一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法与流程

1.本发明涉及非天然氨基酸调控多肽组装及多肽纳米探针技术领域，具体涉及一种可用于多肽可控组装的硝基还原酶响应氨基酸与荧光探针的制备及性能表征方法。
技术背景
2.多肽纳米组装体的结构特征与多肽序列之间有着密切关系。这也激发了基于刺激响应的天然或非天然氨基酸的各种多肽可控组装系统的建立。利用生物相容性刺激调控多肽组装体的纳米结构已被证明是一种制备先进功能生物材料的有效策略，在疾病诊断和治疗方面具有巨大的潜力。在生物相容性刺激物中，硝基还原酶(ntr)是一种含有黄素的酶，通常在实体瘤的乏氧区域过度表达，能够利用辅酶nad(p)h作为电子源将硝基还原为氨基。目前为止，许多ntr响应的水凝胶，成像探针和可激活的前药递送载体已经被设计合成，并表现出广泛的生物医学应用。尽管如此，通过ntr响应的氨基酸来调控多肽组装的有效策略仍然很少，限制了多肽材料在肿瘤乏氧区域的应用。
3.在ntr响应基团中，2
‑
硝基咪唑的疏水性硝基官能团能够在乏氧条件下被ntr还原为亲水性的氨基，这种可靠而稳定的转化使得2
‑
硝基咪唑成为ntr响应体系的理想候选之一。例如，2
‑
硝基咪唑共价修饰荧光染料或聚合物已经被广泛用于乏氧荧光成像以及还原响应聚合物胶束药物载体的制备。然而，通过2
‑
硝基咪唑修饰氨基酸来设计ntr调控多肽组装体系的研究还未报道。因此，通过合理设计ntr响应的2
‑
硝基咪唑修饰的非天然氨基酸对多肽材料在肿瘤乏氧区域的应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决现有技术存在的上述缺陷，提供一种通过合理设计2
‑
硝基咪唑修饰的非天然氨基酸调控多肽组装以及制备还原响应形貌转变的多肽纳米探针。这种ntr还原响应形貌转变多肽纳米探针在乏氧区域ntr作用下，多肽中的2
‑
硝基咪唑发生还原，由非极性硝基转变为极性氨基，促使多肽组装体发生纳米纤维到纳米颗粒的转变，从而促进多肽组装体向肿瘤深处的渗透。而且该还原反应能够阻断荧光染料与2
‑
硝基咪唑之间的光致电子转移(pet)作用，从而对肿瘤深度乏氧区域进行近红外荧光成像。该多肽纳米探针制备方法简单，反应条件温和，操作简便。
5.为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
6.一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，所述的肿瘤乏氧荧光探针，简称多肽纳米探针，该探针包括：多肽序列fmoc
‑
a(2ni)ve基元和含有荧光染料具有荧光成像功能的多肽组装基元ir780
‑
a(2ni)ve；所述探针通过如下方法制备而成：
7.s1：设计合成具有ntr还原性的2
‑
硝基咪唑修饰的丙氨酸非天然氨基酸(fmoc
‑
a(2ni))。基于光延反应，在无水四氢呋喃溶剂里，偶氮二甲酸二异丙酯(diad)和三苯基膦(tpp)存在下，2
‑
硝基咪唑与三苯甲基保护的丝氨酸甲酯(trt
‑
l
‑
ser
‑
ome)反应生成trt
‑
a(2ni)
‑
ome。随后用三氟乙酸tfa和氢氧化锂lioh处理相应的中间体以去除三苯甲基并水解
甲基酯基团。随后，最终对a(2ni)的氨基进行fmoc保护，生成fmoc
‑
a(2ni)，用于标准fmoc固相多肽合成(spps)；
8.s2：在非天然氨基酸fmoc
‑
a(2ni)的基础上进行多肽序列固相合成。多肽序列的合成是通过标准fmoc固相多肽合成(spps)方法合成，以哌啶作为脱保护剂，苯并三氮唑
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)为缩合剂；合成了fmoc
‑
a(2ni)ve的多肽分子，分别考察了它的ntr响应性以及酶还原前后的组装形貌变化；
9.s3：在筛选出的具有ntr还原性及形貌转变的多肽分子fmoc
‑
a(2ni)ve的基础上，通过硫醇亲核取代反应将ir780近红外荧光分子共价连接到a(2ni)ve三肽上得到具有荧光成像功能的衍生物多肽组装基元ir780
‑
a(2ni)ve。
10.s4：将步骤s2合成的fmoc
‑
a(2ni)ve多肽分子和s3合成的多肽组装基元ir780
