有共同轻链的双互补位和多互补位抗体和使用方法与流程

plos one10(5):e0124135,2015)。后一种情况的实例是dvd
‑
ig分子，其中两个互补位 都靶向her2，但是在两个不同的表位(gu j.et al.,plos one 9(5):e97292,2014)，相比 于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合用于抗曲妥珠单抗治疗的异种移植肿瘤模型表现出 功效的提升。
8.然而，在识别her2上的两个表位的双互补位dvd
‑
ig分子的情况下，虽然该dvd
‑
ig 分子已被证明是多个癌细胞系的拮抗剂，但已被证明对n87癌细胞系具有激动活性(guet al.,2014)。
9.可替代地，双互补位分子也可以以其他形式构建，诸如具有两个不同重链的异二聚 体mab。当使用两个不同轻链时，除了重链和轻链的正确配对以产生互补位a和互补 位b之外，还可能出现不正确的重链
‑
轻链配对而导致非功能互补位。
10.克服不正确的重链和轻链配对的策略之一是使用共同轻链。该技术领域中已经公开 了由曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计的靶向her2的结构域ii和结构域iv两者。 us20170029529公开了具有除使用曲妥珠单抗的cdr
‑
l3外，使用基于帕妥珠单抗轻链 的共同轻链的异二聚体形式的双互补位分子。
11.wo2016110267公开了另一种双互补位分子，具有使用基于帕妥珠单抗或曲妥珠单 抗的轻链的共同轻链的异二聚体形式，分别在cdr
‑
l1中的残基31处有thr或ile替换， 以及在cdr
‑
l3中的残基94处有thr或tyr替换。在这种情况下，无法同时保持两个 互补位的结合亲和性。


技术实现要素：

12.本公开的实施方式涉及对同一抗原或不同抗原中的至少两个表位具有特异性的多 互补位抗体构建体，特别是双互补位抗体构建体。这些抗体构建体包括能够与至少两个 不同的重链可变结构域配对以形成功能互补位的共同的轻链。多互补位抗体构建体可用 于治疗癌症，在该癌症中由抗体构建体互补位识别(结合)的抗原在肿瘤中表达。
13.在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括识别(结合)her2的结构域ii的第 一互补位。在一些实施方式中，该互补位源自帕妥珠单抗。
14.在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括识别(结合)her2的结构域iv的 第二互补位。在一些实施方式中，该互补位源自曲妥珠单抗。
15.在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括识别(结合)血管内皮生长因子受体 2(vegfr2)的第二互补位。在一些实施方式中，该互补位源自雷莫芦单抗。
16.在其他实施方式中，第一和/或第二互补位源自另一种抗体，该抗体识别在包括癌(瘤)细胞和肿瘤血管细胞的肿瘤细胞表面表达的另一种抗原。
17.在一些实施方式中，对一个或多个互补位的重链可变结构域进行优化，以在与共同 轻链配对时保留或改进互补位与对应表位的结合。优化可以包括在可变结构域中且特别 是在cdr中进行氨基酸替换。
18.在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括优化的共同轻链。共同轻链可以基于 来自至少两个亲本抗体之一的轻链。与典型的轻链相比，或与特定多互补位抗体构建体 的其他亲本抗体的轻链相比，亲本轻链对互补位的贡献可能最小。
19.一些实施方式涉及基于曲妥珠单抗的轻链的共同轻链，但包含改善其与源自第二
亲 本抗体的可变结构域的相互作用的突变。在一些实施方式中，帕妥珠单抗是第二亲本抗 体。各种实施方式包括位于cdr
‑
l2的56位或cdr
‑
l3的91、94或96位的突变，例 如：s56t、s56a或s56y；h91y、h91f或h91w；t94y、t94f或t94w；或者p96y、 p96f或p96w；或者在这些位置中的1、2、3或4个处的替换的组合。在一些实施方式 中，曲妥珠单抗相关的共同轻链还包括在cdr
‑
l1的30位处的突变，例如：n30a或 n30s，用于解决与n30脱酰胺相关的稳定性问题。
20.一些实施方式涉及基于雷莫芦单抗的轻链的共同轻链，但包含改善其与源自第二亲 本抗体的可变结构域的相互作用的突变。在一些实施方式中，帕妥珠单抗是第二亲本抗 体。各种实施方式包括位于cdr
‑
l2的55位或cdr
‑
l3的91或96位的突变，例如： d55y；a91y；p96y；或者这些位置中的1、2或3个处的替换的组合。
21.在互补位之一源自帕妥珠单抗的实施方式中，帕妥珠单抗相关的重链可变结构域未 被修改，或包括位于cdr
‑
h2中54位处的突变或位于cdr
‑
h3中98位处的突变，例如： t30a、t30s、t30n或t30d；g56a、g56s或g56t；或者在这些位置的每个处的替换 的组合。
22.在互补位之一源自曲妥珠单抗的实施方式中，曲妥珠单抗相关的重链可变结构域未 被修改，或包括位于cdr
‑
h1中30位处的突变或位于cdr
‑
h2中56位处的突变，例如： n54s、n54t或n54a；d98w、d98s、d98t或d98r；或者在这些位置的每个处的替 换的组合。
23.在一些实施方式中，多互补位抗体构建体是双互补位的。在一些实施方式中，双互 补位抗体构建体具有fab
‑
ig形式。在一些实施方式中，双互补位抗体构建体具有ig
‑
fab 形式。在一些实施方式中，双互补位构建体具有异二聚体形式。在一些实施方式中，双 互补位构建体具有一个基础，向该基础添加额外的抗原结合域，以形成对对应表位的一 种或另一种具有更高价的多互补位抗体构建体，其识别更多数量的表位，或两者兼有。
24.在一些实施方式中，多互补位抗体构建体已修改fc区，以调节它们介导各种免疫 活动(诸如adcc、adcp和cdc)，或它们与亲和纯化试剂的相互作用的能力。在一 些实施方式中，多互补位抗体构建体的fc区已经被修改以增加其血清半衰期。在特定 实施方式中，增加血清半衰期的修改为m428l。
25.一些实施方式是编码多互补位抗体构建体的核酸，包括这些编码核酸序列的表达载 体，以及用这些表达载体转化的宿主细胞。在一些实施方式中，编码序列已经过密码子 优化。
26.一些实施方式是治疗癌症的方法，其中向有需要的患者给药多互补位抗体构建体。 在一些实施方式中，治疗方法还包括外科手术、放射治疗或给药其他抗癌药物，包括化 疗、靶向疗法和激素治疗。在一些实施方式中，多互补位抗体构建体与药物缀合。其他 实施方式涉及多互补位抗体构建体在治疗癌症或在制造用于治疗癌症的药物中的用途， 以及包括多互补位抗体构建体的组合物用于治疗癌症的用途。
附图说明
27.图1：抗her2单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的轻链的可变结构 域的氨基酸序列的比对。编号基于vajdos et al.,j.mol.biol.320:415(2002)， 使用kabat编号(kabat et al.,nih publication no.91
‑
3242,pp 662,680,689 (1991)。
28.图2：抗her2单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的重链的可变结构 域的氨基酸
序列的比对。编号基于vajdos et al.,(2002)，使用kabat编号。
29.图3.抗体a和抗体b的示意图，描述了这些抗体的不同结构域。
