抽滤将滤液在旋转蒸发下浓缩。粗产物经硅胶层析纯化，用10％乙酸乙酯在环己烷中洗脱，得到黄色油状iii1，产率76％，回收起始物ii(80mg)，用于下一步反应。
[0040]
将iii1(357mg，0.465mmol)溶解于干燥thf(4ml)中，在0℃下加入n
‑
bu4nf(1.0m thf溶液，1.18ml，1.18mmol)，反应在室温下搅拌90min。旋转蒸发混合物，用盐水和乙酸乙酯萃取混合物。合并有机物用硫酸镁干燥，抽滤并在真空下浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化，用2.5％甲醇二氯甲烷洗脱，得到纯i1白色粉末，产率75％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.96(s,1h),8.51(s,1h),8.16(s,1h),5.81(d,j＝4.0hz,1h),5.29
‑
5.42(m,8h),5.04(s,1h),4.94
‑
4.99(m,1h),4.57(s,1h),4.12(s,1h),4.01(d,j＝12.0hz,1h),3.63(d,j＝12.0hz,1h),2.78
‑
2.86(m,6h),2.52
‑
2.58(m,2h),2.24
‑
2.31(m,1h),2.18
‑
2.24(m,3h),2.01
‑
2.07(m,2h),1.81
‑
1.87(m,2h),1.25
‑
1.37(m,6h),0.86
‑
0.89(m,3h)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ151.8,149.6,142.3,130.5,129.0,128.9,128.2,128.2,127.8,127.5,93.3,80.7,74.3,64.5,37.3,33.8,31.9,31.5,31.4,30.2,29.7,29.4,27.2,26.6,25.7,24.6,22.7,22.6,14.1；(esi )(m h

)m/z 538.2151；anal.calcd for c
30
h
43
n5o4.
[0041]
实施例2制备嘌呤
‑6‑
α
‑
亚麻酰胺基
‑9‑
n
‑
(3
’‑
脱氧)呋喃核糖苷(i2)
[0042]
将α
‑
亚麻酸(348mg，1.251mmol)溶解于无水二氯甲烷(4ml)和dmf(0.02ml)的混合溶液中，加入1
‑
羟基苯并三唑水合物(1.50mmol)、2
‑
(1h
‑7‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1，1，3，3
‑
四甲基六氟磷酸脲(1.50mmol)、ii(1.251mmol)和二异丙基乙胺(3.98mmol)。反应混合物在室温下搅拌72小时，在真空中浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并提取物用盐水洗涤，mgso4干燥，抽滤将滤液在旋转蒸发下浓缩。粗产物经硅胶层析纯化，用10％乙酸乙酯在环己烷中洗脱，得到黄色油状iii2，产率75％，回收起始物ii(100mg)。
[0043]
将iii2(344mg，0.465mmol)溶解于干燥thf(4ml)中，在0℃下加入n
‑
bu4nf(1.0m thf溶液，1.18ml，1.18mmol)，反应在室温下搅拌90min。旋转蒸发混合物，用盐水和乙酸乙酯萃取混合物。合并有机物用硫酸镁干燥，抽滤并在真空下浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化，用2.5％甲醇二氯甲烷洗脱，得到纯i2白色粉末，产率74％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.04(s,1h),8.48(s,1h),8.15(s,1h),5.80(d,j＝4.0hz,1h),5.26
‑
5.40(m,6h),5.11(s,1h),4.95
(q,j＝8.0,12.0hz,1h),4.56(s,1h),4.35(s,1h),3.96(d,j＝16.0hz,1h),3.62(d,j＝12.0hz,1h),2.74
‑
2.80(m,2h),2.49
‑
2.55(m,1h),2.22
‑
2.29(m,1h),2.00
‑
2.06(m,6h),1.68
‑
1.73(m,2h),1.23
‑
1.35(m,10h),0.80
‑
0.86(m,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.0,151.7,150.0,149.5,142.5,130.2,130.0,128.0,127.9,122.7,93.3,80.7,74.2,64.4,37.9,33.7,31.9,31.5,29.7,29.6,29.3,29.2,29.2,27.2,25.6,24.8,22.6,14.1；(esi )(m h

)m/z 512.3751；anal.calcd for c
28
h
41
n5o4.