‑
a(2ni)ve在水溶液中按照95:5摩尔比例共组装，得到多肽共组装体系溶液，再经过退火后得到乏氧响应形貌转变的荧光探针。
11.多肽纳米探针的性能表征
12.s5：将步骤s4得到的含有荧光染料组分的共组装多肽纳米探针置于ntr还原条件下，形貌表征以及荧光光谱测试证明，多肽纳米探针还原后，纳米探针的形貌发生转变，由纳米纤维转变为纳米颗粒，而且纳米探针的荧光得到明显增强。
13.s6：将步骤s4得到的纳米探针进行进一步的细胞实验和动物实验，证明该多肽纳米探针，具有优异的肿瘤深部渗透能力和肿瘤乏氧成像性能。
14.在本发明的进一步实施方案中，步骤s4中：含有荧光染料具有近红外荧光成像功能的多肽组装基元占多肽共组装体系的总摩尔数的比例在5％；所述多肽共组装体系溶液的物质的量浓度在0.1微摩尔每升到10毫摩尔每升；所述多肽共组装体系溶液的退火温度在10
‑
100℃之间，所述的退火时间为0.1
‑
100小时，溶剂为缓冲液或水，其中水为超纯水、去离子水或milli
‑
q水。
15.在本发明的进一步实施方案中，步骤s5中：所述ntr还原响应的形貌转变多肽纳米探针的还原条件为硝基还原酶ntr和还原性辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nadph；ntr浓度范围在0.1微克每毫升到100微克每毫升，nadph浓度范围在0.1毫摩尔每升到1毫摩尔每升；温度在37℃，还原时间为0.1
‑
100小时。
16.在本发明的进一步实施方案中，步骤s6中：细胞实验所用的正常细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(3t3)；细胞实验中所用的癌细胞为小鼠乳腺癌细胞(4t1)。
17.本发明还提供了上述方法制备的硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针。在乏氧ntr酶作用下，纳米探针中的2
‑
硝基咪唑能够被还原，从而使纳米探针的形貌由纳米纤维转变为纳米颗粒，并恢复染料分子的近红外荧光。
18.本发明还提供了硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的应用，所述硝基还原酶响应氨基酸可用于调控多肽组装及制备肿瘤乏氧荧光探针。该探针在肿瘤乏氧区域ntr作用下会发生纳米纤维到纳米颗粒的形态学转变提高肿瘤深处渗透能力，并点亮染料分子的近红外荧光对肿瘤乏氧区域进行近红外荧光成像。所述硝基还原酶响应氨基酸在调控多肽组装和肿瘤乏氧荧光探针领域具有应用价值。
19.本发明的优点和有益效果：
20.(1)本发明采用的多肽序列具有良好的生物相容性、生物活性，多肽作为生物体内
重要的生物活性物质，具有良好的生物兼容性，序列易于设计合成的特点，可以通过合理设计和调控组装序列中的分子结构，实现对组装过程中的热力学和动力学控制。(2)本发明通过合理设计含有2
‑
硝基咪唑的有序组装结构的多肽序列，得到具有ntr还原响应形貌转变性能的多肽组装体。(3)本发明通过将具有荧光成像功能的染料分子共价连接到还原响应形貌转变多肽中，通过共组装的方式得到一种多肽纳米探针。该多肽纳米探针在乏氧ntr作用下，2
‑
硝基咪唑被还原，使纳米探针的形貌发生转变，由纳米纤维转变为纳米颗粒，同时染料分子的荧光发射得到恢复。(4)本发明提供的ntr还原响应形貌转变多肽纳米探针够在肿瘤部位有效积累和保留，还原响应引起的纳米纤维到纳米颗粒组装结构的转变促进多肽纳米探针向肿瘤深处渗透，提高深度乏氧区域的荧光成像效果。(5)本发明提供的可用于多肽可控组装的硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法简单，反应条件温和，操作简便，易于工业化，在肿瘤乏氧领域具有巨大的应用潜力。
21.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
22.图1为本发明实施例中的具有ntr还原性的2
‑
硝基咪唑修饰的丙氨酸非天然氨基酸合成路线图和多肽序列fmoc
‑
a(2ni)ve基元和含有荧光染料具有荧光成像功能的多肽组装基元ir780
‑
a(2ni)ve的分子结构式图(1：芴甲氧羰基
‑
丙氨酸(2
‑
