酿酒酵母SG35、包含酿酒酵母SG35的发酵菌剂及其应用的制作方法

酿酒酵母sg35、包含酿酒酵母sg35的发酵菌剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及食品加工领域，尤其涉及一种酿酒酵母sg35、包含酿酒酵母sg35的发酵菌剂及其应用。


背景技术：

2.葡萄酒是以葡萄为原料酿造的一种果酒，葡萄酒中含有的氨基酸、矿物质和维生素等多种营养成分可直接被人体吸收，对维持和调节人体的生理机能起到良好的作用，因此，葡萄酒深受消费者的青睐。
3.近年来，由于全球气候变暖，葡萄果实中的含糖量不断升高，对葡萄酒的直接影响是乙醇含量上升，一些高温地区种植的葡萄酿造的干红葡萄酒的乙醇含量高达15％v/v以上，适量的乙醇可赋予葡萄酒甜味，但是乙醇含量过高会导致葡萄酒具有苦涩感，而且高含量的乙醇会掩蔽葡萄酒中其他呈香物质的强度，进而影响葡萄酒的香气及整体风格，甚至影响消费者健康。因此，降低葡萄酒中的乙醇含量逐渐成为业内关注重点。
4.目前降低葡萄酒中乙醇含量的方法主要有物理法和生物法，物理法包括反渗透及膜过滤等方法，均存在操作成本高、易损失葡萄酒的香气等缺陷。生物法是指在发酵过程中利用酵母菌的自身代谢限制葡萄酒中乙醇的合成，以达到降低葡萄酒中乙醇含量的目的。乙醇主要是由酵母菌在酒精发酵过程中代谢糖产生的，不同菌株的代谢流向不同，采用现有的酵母菌发酵制得的葡萄酒中的酒精含量均在11％v/v以上，高含量的乙醇直接影响了葡萄酒的口感和香气，如果能够通过筛选得到低产乙醇、高产香气物质的酵母菌，实现生物降醇的同时增加香气物质的含量，实现多元化降醇效果，对于葡萄酒产业的发展具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有的酵母菌酿造得到的葡萄酒存在酒精含量高，直接影响葡萄酒的口感和香气等缺陷，本发明提供一种酿酒酵母sg35、包含酿酒酵母sg35的发酵菌剂及其应用。
6.为达到上述目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
7.一种酿酒酵母sg35，该酿酒酵母的保藏号为cgmcc no.22617，该菌株属于酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)，已于2021年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.相对于现有技术，本发明提供的酿酒酵母sg35能将葡萄酒中的乙醇含量降低至7％v/v以下，同时提高辛酸乙酯的含量达17mg/l以上，辛酸乙酯可以为葡萄酒贡献果香和甜香，进而提升葡萄酒的香气愉悦度。而且，采用sg35菌株制得葡萄酒的过程中不产硫化氢，不会给葡萄酒带来异味。
9.此外，sg35菌株具有很好的耐受性：可在16％v/v的酒精，500g/l葡萄糖，350mg/l二氧化硫的条件下正常生长发酵。该sg35菌株还可在低温(10℃)下启动发酵保证低温下葡萄酒的正常酿造生产。
10.本发明还提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包含权利要求1所述的酿酒酵母sg35。
11.与现有技术相比，该发酵菌剂能够显著降低葡萄酒中的乙醇含量，同时提升葡萄酒的香气愉悦度，实现多元化降醇的效果：生物降醇的同时增加香气物质的含量。
12.本发明还提供了上述的酿酒酵母sg35或上述的发酵菌剂在制备发酵产品中的应用。
13.与现有技术相比，本发明提供的酿酒酵母在用于制备发酵产品时，具有起酵速度快、发酵彻底的特性，而且最终得到的发酵产品的酒精产量低、不良风味物质产量较低。尤其是用于制备葡萄酒时，最终得到的葡萄酒中乙醇含量低，酒精度柔和适口，且具有浓郁的新鲜水果香气和丰富的紫罗兰香气、香气优雅复杂、入口圆润。
14.可选地，所述发酵产品包括发酵葡萄酒、发酵面食、发酵白酒或发酵啤酒等。
15.本发明还提供了一种发酵葡萄酒的制备方法，包括如下步骤：将上述的酿酒酵母sg35或上述的发酵菌剂接种至含有葡萄汁的培养基中进行发酵，得所述的发酵葡萄酒。