[0044]
实施例3制备嘌呤
‑6‑
亚油酰胺基
‑9‑
n
‑
(3
’‑
脱氧)呋喃核糖苷(i3)
[0045]
将亚油酸(233mg，1.251mmol)溶解于无水二氯甲烷(4ml)和dmf(0.02ml)的混合溶液中，加入1
‑
羟基苯并三唑水合物(1.50mmol)、2
‑
(1h
‑7‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1，1，3，3
‑
四甲基六氟磷酸脲(1.50mmol)、ii(1.251mmol)和二异丙基乙胺(3.98mmol)。反应混合物在室温下搅拌72小时，在真空中浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并提取物用盐水洗涤，mgso4干燥，抽滤将滤液在旋转蒸发下浓缩。粗产物经硅胶层析纯化，用10％乙酸乙酯在环己烷中洗脱，得到黄色油状iii3，产率75％，回收起始物ii(100mg)。
[0046]
将iii3(345mg，0.465mmol)溶解于干燥thf(4ml)中，在0℃下加入n
‑
bu4nf(1.0m thf溶液，1.18ml，1.18mmol)，反应在室温下搅拌90min。旋转蒸发混合物，用盐水和乙酸乙酯萃取混合物。合并有机物用硫酸镁干燥，抽滤并在真空下浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化，用2.5％甲醇二氯甲烷洗脱，得到纯i3白色粉末，产率75％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.05(s,1h),8.49(s,1h),8.17(s,1h),5.81(d,j＝4.0hz,1h),5.29
‑
5.41(m,4h),5.12(s,1h),4.96(q,j＝8.0,12.0hz,1h),4.57(s,1h),4.36(s,1h),4.00(d,j＝16.0hz,1h),3.63(d,j＝12.0hz,1h),2.75
‑
2.81(m,2h),2.50
‑
2.56(m,1h),2.23
‑
2.30(m,1h),2.01
‑
2.07(m,6h),1.70
‑
1.75(m,2h),1.25
‑
1.37(m,14h),0.82
‑
0.89(m,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.0,151.7,150.0,149.5,142.5,130.2,130.0,128.0,127.9,122.7,93.3,80.7,74.2,64.4,37.9,33.7,31.9,31.5,29.7,29.6,29.3,29.2,29.2,27.2,25.6,24.8,22.6,14.1；(esi )(m h

)m/z 514.7621；anal.calcd for c
28
h
43
n5o4.
[0047]
实施例4制备嘌呤
‑6‑
王浆酰胺基
‑9‑
n
‑
(3
’‑
脱氧)呋喃核糖苷(i4)
[0048]
将王浆酸(253mg，1.251mmol)溶解于无水二氯甲烷(4ml)和dmf(0.02ml)的混合溶液中，加入1
‑
羟基苯并三唑水合物(1.50mmol)、2
‑
(1h
‑7‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1，1，3，3
‑
四甲基六氟磷酸脲(1.50mmol)、ii(1.251mmol)和二异丙基乙胺(3.98mmol)。反应混合物在室温下搅拌120小时，在真空中浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并提取物用盐水洗涤，mgso4干燥，抽滤将滤液在旋转蒸发下浓缩。粗产物经硅胶层析纯化，用10％乙酸乙酯在环己烷中洗脱，得到白色固体iii4，产率40％，回收起始物ii(50mg)。
[0049]
将iii4(301mg，0.465mmol)溶解于干燥thf(5ml)中，在0℃下加入n
‑
bu4nf(1.0m thf溶液，1.18ml，1.18mmol)，反应在室温下搅拌90min。旋转蒸发混合物，用盐水和乙酸乙酯萃取混合物。合并有机物用硫酸镁干燥，抽滤并在真空下浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化，用5％甲醇二氯甲烷洗脱，得到纯i4白色粉末，产率60％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.21(s,1h),8.49(s,1h),8.17(s,1h),6.27
‑
6.30(m,1h),5.90
‑
5.91(m,1h),5.81(d,j＝4.0hz,1h),5.23(s,1h),4.94(s,1h),4.57(s,1h),4.00(d,j＝16.0hz,1h),3.63(d,j＝12.0hz,1h),3.37
‑
3.43(m,4h),2.10
‑
2.16(m,3h),1.66
‑
1.80(m,1h),1.48
‑
1.54(m,2h),1.25
‑
1.37(m,8h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ167.0,151.7,150.4,149.5,142.6,142.2,130.3,129.6,
94.3,80.7,74.2,64.4,62.8,37.9,32.7,32.5,29.7,29.7,29.4,26.0；(esi )(m h

)m/z 420.3311；anal.calcd for c
20
h
29
n5o5.