30.图4.由抗体a和抗体b设计的具有共同轻链的双互补位分子的fab
‑
ig 形式的示意图。
31.图5.由抗体a和抗体b设计的具有共同轻链的双互补位分子的ig
‑
fab 形式的示意图。
32.图6.由抗体a和抗体b设计的具有共同轻链的双互补位分子的异二聚 体igg形式的示意图。使用杵臼结构(knob
‑
in
‑
holes)突变(atwell s et al., j mol biol.270(1):26
‑
35,1997；merchant am et al.,natbiotechnol.16(7):677
‑
81,1998)。
33.图7.由抗体a和抗体b设计的具有共同轻链的双互补位分子的异二聚 体igg形式的示意图。使用电荷对突变。(gunasekaran k et al.,j biolchem.285(25):19637
‑
46,2010)。
34.图8通过elisa描绘了当共同轻链与(a)帕妥珠单抗的重链(mab t1 至t11)和(b)曲妥珠单抗的重链(mabs t13至t22)配对时共同轻链中 突变对结合的作用。子图c描绘了mab t12(曲妥珠单抗重链与帕妥珠单 抗轻链配对)的elisa结果。
35.图9通过elisa描绘了当与野生型轻链配对时(a)帕妥珠单抗和(b) 曲妥珠单抗的突变重链对结合的作用。
36.图10通过elisa描绘了当与共同轻链配对时(a)帕妥珠单抗和(b) 曲妥珠单抗的突变重链对结合的作用。
37.图11示出了在哺乳动物细胞hek293中表达的纯化双互补位抗体构建 体t51和t54的电泳之后的聚丙烯酰胺凝胶。
38.图12通过elisa描绘了(a)双互补位抗体构建体的结合效力和(b) 它们的ec50。
39.图13描绘了双互补位抗体构建体t51和t54在抑制耐herceptin药物的 bt474乳腺癌细胞系的生长中的作用。
40.图14描绘了(a)双互补位抗体构建体t51和(b)t54以及(c)紫杉醇在抑 制nci
‑
n87胃癌细胞系的生长中的作用。
具体实施方式
41.本文公开了双特异性抗体构建体，每个包括来自两个不同的亲本抗体 的至少两个抗原识别位点(互补位)(如图3所示)，该两个不同的亲本抗 体识别来自同一抗原或来自两个不同抗原的两个不同的表位。这些双互补 位分子包括一个共同轻链的拷贝和在相同重链上或在两个不同的重链上的 两个不同的重链可变结构域的一个或多个拷贝。
42.如本文所用，术语“抗体”是指具有天然存在的哺乳动物免疫球蛋白(ig) (igg是其范例)的一般结构的分子。即包括一个可变结构域和一个恒定结 构域的两条相同的轻链以及包括一个可变结构域和三个恒定结构域的两个 条同的重链。轻链和重链通过它们的可变结构域，以及轻链的恒定结构域 与重链的第一恒定结构域相互联合。这两条重链通过第2和第3恒定结构 域相互联合。抗体的抗原结合位点由两个可变结构域形成，且特别地由每 个可变结构域的三个互补决定区(cdr)形成。如果抗体能够特异性地与 分子相互作用并吸附到分子上，则称抗体与分子(抗原)结合。抗体结合 不包括非特异性或低亲和力的相
互作用。虽然“抗体”的本意是指天然存在 的免疫球蛋白的结构，但它也包括保留这种一般结构的设计的分子，诸如 嵌合、cdr移植和人源化抗体。
43.如本文所用，术语“抗体构建体”是指其中天然存在的哺乳动物免疫球 蛋白的一般结构已被修改的分子，特别是通过——但不一定限于——设计两 个非相同的重链的联合或添加额外的结构域。在本文公开的优选的实施方 式中，额外的结构域形成与抗体fab片段(抗原结合片段)相对应的结构。 在其他实施方式中，抗体结构的其他额外的结构域可以形成与其他抗体片 段相对应的结构，其他抗体片段诸如fv(可变片段，由vh和vl组成)、 单链fv(scfv)或抗体的一些其他抗原结合部分。
44.如本文所用，术语“亲本抗体”是指多互补位抗体构建体的互补位源自 其中的抗体的一个或另一个。源自意为互补位的氨基酸序列信息是从亲本 抗体中获得的。除了互补位的氨基酸序列信息之外，还可以从亲本抗体中 获得额外的氨基酸序列信息。应理解的是，在亲本抗体中形成互补位的可 变结构域的氨基酸序列可以不经修改使用或者可经过修改使用，例如，修 改以优化当使用共同轻链时互补位的形成和亲和力。
45.如本文所用，术语“表位”是指通过与抗体(或抗体构建体)的抗原结 合位点进行接触而介导与抗体的抗原特异性结合的抗原的部分。
46.如本文所用，术语“互补位”是指通过与抗原的表位进行接触而介导与 抗原的抗原特异性结合的抗体(或抗体构建体)的部分。
47.如本文所用，术语“双互补位抗体构建体”表示具有两个不同的表位结 合位点的构建体。抗体构建体对于一个或两个互补位可以是单价的、二价 的或多价的。
48.如本文所用，术语“共同轻链”是指包括能成效地与多个重链可变结构 域联合以形成互补位的可变结构域的免疫球蛋白轻链，每个重链可变结构 域能够与被抗体结合的表位特异性结合，其中重链可变结构域是最初遇到 的。
49.各种抗体重链或轻链或其部分，在本文是指与列举的或特定指定的抗 体的对应链或其部分“相关”。这表示该链或其部分与列举的或特定指定的 抗体的对应链或其部分具有相同的序列，除非特别指明的修改，诸如氨基 酸替换，而这些修改可能没有。在可替代的实施方式中，相关链或其部分 与列举的或特定指定的抗体的对应链或其部分具有至少90、95、96、97、 98或99百分比的序列同一性。
50.如本文所用，术语“修改”、“突变”和“替换”(及其语法形式)是指氨基 酸序列中工程化的变化。除非上下文另有说明，否则突变不是指无辅助的 生物过程引起的序列变化。常规地，替换应当用参考序列中的氨基酸的单 字母码、在参考序列中位置和产生的序列中的氨基酸的单字母码来表示。 例如，a26s表示在参考序列中第26位处的丙氨酸在产生的序列中被改变 为丝氨酸。
51.所公开的抗体构建体可采用许多不同的总体结构。这些抗体构建体的 描述将专注于双互补位抗体构建体，但应理解的是，可以向每个重链添加 额外的可变结构域，使得重链包括例如3、4、5或更多的可变结构域，其 促进形成相同数量的互补位。在这些多互补位抗体中，第三个互补位可能 赋予对第三个表位的特异性，使抗体构建体具有三特异性。可替代地，第 三个互补位可能对被前两个互补位中任一个所识别的表位之一有特异性， 使得抗体构建体仍然是双特异性的，但是增加了对表位中的一个的价数。 类似地，第4个互补位可能对第4个表位具有特异性，使得抗体构建体是 四特异性的，或者它可能对被前三
个互补位中的任一个所识别的表位之一 有特异性，使得抗体构建体是三特异性的或双特异性的。等等。
52.双互补位或多互补位抗体构建体包括共同轻链的两个或多个拷贝，共 同轻链包含本文公开的一个或多个突变，并具有可变结构域或其衍生物， 与它所基于的未改变的序列具有＞80同一性、85％同一性、＞90％同一性、 ＞95％同一性、＞98％同一性。
53.双互补位抗体构建体可以为同二聚体形式(包括两个相同的重链)，诸 如fab
‑
ig(如图4所示)或ig
‑
fab(如图5所示)。在fab
‑
ig形式中，第二个 重链可变结构域(v
hb
)和ch1融合到第一抗体的重链的n末端(v
hb
‑
ch1
‑ꢀ
接头
‑
v
ha
‑
c
h1
‑
铰链
‑
c
h2
‑
c
h3
，图4)。在ig
‑
fab形式中，第二重链可变结构 域(v
hb
)和c
h1
与fc结构域(可结晶片段，基本上由c
h2
和c
h3
结构域组 成)的c末端融合(v
ha
‑
c
h1
‑
铰链
‑
c
h2
‑
c
h3
‑
接头
‑
v
hb
‑
c
h1
)，其在规范位置 中具有其可变结构域(v
ha
)(图5)。更高级的多互补位抗体构建体可以包 含附加到这些基本设计的n
‑
或c
‑