硝基咪唑)合成路线图，2：芴甲氧羰基
‑
丙氨酸(2
‑
硝基咪唑)
‑
缬氨酸
‑
谷氨酸，3：ir780
‑
丙氨酸(2
‑
硝基咪唑)
‑
缬氨酸
‑
谷氨酸)；
23.图2为本发明实施例中的ntr还原响应非天然氨基酸超高效液相色谱
‑
质谱uplc
‑
ms图；其中a是fmoc
‑
a(2ni)的uplc图，b是fmoc
‑
a(2ni)的电感耦合等离子质谱(esi
‑
ms)图；
24.图3为本发明实施例中的非天然氨基酸在ntr酶还原前后的uplc图；
25.图4为本发明实施例中的非天然氨基酸在ntr酶还原前(a)后(b)的质谱图；
26.图5本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽组装基元在还原前后的uplc图；其中a是fmoc
‑
a(ni)ve在酶ntr/nadph还原前后的uplc图，b是fmoc
‑
a(2ni)ve在酶还原前的esi
‑
ms图，c是fmoc
‑
a(2ni)ve在酶还原前的esi
‑
ms图；
27.图6为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽组装基元在还原前后的圆二色表征图；
28.图7为本发明实施例中的ntr响应非天然非氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针组装体的原子力显微镜图和透射电子显微镜图；其中a是多肽纳米探针组装体的原子力显微镜图，b是多肽纳米探针组装体的透射电子显微镜图；
29.图8为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针还原后组装得到的原子力显微镜图和透射电子显微镜图；其中a是多肽纳米探针还原后组装得到的原子力显微镜图，b是多肽纳米探针还原后组装得到的透射电子显微镜图；
30.图9为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针在ntr作用前后的荧光发射光谱谱图；
31.图10为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针在其它生物刺激源下的荧光发射光谱谱图；
32.图11为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针的4t1和3t3细胞存活率分析；其中a是多肽纳米探针的4t1细胞存活率分析，b是多肽纳米探针的3t3细胞存活率分析；
33.图12为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针在细胞正常氧和乏氧条件下激光共聚焦图片；
34.图13为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针的体内生物乏氧成像；
35.图14为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针的各器官分布研究；
36.图15为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针的各器官he染色研究；
37.图16为本发明实施例中的ntr响应非天然氨基酸制备的还原响应形貌转变多肽纳米探针的肿瘤渗透冷冻切片激光共聚焦图片。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
39.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
40.以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值
±
标准差。
41.下面结合具体实施例对本发明提供的一种含有2
‑
硝基咪唑修饰丙氨酸的非天然氨基酸的还原响应形貌转变多肽纳米探针的制备方法作进一步说明。
42.实施例1
43.本实施例提供的是一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，所述探针包括：多肽序列fmoc
‑
a(2ni)ve基元和含有荧光染料具有荧光成像功能的多肽组装基元ir780
‑
a(2ni)ve；制备过程包括：