16.本发明提供的采用sg35菌株发酵制得的葡萄酒中乙醇含量低，高级醇和酯类物质含量高，且高级醇含量未超过不良风味最高值，酸类物质含量适中，可增加葡萄酒的复杂度，保持葡萄酒的平衡感，残糖含量小于4g/l，符合干型葡萄酒的指标要求，说明酿酒酵母sg35具有良好的酿造特性。
17.可选地，所述酿酒酵母sg35或所述的发酵菌剂中的酿酒酵母sg35的接种量为1
×
105‑1×
107cfu/ml。
18.可选地，所述发酵的温度为10
‑
40℃。
附图说明
19.图1是本发明酿酒酵母在ydp固体培养基上培养48h后在显微镜下的形态图；
20.图2是本发明酿酒酵母在wl营养琼脂培养基上培养48h后在显微镜下的形态图；
21.图3是本发明酿酒酵母的乙醇耐受性曲线；
22.图4是本发明酿酒酵母的糖耐受性曲线；
23.图5是本发明酿酒酵母的二氧化硫耐受性曲线；
24.图6是本发明酿酒酵母的温度耐受性曲线；
25.图7是本发明酿酒酵母与商业酵母rx60的生长曲线；
26.图8是本发明酿酒酵母与商业酵母rx60的糖消耗曲线；
27.图9是本发明酿酒酵母与商业酵母rx60分别酿造的干红葡萄酒的感官评定结果。
具体实施方式
28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
29.现有的酿酒酵母的性能相对比较单一，只能改善葡萄酒某一方面的性能，比如单纯地降低葡萄酒中的乙醇含量，或者单纯地提高葡萄酒的香气，目前暂未发现具有多元化效果的酿酒酵母，尤其是降低乙醇含量的同时提高葡萄酒果香特性的酿酒酵母。而本发明
经过大量的实验，从自然发酵的西拉葡萄醪在酒精发酵不同阶段取样，通过梯度稀释平板培养得到本土酵母单菌落，再通过纯种培养、鉴定、耐受性评价、小试发酵，获得了一株低产乙醇、同时高产辛酸乙酯(可提高葡萄酒果香特性)的酿酒酵母sg35菌株，该菌株为酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)。
30.本发明提供的酿酒酵母sg35具有良好的耐受性，可耐受16％v/v的酒精，500g/l葡萄糖，350mg/l二氧化硫，而且酿酒酵母sg35还可在10℃低温下启动发酵，保证低温下葡萄酒的正常生产。与商业酵母rx60(法国laffort公司生产，常用于干红葡萄酒酿造)相比，利用本发明提供的酿酒酵母sg35生产出的干红葡萄酒起酵速度快，发酵彻底(葡萄酒中糖含量<4g/l)，得到的葡萄酒中的酒精产量低(6
‑
7％v/v)，不良风味物质(硫化氢、乙酸等)产量较低，口感更具有复杂性。而且，酿酒酵母sg35发酵得到的葡萄酒的香气物质产量更高，特别是贡献果香的辛酸乙酯产量为1.02mg/l，是商业酵母rx60(0.35mg/l)的3倍，赋予干红葡萄酒更加丰富愉悦的果香风格。酿酒酵母sg35在生产低醇葡萄酒、提升葡萄酒的果香特征等方面具有极强的酿造潜力。
31.下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
32.以下实施例中涉及的培养基的配方如下：
33.1)ypd固体培养基配方如下：
34.每升培养基中含有酵母提取物10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g和琼脂1.5g；自然ph值，121℃灭菌15min。
35.2)ypd液体培养基配方如下：
36.每升培养基中含有酵母提取物10g、葡萄糖20g和蛋白胨20g；自然ph值，121℃灭菌15min。
37.3)wl营养琼脂培养基配方如下：
38.每升培养基中含有酵母浸粉4g、氯化铁0.0025g、葡萄糖50g、硫酸锰0.0025g、氯化钾0.425g、溴甲酚绿0.022g、氯化钙0.125g、琼脂20g、硫酸镁0.125g、酸水解酪蛋白5g和磷酸二氢钾0.55g，ph5.5
±
0.2，121℃高压灭菌15min。
39.4)biggy培养基配方如下：
40.每升培养基中含有柠檬酸铋铵5g、亚硫酸钠3g、葡萄糖10g、甘氨酸10g、酵母浸粉1g和琼脂16g，ph 6.8