末端的其它可变结构域。接头由任何组成 的0至100个氨基酸组成。在一些优选的实施方式中，接头是(g4s)n或 (g2sg2)n，其中n是1至20之间的任意数字。在其他一些优选的实施方式 中，接头包括免疫球蛋白(igg、iga、igm、igd)或人血清白蛋白循环序 列的全部或部分铰链区。当这些重链构建体与共同轻链一起表达时，每个 分子具有两个不同的二价互补位(一共四个抗原结合位点)。
54.双互补位分子也可以是异二聚体ig形式。来自两种不同抗体的两种不 同的重链可以利用本领域中描述的技术来形成异二聚体，包括但不限于杵 臼结构(knobs
‑
into
‑
holes)(图6，ridgway jb,protein engineering 9:617, 1996)，或静电转向机制(图7，gunasekaran k et al.,2010)。当与共同轻 链配对时，分子具有两个不同的单价互补位(与天然igg分子一样，只有 两个抗原结合位点)。
55.恒定结构域(c
h1
、c
h2
和c
h3
)为人免疫球蛋白的，诸如igg、igm、 iga、igd。或igg及其亚型igg1、igg2、igg3、igg4；或者从这些类型和 亚型中重组的c
h1
、c
h2
和c
h3
结构域的组合。
56.为了消除两个互补位的重链和轻链的错误配对，使用共同轻链。通过 鉴定其中互补位主要由重链中的残基组成的单克隆抗体来选择共同轻链。 经搜索与其对应的抗原复合的抗体结构的数据库，帕妥珠单抗成为作为对 互补位的贡献最小的轻链可变结构域的来源的很好的候选。大多数帕妥珠 单抗与其在her2 ecd的结构域ii中的表位相互作用来自其重链(franklinet al.,cancer cell5:317
‑
328,2004)。只有三个来自轻链的残基参与与her2 的相互作用，且在互补决定区(cdr)2和3中：cdr
‑
l2的y49和y55， 以及cdr
‑
l3的y94(kabat编号系统，图1)。
57.对于用于产生双互补位分子的第二亲本抗体，不要求该互补位主要由 重链组成。例如，曲妥珠单抗被用作第二互补位的来源。
58.产生共同轻链
59.使用曲妥珠单抗的轻链为起始点工程化共同轻链(图1)。对可变结构 域进行了更改，并保留了本来的恒定结构域。然而，在可替代的实施方式 中，恒定结构域被任何人轻链κ或λ恒定结构域替换。由于与her2结合 中所涉及的帕妥珠单抗轻链cdr
‑
l2的残基y49和y55在曲妥珠单抗中也 是tyr，因此采用两种方法来产生共同轻链：第一种是使用帕妥珠单抗的 cdr
‑
l3，并将曲妥珠单抗的cdr
‑
l1和cdr
‑
l2中的残基突变为帕妥珠单 抗中的残基。第二种方法是将cdr
‑
l3的残基94突变为其他19种标准基 因编码的氨基酸中的每个。这些
轻链首先分别用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗 的重链进行测试，以选择保留分别与her2 ecd的结构域iv和ii两者结 合的突变。性能最好的轻链被用作共同轻链。在优选的实施方式中，t94 突变为tyr(t94y)，如在帕妥珠单抗中自然存在的那样。在其他一些优选 的实施方式中，t94突变为phe(t94f)。然而，在其他一些优选的实施方 式中，t94突变为trp(t94w)。
60.在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化。例如，曲妥珠单抗轻链 的cdr
‑
l1的n30可以突变为另一种残基，诸如n30s，以消除现有技术中 已知的曲妥珠单抗脱酰胺的热点。在一些实施方式中，n30s和t94y组合 (n30s/t94y)。在其他一些优选的实施方式中，n30s与t94f突变组合 (n30s/t94f)。在其他一些优选的实施方式中，n30s与t94w突变组合 (n30s/t94w)。
61.在一些优选的实施方式中，共同轻链中的n30突变为a(n30a)。在 一些实施方式中，n30a和t94y组合(n30a/t94y)。在其他一些优选的实 施方式中，n30a与t94f突变组合(n30a/t94f)。在其他一些优选的实施 方式中，n30a与t94w突变组合(n30a/t94w)。
62.第三种优化共同轻链的方法涉及将cdr
‑
l3的残基h91突变为其他19 种标准基因编码的氨基酸。在一些优选的实施方式中，h91突变为tyr (h94y)，如在帕妥珠单抗中存在的。在其他一些优选的实施方式中，h91 突变为phe(h94f)。然而，在其他一些优选的实施方式中，h91突变为trp (h91w)。
63.在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化，包括与其他突变(诸如 n30s、n30a)组合。
64.在一些实施方式中，n30s与h91y组合(n30s/h91y)。在其他一些优 选的实施方式中，n30s与h91f突变组合(n30s/h91f)。在其他一些优选 的实施方式中，n30s与h91w突变组合(n30s/h91w)。
65.在一些优选的实施方式中，共同轻链中的n30突变为a(n30a)。在 一些实施方式中，n30a和h91y组合(n30a/h91y)。在其他一些优选的 实施方式中，n30a与h91f突变组合(n30a/h91f)。在其他一些优选的实 施方式中，n30a与h91w突变组合(n30a/h91w)。
66.第四种优化共同轻链的方法涉及将cdr
‑
l3的残基p96突变为其他19 种标准基因编码的氨基酸中的每个。在一些优选的实施方式中，p96突变为 tyr(p96y)，如在帕妥珠单抗中的。在其他一些优选的实施方式中，p96 突变为phe(p96f)。然而，在其他一些优选的实施方式中，p96突变为trp (p96w)。在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化，包括与其他突变 (诸如n30s、n30a)组合。
67.在一些实施方式中，n30s与p96y组合(n30s/p96y)。在其他一些优 选的实施方式中，n30s与p96f突变组合(n30s/p96f)。然而在其他一些 优选的实施方式中，n30s与p96w突变组合(n30s/p96w)。
68.在一些优选的实施方式中，共同轻链中的n30突变为a(n30a)。在 一些实施方式中，n30a和p96y组合(n30a/p96y)。在其他一些优选的实 施方式中，n30a与p96f突变组合(n30a/p96f)。在其他一些优选的实施 方式中，n30a与p96w突变组合(n30a/p96w)。
69.第五种优化共同轻链的方法涉及将cdr
‑
l2的残基s56突变为其他19 种标准基因编码的氨基酸中的每个。在一些实施方式中，s56突变为thr， 如在帕妥珠单抗中的。在优选的实施方式中，s56突变为tyr(s56y)。在 一些实施方式中，共同轻链被进一步优化，包括与其他突变(诸如n30s、 n30a)组合。在一些优选的实施方式中，n30s和s56y组合(n30a/
s56y)。
70.在一些实施方式中，共同轻链具有在上述任何或所有位置处的替换的 组合。例如，具有三种替换的组合的优选的实施方式是n30s/s56y/t94w。 在一些实施方式中，在通常情况下，或者关于特定的多互补位抗体构建体 (诸如fab
‑
ig、ig
‑
fab或异二聚体)，一个或多个单独的替换被特别地排除。 例如，在一些实施方式中，t94y被完全排除，而在其他实施方式中对于异 二聚体形式中的双互补位抗体，t94y被排除。这样的排除可能仅限于一个 或多个特定的氨基酸在所讨论位置的替换，也可能扩展到在该位置的所有 可能的突变。一些实施方式容许额外的突变。其他实施方式排除在未明确 描述突变的任何位置处的突变。这些教导可推广到基于除曲妥珠单抗轻链 外的轻链的共同轻链，以及和与除帕妥珠单抗和曲妥珠单抗外的其他抗体 相关的重链可变结构域的组合配对的共同轻链。