44.s1：通过光延反应合成硝基还原酶响应的2
‑
硝基咪唑修饰丙氨酸(fmoc
‑
a(2ni)):
45.基于光延反应，在无水四氢呋喃溶剂里，偶氮二甲酸二异丙酯(diad)和三苯基膦(tpp)存在下，2
‑
硝基咪唑与三苯甲基保护的丝氨酸甲酯(trt
‑
l
‑
ser
‑
ome)反应生成trt
‑
a(2ni)
‑
ome。随后用tfa和lioh处理相应的中间体以去除三苯甲基并水解甲基酯基团。随后，最终对a(2ni)的氨基进行fmoc保护，生成fmoc
‑
a(2ni)，如图1所示；
46.s2：通过固相多肽合成的方法设计合成多肽序列：
47.多肽自组装基元：在非天然氨基酸fmoc
‑
a(2ni)的基础上进行多肽序列固相合成；多肽序列的合成是通过标准fmoc固相多肽合成(spps)方法合成，以哌啶作为脱保护剂，苯并三氮唑
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)为缩合剂，合成了多肽组装基元芴甲氧羰基
‑
丙氨酸(2
‑
硝基咪唑)
‑
缬氨酸
‑
谷氨酸(fmoc
‑
a(2ni)ve)多肽分子；
48.含有染料分子具有荧光成像功能的多肽组装基元：在合成的具有ntr还原性及形
貌转变的多肽分子fmoc
‑
a(2ni)ve的基础上，通过硫醇亲核取代反应将ir780近红外荧光分子共价连接到a(2ni)ve三肽上得到含有染料分子具有荧光成像功能的多肽组装基元ir780
‑
丙氨酸(2
‑
硝基咪唑)
‑
缬氨酸
‑
谷氨酸(ir780
‑
a(2ni)ve)；
49.固相树脂投料均为0.25毫摩尔，多肽序列的合成是通过标准fmoc固相多肽合成(spps)方法合成，以哌啶作为脱保护剂，苯并三氮唑
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)为缩合剂，合成了fmoc
‑
a(2ni)ve的多肽分子，产率90％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥99％。
50.s3：将步骤s2中设计合成的两种多肽以多肽序列fmoc
‑
a(2ni)ve作为自组装基元，将ir780
‑
a(2ni)ve与fmoc
‑
a(2ni)ve以5：95的摩尔比例进行共组装，得到多肽共组装体系溶液，再经过退火后得到乏氧响应形貌转变的荧光探针。
51.实施例2
52.将本发明实施例1制备得到的fmoc
‑
a(2ni)溶解于pbs溶液中，对其进行超高效液相色谱质谱uplc
‑
ms表征。如图2所示。
53.实验结果：从图上2uplc(a)和esi
‑
ms(b)表征上可以观察到，纯度≥99％的fmoc
‑
a(2ni)目标分子被成功制备。
54.实施例3
55.将本发明实施例1制备得到的fmoc
‑
a(2ni)，溶解到pbs溶液中(50μm),随后分别添加20μg/ml的ntr还原酶和1mm的辅酶nadph。混合液用n2脱除o2半小时后，将混合液放置37℃水浴中继续反应一小时。反应完成后，对其进行超高效液相色谱质谱(uplc
‑
ms)表征。如图3，图4所示。
56.实验结果：从图3uplc
‑
ms表征上可以观察到，经过ntr/nadph作用后，对应fmoc
‑
a(2ni)的吸收峰消失，出现了极性更大的新峰，结合图4质谱数据得出生成了对应的还原产物。
57.实施例4
58.将本发明实施例1制备得到的多肽组装基元fmoc
‑
a(2ni)ve，溶解到pbs溶液中(50μm),随后分别添加20μg/ml的ntr还原酶和1mm的辅酶nadph。混合液用n2脱除o2半小时后，将混合液放置37℃水浴中继续反应一小时。反应完成后，对其进行超高效液相色谱质谱(uplc
‑
ms)表征。如图5所示。
59.实验结果：从图5uplc
‑
ms表征上可以观察到，经过ntr/nadph作用后，对应fmoc
‑
a(2ni)ve的吸收峰消失，出现了极性更大的新峰，结合质谱数据得出生成了对应的还原产物。
60.实施例5
61.将本发明实施例1制备得到的多肽主体组装基元fmoc
‑
a(2ni)ve和还原产物进行圆二色(cd)表征，如图6所示。
62.实验结果：从圆二色光谱中可以看出，多肽组装基元fmoc
‑