[0050]
实施例5制备嘌呤
‑6‑
阿魏酰胺基
‑9‑
n
‑
(3
’‑
脱氧)呋喃核糖苷(i5)
[0051]
将阿魏酸(243mg，1.251mmol)溶解于无水二氯甲烷(4ml)和dmf(0.02ml)的混合溶液中，加入1
‑
羟基苯并三唑水合物(1.50mmol)、2
‑
(1h
‑7‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1，1，3，3
‑
四甲基六氟磷酸脲(1.50mmol)、ii(1.251mmol)和二异丙基乙胺(3.98mmol)。反应混合物在室温下搅拌120小时，在真空中浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并提取物用盐水洗涤，mgso4干燥，抽滤将滤液在旋转蒸发下浓缩。粗产物经硅胶层析纯化，用10％乙酸乙酯在环己烷中洗脱，得到白色固体iii5，产率30％，回收起始物ii(60mg)。
[0052]
将iii5(305mg，0.465mmol)溶解于干燥thf(4ml)中，在0℃下加入n
‑
bu4nf(1.0m thf溶液，1.18ml，1.18mmol)，反应在室温下搅拌90min。旋转蒸发混合物，用盐水和乙酸乙酯萃取混合物。合并有机物用硫酸镁干燥，抽滤并在真空下浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化，用5％甲醇二氯甲烷洗脱，得到纯i5白色粉末，产率60％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.11(s,1h),8.70(s,1h),8.48(s,1h),8.15(s,1h),7.08
‑
7.11(m,1h),7.00(s,1h),6.96
‑
6.97(m,1h),6.77
‑
6.79(m,2h),5.81(d,j＝4.0hz,1h),5.13(s,1h),4.94(s,1h),4.00(d,j＝16.0hz,1h),3.83(s,3h),3.63(d,j＝12.0hz,1h),2.76
‑
2.82(m,2h),2.10
‑
2.16(m,1h),1.66
‑
1.80(m,1h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)167.0,151.7,150.4,149.5,149.0,147.7,142.6,142.2,141.0,131.1,121.7,116.8,110.7,94.3,80.7,74.2,64.4,62.8,56.0,37.9；(esi )(m h

)m/z 428.0331；anal.calcd for c
20
h
21
n5o6.
[0053]
实施例6制备嘌呤
‑6‑
肉桂酰胺基
‑9‑
n
‑
(3
’‑
脱氧)呋喃核糖苷(i6)
[0054]
将肉桂酸(185mg，1.251mmol)溶解于无水二氯甲烷(4ml)和dmf(0.02ml)的混合溶液中，加入1
‑
羟基苯并三唑水合物(1.50mmol)、2
‑
(1h
‑7‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1，1，3，3
‑
四甲基六氟磷酸脲(1.50mmol)、ii(1.251mmol)和二异丙基乙胺(3.98mmol)。反应混合物在室温下搅拌96小时，在真空中浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并提取物用盐水洗涤，mgso4干燥，抽滤将滤液在旋转蒸发下浓缩。粗产物经硅胶层析纯化，用10％乙酸乙酯在环己烷中洗脱，得到白色固体iii6，产率50％，回收起始物ii(60mg)。
[0055]
将iii6(284mg，0.465mmol)溶解于干燥thf(3ml)中，在0℃下加入n
‑
bu4nf(1.0m thf溶液，1.18ml，1.18mmol)，反应在室温下搅拌90min。旋转蒸发混合物，用盐水和乙酸乙酯萃取混合物。合并有机物用硫酸镁干燥，抽滤并在真空下浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化，用2.5％甲醇二氯甲烷洗脱，得到纯i6白色粉末，产率70％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.11(s,1h),8.47(s,1h),8.13(s,1h),7.26
‑
7.32(m,3h),7.05
‑
7.09(m,2h),7.01
‑
7.04(m,1h),6.94
‑
6.97(m,1h),5.80(d,j＝4.0hz,1h),5.12(s,1h),4.93(s,1h),3.98(d,j＝16.0hz,1h),3.62(d,j＝12.0hz,1h),2.74
‑
2.80(m,2h),2.08
‑
2.14(m,1h),1.64
‑
1.78(m,1h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)167.0,151.7,150.4,149.5,142.2,131.1,130.2,128.6,128.6,128.4,128.4,127.8,118.7,94.2,80.7,74.0,64.3,62.7,37.8；(esi )(m h

)m/z 382.1415；anal.calcd for c
19
h
19
n5o4.