71.优化后的共同轻链分子与帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的重链可变结构域 或其突变体结合，如下所述。
72.在可替代的实施方式中，可以使用雷莫芦单抗的轻链为起始点工程化 共同轻链。该雷莫芦单抗衍生的共同轻链可变区(cdr1、cdr2和cdr3) 主要包括来自雷莫芦单抗的轻链残基，但保留了来自帕妥珠单抗的轻链的 几个关键氨基酸残基，包括cdr
‑
l2中的tyr55、cdr
‑
l3中的pro96和tyr91 的一个或多个氨基酸残基(kabat编号方案)。一些轻链可变结构域残基在 帕妥珠单抗和雷莫芦单抗之间是保守的(表1和表2)，且在一些实施方式 中保留了这些残基。
73.表1.帕妥珠单抗和雷莫芦单抗的轻链的cdr2中的氨基酸序列
[0074][0075]
(一致的氨基酸由残基下面的*表示)
[0076]
表2.帕妥珠单抗和雷莫芦单抗的轻链的cdr3中的氨基酸序列
[0077][0078]
(一致的氨基酸由残基下面的*表示)
[0079]
在一些实施方式中，雷莫芦单抗衍生的共同轻链具有在上述任何或所 有位置处的替换的组合。优化后的共同轻链分子与帕妥珠单抗和雷莫芦单 抗的重链可变结构域或其突变体结合，如下所述。
[0080]
抗体
‑
a和抗体
‑
b的重链的优化。
[0081]
双互补位分子由具有以下突变的氨基酸残基的帕妥珠单抗重链可变结 构域的一个或多个拷贝组成：t30(kabat编号，图2)，诸如t30a、t30s、 t30n、t30d；和g56(kabat编号，图2)，诸如g56a、g56s、g56t，以 及这些突变的组合(诸如t30a和g56a)。
[0082]
双互补位分子由具有以下突变的氨基酸残基的曲妥珠单抗重链可变结 构域的一个或多个拷贝组成：n54(kabat编号，图2)，诸如n54s、n54t、 n54a；d98(kabat编号，图2)，诸如d98w、d98s、d98t、d98r；以及 这些突变的组合(诸如n54t和d98w)。
[0083]
在各种实施方式中，双互补位抗体构建体中具有0、1、2或更多突变 的帕妥珠单抗重链可变结构域与具有0、1、2或更多突变的曲妥珠单抗重 链可变结构域组合。一些实施方式排除了在特定位置处的一个或多个特定 替换或突变。其他实施方式排除了在特定位置处的所有突变。一些实施方 式容许额外的突变。其他实施方式排除在未明确描述突变的任何位置处的 突变。在一些实施方式中，这些排除适用于特定的多互补位抗体构建体形 式，诸如fab
‑
ig、ig
‑
fab或异二聚体。这些教导可推广到包括与除帕妥珠 单抗和曲妥珠单抗之外的其他抗体相关的重链可变结构域的多互补位抗体 构建体。
[0084]
在其他实施方式中，在双互补位抗体构建体中包括其他重链可变结构 域，而不是曲妥珠单抗重链可变结构域。用帕妥珠单抗作为第一抗体构建 双互补位抗体时用作亲本第二抗体的抗体的实例包括但不限于抗vegfr2 抗体，诸如雷莫芦单抗。共同轻链基于这两种抗体，第一种抗体是帕妥珠 单抗，且第二种抗体是雷莫芦单抗。
[0085]
在另一实施方式中，第二抗体是抗egfr抗体，诸如但不限于西妥昔 单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗(zalutumumab)。
[0086]
然而在另一实施方式中，第二抗体是抗vegf抗体，诸如但不限于贝 伐单抗。
[0087]
在一些实施方式中，第二抗体是抗pd
‑
1抗体，诸如但不限于帕博利珠 单抗(pembrolizumab)或纳武单抗。
[0088]
在一些实施方式中，第二抗体是抗pd
‑
l1抗体，诸如但不限于阿特朱 单抗或德瓦鲁单抗(durvalumab)。
[0089]
在一些实施方式中，第二抗体是抗ctla4抗体，诸如但不限于伊匹木 单抗(ipilimumab)。
[0090]
在一些实施方式中，第二抗体是抗cd3抗体，诸如但不限于okt3、 sp34或其衍生物，诸如人源化或亲和性修改的形式。
[0091]
在一些方面，双互补位分子的fc包含具有增加的adcc、抗体依赖性 细胞吞噬作用(adcp)或补体依赖性细胞毒性(cdc)活性的fc，其是由 于与fc受体(诸如cd16a、cd16b、cd32a、cd16b、cd64和c1q蛋白) 的结合亲和力增强或减弱所致。这包括但不限于adcc增强的非岩藻糖基 化抗体，获得方法为(1)通过在具有岩藻糖基化缺陷(诸如敲除fut8基 因)的宿主细胞中产生双互补位分子(yamane
‑
ohnuki n et al.,biotechnolbioeng.87(5):614
‑
22,2004)；或(2)在抗体的fc结构域中具有s239d、i332e、 a330l替换(kabat编号)或这些变异的任何或所有的组合(lazar ga et al., proc natl acad sci u s a.103(11):4005
–
4010,2006)。
[0092]
在一些方面，双互补位分子在fc结构域中包含突变，以减小adcc活 性或cdc活性。这些可包括但不限于在(1)fc结构域中的n297，诸如但 不限于n297a、n297g；(2)l234，诸如l234a、l234g和/或l235，诸如 l235a或l235；(3)p329，诸如p329g；或(4)d265，诸如d265a处
的 突变；或者在任何或所有这些位置处的替换的组合。
[0093]
在一些方面，fc突变(所有编号均为kabat编号系统的eu索引)包括 增加血清半衰期的突变。在一种实施方式中，fc具有以下替换：在ch3中 的t250q、或m428l、或t250q/m428l双突变(hinton et al.,j biol chem. 279(8):6213
‑
6,2004)。在另一实施方式中，双互补位抗体的fc具有 m252y/s254t/t256e三重突变(dall’acqua wf et al.,jimmunol169(9):5171
‑
80,2002)。然而在另一实施方式中，双互补位抗体的 fc具有n434a突变(petkova sb et al.,international immunology 18(12): 1759
–
1769,2006.)或m428l/n434s双突变、或m428/n434a双突变 (zalevsky j et al.,nat biotechnol.28(2):157
–
159,2010)。
[0094]
其他实施方式包括含有本文所述的双互补位分子的多互补位分子。在 一些实施方式中，第三、第四或甚至更多的额外互补位被添加到双互补位 分子中，以生成三互补位、四互补位或其他多互补位分子。额外的互补位 (一个或多个)是fab形式或dcfv或scfv形式的另一种抗体。额外的互 补位(一种或多种)是配体结合结构域。这些额外的互补位是自然产生的 或合成制备的。
[0095]
制备组成的方法
[0096]
本文公开的抗体构建体(及其组成部分)可通过重组方法来产生。因 此，本文公开了编码抗体构建体的核酸、包含编码抗体的核酸的表达载体 以及包括编码抗体构建体的核酸的细胞。用于重组生产的方法在本领域中 是众所周知的，且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，和随后分离 抗体构建体，以及通常纯化至药学上可接受的纯度。对于在宿主细胞中的 表达上述抗体构建体，通过标准方法将编码抗体构建体序列的核酸插入表 达载体中。表达在适当的原核或真核宿主细胞中进行，如cho细胞，ns0 细胞，sp2/0细胞、hek293细胞、cos细胞、per.c6细胞、酵母或大肠 杆菌(e.coli)细胞，且抗体从细胞(溶解后的细胞或上清液)中回收。