a(2ni)ve在215和270nm处有两个正峰，在195nm处有一个负峰，是芳香环多肽形成有序结构的构象信号，还原后的多肽产物仅在195nm处有一个负峰，是典型的无规卷曲构象信号。说明该多肽主体组装基元能够由还原前的有序二级结构转变为还原后的无规卷曲二级结构，实现还原响应的二级结构的变化。
63.实施例6
64.将本发明实施例1退火制备得到的组装结构在原子力显微镜(afm)以及场发射透射电子显微镜(tem)下观察，如图7所示。
65.实验结果：从原子力显微镜以及场发射透射电子显微镜图片中能够观察到明显的纳米纤维结构，说明该多肽纳米探针能够成功组装成有序的纤维结构。
66.实施例7
67.将多肽组装基元fmoc
‑
a(2ni)ve与荧光成像功能多肽组装基元ir780
‑
a(2ni)ve分别用na2s2o4完全还原后，将两者按照95:5的摩尔比进行共混，随后在水溶液中进行退火组装，退火温度为80℃，组装时间为48小时，将得到的纳米探针的还原组装体在原子力显微镜(afm)以及场发射透射电子显微镜(tem)下观察，如图8所示。
68.实验结果：从原子力显微镜以及场发射透射电子显微镜图片中能够观察到，经过还原后，多肽纳米探针的纤维结构消失，转变为纳米颗粒的组装结构，说明多肽纳米探针能够实现还原响应的形貌转变，由纳米纤维转变为纳米颗粒。
69.实施例8
70.将本发明实施例1制备得到的多肽纳米探针用pbs缓冲液稀释后，加入ntr还原酶和nadph辅酶。混合液在通入n2半小时除氧后，继续在37℃水浴中反应一小时后进行荧光发射光谱的测试，激发波长为780nm,荧光发射范围为790
‑
900nm，如图9所示。
71.实验结果：荧光光谱显示，经过酶ntr和辅酶nadph作用后，ir780的荧光强度明显增强。该结果表明芳香肽中的残基a(2ni)可以通过pet机制作为ir780的淬灭剂。将硝基咪唑转化为氨基咪唑基团后会阻止pet过程，从而恢复多肽ir780
‑
a(2ni)ve内ir780染料的荧光强度实现ntr响应的荧光成像功能。
72.实施例9
73.将本发明实施例1制备得到的多肽纳米探针用pbs缓冲液稀释后，加入nadph辅酶作为对照组，并在对照组基础上分别加入氯化钠(10mm),氯化钾(10mm),氯化钙(2.5mm),氯化镁(2.5mm),过氧化氢(10μm),次氯酸钠(10μm),谷胱甘肽(2mm),抗坏血酸c(1mm),葡萄糖(10mm),或者ntr(20μg/ml)。混合液在通入n2半小时除氧后，继续在37℃水浴中反应一小时后进行荧光发射光谱的测试，激发波长为780nm,荧光发射范围为790
‑
900nm，如图10所示。
74.实验结果：荧光光谱显示，该多肽纳米探针仅在ntr作用下能够发生明显的荧光增强，其他物质的加入引起的荧光变化是很微弱的。该结果表明制备的超分子纳米探针对ntr酶响应具有高选择性。
75.实施例10
76.将本发明实施例1制备得到的还原响应形貌转变多肽纳米探针，通过细胞存活率的测试来评价该纳米探针的生物相容性。
77.4t1和3t3细胞的体外细胞存活率通过标准甲基噻唑基四唑(mtt)测定进行评估。将4t1和3t3细胞以8
×
103/孔的细胞密度铺到96孔细胞培养板中。分别在常氧和乏氧条件下孵育24小时后，在4t1和3t3细胞中分别加入含有不同浓度纳米探针的新鲜培养基。在常氧或乏氧条件下，将细胞在37℃下再培养24小时。在96孔板的每孔中加入mtt溶液(10μl)并孵育4小时。除去培养基后，每孔加入100μldmso。使用酶标仪测量每个孔在490nm处的吸光度。
78.实验结果：如图11所示，该还原响应的多肽超分子纳米探针在正常氧和乏氧条件下对4t1和3t3细胞存活率几乎没有影响，表明其具有良好的生物相容性。
79.实施例11
80.将本发明实施例1制备得到的氧化响应形貌转变多肽纳米药物，通过激光共聚焦扫描显微镜监测纳米探针对细胞乏氧的成像能力。
81.将4t1细胞以1
×
105的细胞密度铺在共聚焦玻璃皿中，起初在培养箱正常氧条件下培养增殖。随后将4t1细胞分别在正常氧和乏氧条件下分别培养12h后,加入含有多肽纳米探针的新鲜培养基，继续在正常氧和乏氧条件下培养1小时。培养至预定时间后，用pbs缓冲液洗涤细胞3次后，将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，再用细胞核染料dapi共孵育20分钟。通过激光共聚焦扫描显微镜进行观察，如图12所示。