[0056]
实施例7
[0057]
本实施例的新型虫草素烷酰胺衍生物在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用，为了验证其抑制肿瘤细胞增殖效果，进行如下实验：
[0058]
实验所用细胞：宫颈癌hela和人肝癌hepg2细胞。
[0059]
主要试剂和仪器：
[0060]
cck8细胞活性检测试剂，胰蛋白酶；dmem培养基均购自gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物有限公司产品。co2培养箱(371型)，thermo公司生产；细胞培养瓶和96孔细胞培养板，德国nunclon公司生产；倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产。
[0061]
以上述实施例合成的虫草素烷酰胺类似物i1‑
i6为例对2种癌细胞的抑制作用：
[0062]
取对数期生长的宫颈癌hela和人肝癌hepg2细胞，胰酶消化后，离心，弃上清，用新鲜的完全培养基重悬成细胞悬液，调整细胞数以1000～2000个/孔接种于96孔板中，每孔100μl，设置不加药组，70％dmso组，阿糖胞苷组和虫草素烷酰胺类似物组。待24h细胞增殖至70％～80％小孔体积，分别加入不同浓度的虫草素烷酰胺类似物组和阿糖胞苷组，使药物浓度为0.75、1.5、3、12.5和50μmol/l，每个浓度设置3个复孔以及70％dmso组。在加药44h后每孔分别加入10μlcck8检测液，加cck8检测液4小时后，酶标仪450nm波长检测各孔的吸光度值。细胞抑制率＝(1
‑
实验组吸光度值/对照组吸光度值)
×
100％。应用量效关系计算半数抑制浓度ic
50
。
[0063]
实验数据分析
[0064]
实验数据使用graphpad prism 5软件进行分析，实验结果统一采用均数
±
标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05，以p<0.05为有统计学意义。
[0065]
实验结果
[0066]
虫草素烷酰胺类似物i1对2种癌细胞的抑制影响
[0067]
cck8细胞活力测定结果显示，虫草素烷酰胺类似物i1对宫颈癌hela细胞生长有明显抑制作用，并且呈剂量依赖性，48h的ic
50
值为(4.82
±
1.99)μmol/l，与未处理组比较，各处理组细胞活力的差异有统计学意义(p<0.05)，且随药物剂量增高细胞增殖抑制率明显升高；虫草素烷酰胺类似物i1对人肝癌hepg2细胞生长呈轻度抑制作用，48h的ic
50
值为(47.02
±
1.71)μmol/l，与未处理组比较，各处理组细胞活力的差异有统计学意义(p<0.05)见表1虫草素烷酰胺类似物i1对宫颈癌hela和人肝癌hepg2细胞的抑制作用。
[0068]
表1
[0069]
[0070][0071]
虫草素烷酰胺类似物i1‑
i6对宫颈癌hela细胞的抑制影响
[0072]
cck8细胞活力测定结果显示，虫草素烷酰胺类似物i1对宫颈癌hela细胞生长48h的ic
50
值为(4.82
±
1.99)μmol/l，与阳性对照盐酸阿糖胞苷组48h的ic
50
值为(86.27
±
11.85)μmol/l比较，具有明显的抑制宫颈癌hela细胞生长的作用，与虫草素以及其它类似物比较也具有明显的抑制作用，各处理组细胞活力的差异有统计学意义(p<0.05)见表2虫草素烷酰胺类似物i1‑
i6对宫颈癌hela的抑制作用。
[0073]
表2
[0074][0075]
综述，宫颈癌在女性最常见的癌症中排名第二，它也是不发达地区女性因癌症死亡的主要原因之一，新疆是宫颈癌的高发地区。宫颈癌是高度恶性癌症，易于转移和侵袭，并且预后很差。早期通常没有明显的症状和体征，容易忽视和漏诊。即使宫颈癌的诊断技术和治疗策略已经得以提升，但宫颈癌的死亡率依然很高，肿瘤侵袭和转移是导致宫颈癌患者死亡的主要原因。虫草素具有很好的抗肿瘤、抗病毒和抑菌活性，本项目在虫草素的伯胺基处通过酰胺键连接不同的烷基链和芳香基团，合成的虫草素烷酰胺类似物i1具有明显的对宫颈癌hela细胞的增殖抑制效果；同样的合成的虫草素烷酰胺类似物i2‑
i6也具有潜在的对hela细胞的增殖抑制效果。
[0076]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。