[0097]
因此，本文公开的某些实施方式包括用于制备抗体构建体的方法，包 括以下步骤：a)用包括编码抗体构建体的核酸分子的至少一种表达载体转 化宿主细胞；b)在允许合成抗体构建体分子的条件下培养宿主细胞；c) 从培养物中回收所述抗体构建体分子。
[0098]
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如蛋白a
‑
琼脂糖凝胶、羟基磷灰石 层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基中适当地分离抗体构建体。
[0099]
如本文所用，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，且 所有这样的名称都包括子代。因此，词语“转化株”和“转化细胞”包括初代受 试细胞和由此衍生的培养物，而不考虑传代次数。还应理解，由于有意或 无意的突变，所有后代的dna含量可能并不准确相同。包括与在原转化细 胞中筛选的功能或生物活性相同的变异子代。在意为不同名称的地方，将 从上下文中清楚。
[0100]
如本文所用，术语“转化”是指将载体/核酸转化到宿主细胞中的过程。 如果使用没有强大细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，则可以例如通过磷酸 钙沉淀法进行转染。然而，也可以使用用于将dna引入细胞的其他方法， 诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含坚实细胞 壁结构的细胞，则例如一种转染方法是使用氯化钙进行钙处理。
[0101]
如本文所用，“表达”是指核酸转录成mrna的过程和/或转录后的 mrna(也称为转
27,325) 的其他菌株也是合适的。这些实例是说明性的，而非限制性的。
[0110]
除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是用于抗体构建体 编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae) 是常见的面包酵母，是低等真核宿主微生物中最常用的酵母。然而，许多 其他属、物种和菌株在本文中也是常见的且可用的，诸如粟酒裂殖酵母 (schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母(kluyveromyces)宿主，诸如 例如乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc 16,045)、k.wickeramii (atcc 24,178)、k.waltii(atcc 56,500)、果蝇克鲁维酵母(k. drosophilarum)(atcc 36,906)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)和 马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(ep 402,226)； 毕赤酵母(pichia pastoris)(ep 183,070)；假丝酵母(candida)：里氏木 霉(trichoderma reesia)(ep 244,234)；粗糙脉孢菌(neurospora crassa)； 雪旺酵母属(schwanniomyces)，诸如西方雪旺酵母(s.occidentalis)，以 及丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(neurospora)、青霉菌属(penicillium)、 弯颈霉属(tolypocladium)，以及曲霉属(aspergillus)宿主，诸如构巢曲 霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。
[0111]
用于糖基化抗体构建体的表达的合适的宿主细胞源自多细胞生物，包 括无脊椎动物细胞，诸如植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株和 变异体以及相应的允许的昆虫宿主细胞，诸如草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕 (bombyx mori)。各种用于转染的病毒株均可公开获得，例如，苜蓿尺蠖 (autographa californica)npv的l
‑
1变体和家蚕(b.mori)npv的bm
‑
5 株，且这样的病毒可以用作根据本发明的本文的病毒，特别是用于草地贪 夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植 物细胞培养物也可作为宿主。
[0112]
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，且在培养物(组织培养物)中繁 殖脊椎动物细胞已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例有通 过sv40转化的猴肾cv1系(cos
‑
7，atcc crl 1651)；人胚胎肾系(293 或用于在悬浮培养物中生长的亚克隆293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk，atccccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞/
‑
dhfr(cho)；小鼠支持细胞(sertoli cells) (tm4)；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero
‑
76， atcc crl
‑
1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck， atcc ccl 34)；布法罗大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细 胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2,hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤 (mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞；mrc 5细胞；fs4细胞；以及 人肝癌细胞系(hep g2)。
[0113]
用上述表达载体转化宿主细胞用于抗体生产，并在适合用于诱导启动 子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的改良的常规营养培养基中培 养。
[0114]
用于产生抗体构建体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的 培养基诸如ham's f10、最小必需培养基(mem)、rpmi
‑
1640和dulbecco 改良eagle培养基(dmem)适合于培养宿主细胞。此外，us4,767,704； us4,657,866；us4,927,762；us4,560,655；或us5,122,469；wo 90/03430； wo 87/00195；或us re.30,985可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培 养基均可按需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表 皮生长