82.实验结果：从激光共聚焦显微镜图片中可以看出，与纳米探针在乏氧条件下共孵育的4t1细胞内可以明显观察到ir780染料的红色荧光，而在正常氧培养的4t1细胞内仅观察到微弱的红色荧光信号，这说明该纳米探针的荧光可以在ntr作用下得到恢复从而对乏氧癌细胞进行生物成像。
83.实施例12
84.将本发明实施例1制备得到的还原响应形貌转变多肽纳米探针，进行体内生物乏氧成像和各组织分布的研究。
85.将4t1细胞(3
×
106)通过皮下注射方式到雌性balb/c小鼠右侧腋下，建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤直径生长到大约8mm时，对小鼠皮下注射多肽纳米探针，随后，分别在注射后2、4、8、12小时后，麻醉小鼠后，使用活体成像系统对小鼠进行成像。12小时以后，处死小鼠，收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾)和肿瘤组织，使用相同的成像系统进行离体组织成像以观察纳米探针在各组织中的分布情况，如图13和图14所示。
86.实验结果：从活体成像结果可以观察到，在肿瘤组织附近能够长时间观察到明显的多肽纳米探针的红色荧光信号，说明多肽纳米探针能够成功在肿瘤部位富集并在乏氧ntr作用下激活染料分子荧光从而进行肿瘤乏氧区域选择性成像。另外，在小鼠给药12小时后，在肿瘤部位依然能够观察到明显的多红色荧光信号，这意味着该多肽纳米探针在肿瘤部位具有较长的保留时间。各离体主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾)和肿瘤组织荧光成像结果表明，多肽纳米探针在肿瘤组织中的荧光强度明显高于各正常器官，这些结果说明多肽超分子纳米探针能够能够对实体瘤进行有效的荧光成像。
87.实施例13
88.将本发明实施例1制备得到的还原响应形貌转变多肽纳米探针，进行体内生物器官的he染色研究。
89.在注射纳米探针12小时以后，处死小鼠，对收集到的主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾)进行解剖并固定在4％多聚甲醛中，随后进行苏木精和伊红(h&e)染色测定。如图15所示。
90.实验结果：从h&e染色测试结果观察到，该纳米探针未引起主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾)明显的变化，说明该多肽超分子探针具有良好的体内生物相容性。
91.实施例14
92.将本发明实施例1制备得到的还原响应形貌转变多肽纳米探针，进行实体肿瘤渗
透性能研究。
93.将4t1细胞(3
×
106)通过皮下注射方式到雌性balb/c小鼠右侧腋下，建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤直径生长到大约8mm时，对小鼠进行分组，分别对小鼠皮下注射多肽纳米探针(i)以及fmoc
‑
a(2ni)ve和ir780
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a(2nh2i)ve的共组装体(ii)，其中ii组提前瘤内注射ntr抑制剂双香豆素抑制酶活性。在给药4小时后，处死小鼠，解剖获得肿瘤组织，进行冷冻切片和dapi染色，在激光共聚焦扫描显微镜下观察肿瘤切片中多肽纳米探针的肿瘤渗透情况，如图16所示。
94.实验结果：从肿瘤切片的激光共聚焦图片中可以看出，肿瘤边缘处具有较强的红色荧光信号，说明多肽纳米探针能够在肿瘤组织处富集并在乏氧ntr作用下激活荧光。另外，能够观察到i组多肽纳米探针处理后的肿瘤组织切片中，在肿瘤的深部区域有较强的多肽纳米探针荧光信号，而ii组经过抑制剂预先处理的对照组装体的肿瘤组织切片中的荧光信号主要集中在肿瘤边缘处。这说明经过乏氧条件的ntr作用后，多肽纳米探针向肿瘤组织内部的渗透性增强。这可能是由于ntr还原2
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硝基咪唑增大极性后，多肽组装体形貌发生了转变，从纳米纤维转变为纳米颗粒，从而提高了多肽纳米探针向肿瘤组织深处乏氧区域的渗透能力。