±
0.2，煮沸不超过1min，冷至45
‑
50℃时倾入无菌平皿，备用。
41.5)葡萄汁模拟培养基配方如下：
42.每升培养基中含有葡萄糖100g、果糖100g、酒石酸3g、柠檬酸0.3g、l
‑
苹果酸0.3g、硫酸铵0.3g、天冬酰胺0.6g、一水合硫酸锰4mg、一水合硫酸锌4mg、磷酸二氢钾2g、五水合硫酸铜1mg、碘化钾1mg、硼酸1mg、(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 1mg、cocl2·
6h2o 0.4mg、肌醇0.3g、生物素0.04mg、维生素b1 1mg、维生素b6 1mg、烟酸1mg、泛酸1mg和对氨基苯甲酸1mg，ph至5.8，过滤除菌。
43.实施例1
44.本实施例提供酿酒酵母sg35菌株的分离、纯化及其鉴定
45.将未杀菌的西拉葡萄破碎后带皮加入发酵容器中，于25℃下恒温静置发酵。检测发酵过程中的还原糖的含量，根据还原糖的消耗量在不同发酵阶段取样(糖消耗20％、50％、80％)，吸取不同发酵阶段的葡萄汁使用无菌生理盐水进行梯度稀释(10
‑5、10
‑6、10
‑7)
后涂布在wl营养琼脂培养基平板上，在30℃培养24h后从平板中挑取长势良好、形态特征明显的单菌落，进行菌落形态及分子生物学鉴定(5.8s
‑
rdna its方法)，共获得89株酿酒酵母。然后对89酿酒酵母使用高通量筛选技术获得耐受性强的8株酿酒酵母。
46.在500ml锥形瓶内对8株耐受性强的酿酒酵母进行小试酿造特性研究。以1
×
106cfu/ml的接种量分别接种至葡萄汁模拟培养基中，于25℃下恒温静置发酵10天，通过监测生长曲线和二氧化碳失重曲线来判断发酵进程，根据斜率的大小来判断发酵能力，并检测发酵结束后葡萄酒中乙醇含量，综合筛选出起酵速度快，乙醇产量低的一株酿酒酵母。
47.该菌株经过形态学观察、5.8s
‑
its rdna基因扩增测序，具体鉴定结果如下：
48.(1)形态学观察方法和结果：经过48h培养，酿酒酵母sg35菌株在ydp固体培养基上生长的菌落为乳白色，圆形，有光泽，边缘整齐，粘稠，易挑起(如图1所示)；在wl营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状(如图2所示)。
49.(2)its鉴定：取菌株总dna，采用真菌itsrdna通用引物its1、its4进行pcr扩增，pcr扩增体系(50μl)：10
×
pcrbuffer：5.0μl，10mm dntps：1μl，10μm引物各0.5μl，模板(基因组)：3
‑
5μl，5u/μl taqdna聚合酶：0.2μl，加ddh2o至50μl，混匀；
50.其中，通用引物its1的基因序列如下：5'
‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑
3'(如seq id no.2所示)，通用引物its4的基因序列如下：5'
‑
tcctccgcttattgatatgc
‑
3'(如seq id no.3所示)。
51.pcr扩增程序：95℃预变形5min；94℃变形1min，55.5℃退火2min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，降温至12℃，取出产物。
52.序列测定工作由扩增后的pcr产物送样测序，测序由生工生物工程(上海)有限公司完成，sg35菌株的itsrdna序列如seq id no.1所示。
53.cccggggtatgccttagtacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaccacggacc
54.(3)鉴定结果
55.itsrdna测序结果与ncbi中数据比对，酿酒酵母sg35菌株与saccharomycescerevisiae有100％的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定sg35菌株为酿酒酵母菌。