因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如hepes)、 核苷酸(诸如腺甘和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素
tm
)、微量元素(定义 为通常在微摩尔的范围内存在于最终浓度的无机化合物)以及葡萄糖或等 效的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以适当的浓度包括在内，其 是本领域技术人员已知的。培养条件，诸如温度、ph等，是之前被选择用 于表达的宿主细胞所使用的那些培养条件，且对于普通技术人员是显而易 见的。
[0115]
当使用重组技术时，抗体构建体可以在细胞内、周质空间中产生，或 直接分泌到培养基中。如果抗体构建体是在细胞内产生的，则作为第一步， 颗粒碎片，无论是宿主细胞还是溶解片段，都可以通过例如离心或超滤来 去除。
[0116]
可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由 细胞制备的抗体组合物，亲和层析是优选的纯化技术。蛋白a作为亲和配 体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白fc结构域的种类和同种 型。蛋白a可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体。推荐蛋白g用于 所有小鼠同种型和用于人γ3。亲和配体所附连的基质最经常是琼脂糖，但 也有其他基质。机械稳定的基质诸如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允 许比用琼脂糖可获得的更快的流速和更短的处理时间。当抗体包括ch3结 构域时，bakerbond abx
tm
树脂可用于纯化。其他蛋白质纯化技术，诸如在 离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅色谱法、肝素 sepharose
tm
的色谱法阴离子或阳离子交换树脂上的色谱法(诸如聚天 冬氨酸柱)、层析聚焦、sds
‑
page和硫酸铵沉淀也是可用的，取决于待回 收的抗体构建体。
[0117]
在任何初步纯化步骤(一步或多步)之后，包括感兴趣的抗体构建体 和污染物的混合物可使用ph在约2.5
‑
4.5之间的洗脱缓冲液进行低ph疏水 作用色谱，优选地在低盐浓度(例如，从约0
‑
0.25m盐)下进行。
[0118]
一旦纯化之后，抗体构建体可以溶解于包括任何药学上可接受的缓冲 液、盐或其他赋形剂的水性溶剂中。溶解的抗体构建体在使用之前可以冷 藏或冷冻。可替代地，可以冻干并在使用前不久重构。
[0119]
使用组合物的方法
[0120]
本发明还涉及包括本发明的双互补位抗体的药物组合物。
[0121]
术语“治疗”或“治疗”状态、疾患或病症包括：(1)预防或延迟在可能患 有或有倾向患该状态、疾患或病症但还未经历或显示该状态、疾患或病症 的临床或亚临床症状的受试者中发展的该状态、疾患或病症的至少一种临 床或亚临床症状出现；或(2)抑制该状态、疾患或病症，即阻止、减少或 延缓疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或者其至少一种临床症 状或者亚临床症状；或(3)减轻疾病，即，导致该状态、疾患或病症或至 少一种其临床或亚临床症状的减退。接受治疗的受试者所获得的益处在统 计学上是显著的，或者至少对患者或医师来说是可察觉的。
[0122]
如本文所用，术语“治疗有效”或“有效”应用于剂量或量是指当向受试者 给药用于治疗(例如预防或改善)状态、疾患或病症时，足以使这样的治 疗或预防产生有效结果的化合物或药物组合物的量。“治疗有效量”将根据 所给药的化合物或细菌或类似物，以及疾病和其严重程度，和接受治疗的 哺乳动物的年龄、体重、身体状况和反应情况而变化。
[0123]
如与本公开的组合物一起使用的短语“药学上可接受的”，是指这样的 组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的，并且当给药至哺乳动 物(例如人类)时通常不
会产生不良反应。在一些实施方式中，如本文所 用，术语“药学上可接受的”意为被联邦或州政府的监管机构批准或在美国 药典或其他公认的药典中列出用于哺乳动物且特别是用于人类。
[0124]
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指处于允许其中包含的活性成分的 生物活性有效的形式且不包含对将被给药制剂的受试者有不可接受的毒性 的额外的组分的制剂。
[0125]
术语“载体”是指用于给药化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。 这样的药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或 合成原料的无菌液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。特别是 对于可注射溶液，使用水或水溶液盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液作为 载体。可替代地，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于一种或多种粘 结剂(用于压缩丸)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂。在e.w.martin 的《雷明顿药学(remington’s pharmaceutical sciences)》中描述了合适的 药物载体。
[0126]
其他实施方式涉及如本公开的双互补位抗体构建体用于治疗癌症的用 途。在另一实施方式中，提供了双互补位抗体作为药物的用途。优选地， 所述用途是用于治疗癌症。类似的实施方式包括其共同轻链的双互补位抗 体构建体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。其他类似的实施方式为癌 症治疗方法，包括向有需要的患者给药治疗有效量的双互补位抗体构建体。 在优选的实施方式中，受试者是哺乳动物。在特别优选的实施方式中，受 试者是人类。
[0127]
本文描述的优选实施方式的组合物可用于治疗疾病。例如，优选的实 施方式基于帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的抗her2双互补位分子可用于治疗 癌症，诸如但非必须限于her2

乳腺癌、胃癌、肺癌和/或卵巢癌。
[0128]
该多互补位抗体构建体组合物可以单独给药，或者与其他适合治疗癌 症的药剂联合给药。例如，该组合物可以与其他疗法联合使用，诸如用于 化疗或靶向疗法，或用于免疫疗法。类似地，它们可以与放射疗法或外科 手术联合使用。
[0129]
多互补位抗体构建体也可以用于制备抗体
‑
药物缀合物(adc)。本领域 中普遍倾向于位点特异性缀合，因为这可以促进产物的均一性和连接的稳 定性。在使用多互补位抗体构建体的优选的adc实施方式中，药物缀合到 共同轻链上，例如在其恒定结构域中或其c末端处。这在同型二聚形式中 是特别有利的，诸如fab
‑
ig和ig
‑
fab形式，因为双互补位构建体将递送四 个缀合药物分子(假设每个轻链一个缀合位点)，从而使典型的adc的有 效荷载加倍。
[0130]