56.实施例2
57.本实施例提供酿酒酵母sg35的耐受性评价
58.将酿酒酵母sg35单菌落接种于含无菌ypd液体培养基的96孔板中，于30℃，200rpm下过夜培养进行活化，然后分别进行下述的耐受性实验。
59.1)乙醇浓度耐受性实验
60.将上述96孔板中活化的菌株以3％的接种量转接至分别含6％、8％、10％、12％、
14％、16％、18％乙醇体积浓度的ypd液体培养基中，于30℃、200rpm下进行过夜培养后，采用酶标仪测量od
600nm
值，绘制酿酒酵母的乙醇浓度耐受性曲线，如图3所示。
61.2)葡萄糖浓度耐受性实验
62.将上述96孔板中活化的菌株以3％的接种量转接至分别含20％、30％、40％、50％、60％葡萄糖质量浓度的ypd液体培养基中，于30℃、200rpm下进行过夜培养后，采用酶标仪测量od
600nm
值，绘制酿酒酵母的葡萄糖浓度耐受性曲线，如图4所示。
63.3)二氧化硫浓度耐受性实验
64.将上述96孔板中活化的菌株以3％的接种量转接至分别含150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l、350mg/l二氧化硫浓度的ypd液体培养基中，于30℃、200rpm下进行过夜培养后，采用酶标仪测量od
600nm
值，绘制酿酒酵母的二氧化硫浓度耐受性曲线，如图5所示。
65.4)温度耐受性实验
66.将上述96孔板中活化的菌株以3％的接种量转接至ypd液体培养基中，分别于10℃、13℃、18℃、32℃、40℃，200rpm下过夜培养后，采用酶标仪测量od
600nm
值，绘制酿酒酵母的温度耐受性曲线，如图6所示。
67.5)产硫化氢情况
68.将上述96孔板中活化的菌株点板至biggy培养基平板上，观察菌落生长情况。高产硫化氢的菌株可还原培养基中的亚硫酸铋，从而使菌落显褐色至黑色。根据菌落颜色评价酿酒酵母产硫化氢的情况。
69.耐受性评价结果
70.结果表明，sg35可在16％v/v的酒精，500g/l葡萄糖，350mg/l二氧化硫的条件下正常生长发酵，而且，该菌株还可以在10℃的低温下启动发酵，可保证葡萄酒的正常酿造生产。此外，sg35菌株在发酵酿造葡萄酒的过程中不产硫化氢，不会给葡萄酒带来异味。
71.实验例1
72.将酿酒酵母sg35与商业酵母rx60(法国laffort公司生产，常用于干红葡萄酒酿造)分别接种至葡萄汁模拟培养基中，进行小试发酵实验，同时监测发酵过程中的生长曲线和糖消耗情况，对比发酵能力。发酵结束后检测发酵葡萄酒中乙醇含量及挥发性香气物质含量。具体的结果见表1
‑
2及附图7
‑
8。
73.小试发酵实验的具体方法如下：
74.将保存于
‑
80℃的酿酒酵母sg35(按照实施例1中的方法筛选得到)和商业酿酒酵母rx60分别在ypd固体和ypd液体培养基上传代，从ypd平板上挑取菌株分别接入装有100ml装有已灭菌的ypd液体培养基的三角瓶中，摇床(180rpm，30℃)培养24h，作为待接种的活化种子液。按106cfu/ml的接种量接种于300ml葡萄汁模拟培养基中(500ml锥形瓶)，初糖浓度200g/l，以发酵栓液封，25℃条件下静置培养10
‑
14d，至最终糖含量＜4g/l终止发酵。
75.其中，小试发酵得到的发酵葡萄酒中乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、乙酸含量使用液相色谱法(gb/t 15038
‑
2006)检测；
76.酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量用agilent 6890气相色谱(gc)和agilent 5975质谱(ms)联用仪(agilent，美国)检测。具体条件为：毛细管柱hp
‑
innowax polyethylene glycol 60m
×
0.25mm
×
0.25μm(j&w scientific，美国)载气为高纯氦气，流速1ml/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温
度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式ei，离子能量70ev，质量扫描范围20
‑
450amu。
77.酿酒酵母sg35与商业酵母rx60发酵的生长曲线和糖消耗曲线分别见图7和图8，由图7可知，酿酒酵母sg35与商业酵母rx60发酵的生长情况相近，稳定期阶段酿酒酵母sg35发酵的细胞生物量高于rx60，说明酿酒酵母sg35具有较好的生长活力。由图8可知，在发酵前期，酿酒酵母sg35发酵得到的葡萄酒中呈现更明显的糖下降趋势，酿酒酵母sg35的起酵速率显著高于rx60。发酵结束时酿酒酵母sg35发酵得到的葡萄酒中糖含量低于4g/l，说明其可以完成干型葡萄酒的发酵。
78.表1 理化指标
[0079] sg35发酵后葡萄酒样rx60发酵后葡萄酒样发酵前葡萄汁模拟培养基葡萄糖g/l00100果糖g/l1.32
±
0.091.89
±
0.11100甘油g/l7.94
±
0.157.81
±
0.220乙酸g/l0.39
±
0.010.42
±
0.010乙醇％v/v6.95
±
0.0111.21
±
0.920
[0080]
由上表中的数据可知，sg35与rx60两株菌均可以完成正常发酵，但是sg35的乙醇产量显著低于商业菌株rx60，符合低产乙醇的要求(<7％v/v)。sg35在10天内完成发酵，残糖含量小于4g/l，符合干型葡萄酒的指标要求，说明sg35具有良好的酿造特性。
[0081]
表2 香气物质浓度
[0082]
[0083][0084]
由上表中两株菌发酵完成后主要挥发性香气成分种类和含量的比较可知，与商业酵母rx60相比，酿酒酵母sg35具有高产高级醇和酯类物质的特性，且高级醇含量未超过不良风味最高值(400mg/l)，具有更强的产香能力。在酯类物质中，酿酒酵母sg35发酵后的葡萄酒中含有的辛酸乙酯量为商业酵母rx60的2倍左右。辛酸乙酯可为葡萄酒贡献果香、甜香风格，提升葡萄酒的香气愉悦度。此外，酿酒酵母sg35发酵后的葡萄酒中的酸类物质含量适中，可增加葡萄酒的复杂度，保持葡萄酒的平衡感。
[0085]
由表1
‑
2及附图7
‑
8可知，本发明提供的酿酒酵母sg35可以迅速起酵，完成低醇葡萄酒的生产，同时还可有效提升葡萄酒香气品质，增加葡萄酒的香气复杂性和愉悦度。
[0086]
实验例2采用西拉葡萄发酵酿造的葡萄酒的感官评定
[0087]
使用100l发酵罐进行西拉葡萄酒的酿造实验，向成熟状况良好的西拉葡萄醪中分别接种酿酒酵母sg35和商业酵母rx60，发酵结束后取样进行感官评价。
[0088]
将保存于
‑
80℃的酿酒酵母sg35(按照实施例1中的方法筛选得到)和商业酿酒酵母rx60分别在ypd固体和ypd液体培养基上传代，从ypd平板上挑取菌株分别接入装有100ml装有已灭菌的ypd液体培养基的三角瓶中，摇床(180rpm，30℃)培养24h，作为待接种的活化种子液。按106cfu/ml的接种量分别接种于10l西拉葡萄汁中，静置24h，回温至22℃后得到活化的酿酒酵母sg35和商业酵母rx60，然后将活化的酿酒酵母sg35和商业酵母rx60放入100l发酵罐中进行发酵，发酵温度为25℃，至最终糖含量＜4g/l，终止发酵后取样进行感官评价。
[0089]
感官品评小组共十名专家，其中五位来自企业的国家级品酒师，两位来自国内高校长期从事葡萄酒研究的教师、副教授，三位葡萄酒专业硕士、博士研究生，具有较高的权威性和合理性。各位品评人员对所试酒样给出的评分(取平均值)结果见图9及表3。
[0090]
表3 100l发酵葡萄酒感官评定评分结果(专家盲评)
[0091][0092][0093]
由上表中的结果结合附图9可知，sg35所酿葡萄酒得分更高，具有浓郁的新鲜水果香。十位专家认为sg35所酿葡萄酒酒精度柔和适口，满足低产乙醇葡萄酒的要求，同时具有更好地香气品质，增强了葡萄酒的饮后愉悦度，说明sg35具有良好的酿酒潜力。
[0094]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。