多互补位抗体构建体组合物可以通过任何合适的途径递送。在一些实 施方式中，通过注射或输注、通过皮肤贴片、通过库/泵装置或通过吸入来 递送组合物。在这些实施方式的各个方面，通过静脉内、腹腔内、皮下或 肌肉内给药多互补位抗体构建体组合物。
[0131]
可以一天一次或更少的频率给药一些实施方式中的组合物。例如，在 一些实施方式中，每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、 每六天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月、 每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次给药组合物。
[0132]
有效分子的最佳剂量水平将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、 身体状况、与其他药物的可能组合以及病情的严重程度。具体剂量可由本 领域技术人员以与用于已知细胞因子分子组合物的类似的方法来确定。
[0133]
试剂盒、单位剂型和制造物品
[0134]
本应用还提供了包括本文所述组合物的试剂盒、单位剂型和制造物品。 试剂盒、单位剂型、和制造物品可包括，例如，包括本文所述组合物的小 瓶(诸如密封小瓶)预充注射器以及自注射器(笔型)。
[0135]
本文通过根据iupac
‑
iub生物化学命名委员会的氨基酸常见的3字母 符号或1字母符号来指代氨基酸(参见下表3)。
[0136]
实施例
[0137]
下面的实施例使用各种抗体和抗体构建体，每个分配有mab编号。表 3至表6列出了它们的重链和轻链组分。尽管在表中没有显示，但双互补位 抗体构建体在fc区中包含m428l替换以提高如上所述的血清半衰期。表8 和表9分别示出了用于示例性双互补位抗体构建体的完整氨基酸和核苷酸 序列。
[0138]
表3重链
‑
轻链配对
[0139]
这些抗体将帕妥珠单抗重链(per
‑
hc)或曲妥珠单抗重链(tra
‑
hc) 与野生型(wt)或有指示的氨基酸替换的基于曲妥珠单抗轻链(tra_lc) 的共同轻链配对。
[0140][0141]
*该表使用kabat编号
[0142]
表4帕妥珠单抗重链的突变
[0143][0144][0145]
*该表使用kabat编号
[0146]
表5曲妥珠单抗重链的突变
[0147]
mab#重链突变*轻链注释t22无tra_lc曲妥珠单抗t28cdr
‑
h2 n54ttra_lc t29cdr
‑
h3 d98ttra_lc t31cdr
‑
h3 d98stra_lc t32cdr
‑
h3 d98rtra_lc t33cdr
‑
h3 d198wtra_lc t34cdr
‑
h2 n54t/cdr
‑
h3 d98ttra_lc t35cdr
‑
h2 n54t/cdr
‑
h3 d98wtra_lc [0148]
*该表使用kabat编号
[0149]
表6双互补位mab构建体的突变
[0150]
[0151][0152]
*除fc区中的替换使用eu编号外，本表使用kabat编号。
[0153]
实施例1.包括帕妥珠单抗或曲妥珠单抗重链和共同轻链的抗体的结合效力。
[0154]
使用elisa试验测定抗体与抗原her2的结合效力。通过添加0.2 ug/100ul/孔的her2细胞外结构域溶液，将her2细胞外结构域包被于96 孔板上过夜。用pbs洗涤板6次，并用3％bsa封闭，并温育2小时。再 次用pbs洗涤板6次。然后将抗her2抗体按图中指示的各种浓度添加到 每个孔中。结合1小时后，用pbs洗涤板6次。加入辣根过氧化物酶(hrp) 缀合的二次抗体并温育1hr。向每个孔中加入hrp基底tmb，并在板读数 器上读取发光。然后将数据拟合成4参数的s形曲线以生成ic50。每个样 本一式三份进行。
[0155]
图8a示出了各种轻链与帕妥珠单抗重链配对的结果(参见表3)。可 以看出，用除t6外所有的共同轻链形成的mab表现与帕妥珠单抗(mab t1) 相似，甚至是野生型曲妥珠单抗轻链(mabt11)。图8b和图8c示出了各 种轻链与曲妥珠单抗重链配对的结果。可以看出，用所有共同轻链形成的 mab表现与用曲妥珠单抗的野生型轻链形成的mab相似，并优于用帕妥珠 单抗的野生型轻链形成的mab(mab t12；图8b)。
[0156]
实施例2.包括修改后的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗重链和对应的野生型轻链的抗体的结合效力。
[0157]
使用上述相同的elisa测试，测定了修改后的重链与其野生型轻链配 对形成的mab的结合效力(参见表4)。与帕妥珠单抗(mab t1)相比， 用所有三种修改后的帕妥珠单抗重链形成的mab表现出改善的性能(图 9a)。与曲妥珠单抗(mab t22)相比，用所有修改后的曲妥珠单抗重链形 成的mab表现出大致相似的性能，六个中有四个表现出中度的改善。(图 9b)。
[0158]
实施例3.包括修改后的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗重链和各种共同轻链的抗体的结合效力。
[0159]
使用上述相同的elisa测试，测定了修改后的重链与各种共同轻链配 对形成的
mab的结合效力(参见表5)。对于使用修改后的帕妥珠单抗重链 的mab，本实验中性能最好的是在重链中包含t30a和g56a替换两者，且 其与在曲妥珠单抗轻链中包含n30s、s56y和t94w替换的共同轻链配对 的mab t43。这种轻链在其他配对中表现良好(考虑t44和t45；图10)。 对于使用有n54t和d98t替换的修改后的曲妥珠单抗重链的mab，性能是 大致相同的。共同轻链缺少s56y替换的mab t47性能最差，而含有n30s、 s56y和t94w替换的共同轻链mab t46表现最好(图10b)。
[0160]
实施例4.抗her2抗体构建体的表达和纯化
[0161]
使用标准分子生物学技术制备表达构建体。在freestyle 293表达培养 基(thermofisher)中在37℃下5％co2下培养hek293e细胞。用2
‑
4ug/mlpei用表达构建体的质粒dna(每1
×
106细胞0.5至2ug dna)转染细胞 (1
×
106细胞/ml)。在存活力下降到～70％百分比之后收获细胞。根据制造 商的说明用蛋白
‑
a珠(mabselect sure(ge life tech))纯化培养基中的抗 体。将抗体在pbs中透析，并在4％至10％sds
‑
page凝胶上分析(图11)。
[0162]
实施例5.双互补位抗体构建体的结合效力
[0163]
使用上述相同的elisa试验，测定不同形式的双互补位抗体构建物的 结合效力(参见表5)。在该结合试验中，除了双互补位mab t57表现稍差 于其他之外，所有被测试的构建体均表现优于帕妥珠单抗并类似于曲妥珠 单抗(图12a)。该试验不能区分对于两个表位为单价的异二聚体形式抗体， 和对于两个表位为二价的fab
‑
ig和ig
‑
fab形式。双互补位抗体构建体的 ec50的范围为从双互补位mab t57的377ng/ml至双互补位mab t56的 174ng/ml。相比之下，曲妥珠单抗(mab t22)和帕妥珠单抗(mab t1) 的ec50分别为211和5460ng/ml(图12b)。
[0164]
实施例6.双互补位抗her2 mab构建体抑制耐赫赛汀bt474乳腺癌细胞系的增殖
[0165]
为了测定抗体抑制bt474耐赫赛汀药物细胞(bt474
‑
herdr)的增殖， 在37℃和5％co2下在补充有10％fbs的rpmi
‑
1640培养基中，将细胞以 5000细胞/孔铺板在96孔板中的90μl培养基中。24小时后，将用培养基 稀释至各种浓度的10μl的抗体构建体添加到细胞培养液中。在培养细胞额 外72小时后，用celltiterglo(promega)测定细胞存活力。将未添加抗体 的孔设为100％细胞存活力，并使用多西紫杉醇作为细胞毒性的阳性对照。 然后将数据拟合成4参数的s形曲线以生成ic50。这些样本一式三份地进 行。
[0166]
测试了两种不同的双互补位抗体构建体，双互补位mab构建体t51和 t54(参见表6)且两者均表现出细胞毒性(存活力降低)(图13，顶部的 两个子图)。相比之下，赫赛汀(曲妥珠单抗)没有效果。由于曲妥珠单 抗通过adcc起作用，因此其在本测试中缺乏效果并不令人惊讶，因为其 他成分不存在细胞毒性。因此，双互补位抗体构建体的细胞毒性作用是令 人惊讶的，且是对临床有用性的令人鼓舞的预期。
[0167]
实施例7.测定抗体抑制nci
‑
n87(n87)细胞增殖的效力
[0168]
最初通过将细胞以各种密度铺板于96孔组织培养板上来测定nci
‑
n87 的生长曲线。细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)的rpmi
‑
1640培养基中 生长。发现1000细胞/孔的初始细胞密度是合适的，其在培养96小时后达 到融合，并选择该细胞密度来测试双互补位抗体构建体抑制生长的能力。
[0169]
为了测定双互补位抗体构建体用于抑制nci
‑
n87细胞增殖的效力，在 37℃和5％co2下在补充有10％fbs的rpmi
‑
1640培养基中，将细胞以1000 细胞/孔铺板在96孔板中的
90μl培养基中。24小时后，将用培养基稀释至 各种浓度的10μl的抗体构建体添加到细胞培养液中。在培养细胞额外72 小时后，通过添加10μl的cck
‑
8试剂(sigma)测定细胞增殖率。在无光 下培养3小时后，在od450nm处读取板。将未添加抗体的孔设为100％细 胞存活力，并使用多西紫杉醇作为细胞毒性的阳性对照。然后将数据拟合 成4参数的s形曲线以生成ic50。这些样本一式三份地进行。
[0170]
测试了三种不同的双互补位抗体构建体，双互补位mab构建体t51、 t52和t54(参见表6)且均抑制生长(图14b)并具有比帕妥珠单抗(mab t1)或曲妥珠单抗(mab t22)更强的作用(图14a)。如上，由于曲妥珠 单抗和帕妥珠单抗通过adcc起作用，因此其在该测试中作用最小并不令 人惊讶，因为其他组分不存在细胞毒性。帕妥珠单抗的较强的作用可能与 帕妥珠单抗抑制配体介导的细胞内信号转导的能力有关。因此，双互补位 抗体构建体的细胞毒性作用是令人惊讶的，且是对临床有用性的令人鼓舞 的预期。此外，如上所述，发现gu的dvd
‑
ig分子在该系统中具有净激动 作用。因此，这些双互补位抗体构建体抑制而不是促进该癌细胞系的生长， 也预示着它们的临床应用前景良好。
[0171]
表7：氨基酸命名法
[0172][0173]
表8氨基酸序列
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180][0181]
*v
‑
区替换用kabat编号表示；fc区替换用eu编号表示。
[0182]
表9核酸序列
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193][0194]
序列表
[0195]
本技术包含文件名为1403346
‑
00002_sequence_listing的序列表，大小为113千字 节，且创建于2018年4月9日。该序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0196]
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的数量、诸如分子量 的性质、反应条件等的所有数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。如本文所 用，术语“约”和“大约”意为10至15％之内，优选地5至10％之内。因此，除非指示相 反情况，否则说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是可以根据本发明所寻求获得 的所需性质而改变的近似值。至少并且不是为了限制本权利要求范围的等效方案的应 用，每个数值参数应当至少是根据所给出的有效数字并采用通常的四舍五入方法来构成 的。尽管描述本发明的宽范围的数字范围和参数是近似值，但是特定实施例中给出的数 值是尽可能精确的。然而，任何数值固有地包含一定的误差，这些误差必然地由各自测 试量度中所存在的标准偏差引起。
[0197]
除非本文另有说明或明显违背上下文，否则在描述本发明的上下文中(特别是在所 附权利要求的上下文中)所使用的术语“一个”、“一种”、“所述/该”以及类似指示词应被 解释为既包括单数也包括复数。对本文数值范围的叙述仅旨在用作为引用落入该范围的 每个单独的值的简写方法(shorthand method)。除非本文另有说明，每个单独的值都被 并入说明书，就像其被单独地并入本文一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否 则，本文所描述的所有方法都可按任何适宜的顺序执行。本文提供的任何和所有的实施 例或示例性语言(例如“诸如”)的使用，仅仅旨在更好地阐明本发明并且不是对本发明 的范围进行限制，除非另有说明。说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明的实 施所必需的任何非要求的元素。
[0198]
本文公开的本发明的可替代的元素或实施方式的分组不应被解释为限制。各个组成 员可以单独地或者以与所述组的其他成员或者本文内的其他要素任意组合被指代且要 求保护。可以预料的是组中的一个或多个成员可因便利性和/或专利性原因包含在组中或 从组中删除。当任何这类包括或删除发生时，本技术文件被认为含有经修改的组，以满 足对附加的权利要求书中所用的所有马库什组的书面描述。
[0199]
本文描述了本发明的某些实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。
当 然，在阅读上述描述之后，这些所描述的实施方式的变体对于本领域普通技术人员将是 显而易见的。本发明人预期普通的技术人员能适当地采用这类变体，且本发明人旨在使 得本发明以与本文特定描述不同的方式应用。因此，如适用的法律允许，本发明包括在 此附上的权利要求书中述及的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上 下文另有明确相反指示，否则本发明涵盖上述元素以所有可能的变体的任何组合。
[0200]
本文公开的特定实施方式可以通过使用由
……
组成或基本上由
……
组成的语言进 一步在权利要求中得到限制。当用于权利要求时，无论是提交还是按照修改添加，过渡 术语“由
……
组成”排除未在权利要求中指明的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本 上由
……
组成”将权利要求的范围限制在特定材料或步骤以及那些不会实质上影响基本 和新颖的特性(一个或多个)的材料或步骤。所要求保护的本发明的实施方式在本文内 在地或明确地描述并实现。
[0201]
另外，在整个本说明书中引用了大量专利和印刷出版物作为参考文献。上述各参考 文献和印刷出版物的全部内容通过引用各自并入本文。
[0202]
最后，应理解本文公开的本发明的实施方式仅用于阐明本发明的原理。可以采用的 其他修改形式也在本发明的范围内。因此，通过举例而非限制的方式，可根据本文的教 导利用本发明的可替代的配置。因此，本发明不局限于精确显示和描述的内容。