柯萨奇病毒A16型毒株及其免疫原性组合物和应用的制作方法

柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用。


背景技术：

2.手足口病（hand foot and mouth disease，hfmd）是由小rna病毒科肠道病毒属的肠道病毒（enterovirus，ev）感染引起的一种儿童常见传染病，5岁以下儿童多发，典型表现为手、足、口腔等部位有皮疹、疱疹、溃疡等，可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症会导致残疾或死亡，是一种全球性疾病。
3.手足口病的主要致病血清型包括柯萨奇病毒（coxsackievirus，cv）a组4～7、9、10、16型和b组1～3、5型，埃可病毒（echovirus）的部分血清型和肠道病毒71型（enterovirus a71，ev
‑
a71）等，其中以cv
‑
a16和ev
‑
a71最为常见，重症及死亡病例多由ev
‑
a71所致。近年部分地区cv
‑
a6、cv
‑
a10感染有增多趋势。肠道病毒各型之间无交叉免疫力。
4.与ev71感染相比，柯萨奇病毒a16型（ca16）感染引起的手足口病虽然症状相对较轻，但具有更强的传播力，而目前上市的疫苗皆为针对ev71病毒的疫苗，尚没有保护ca16病毒感染的疫苗，而ev71疫苗对ca16并无交叉保护作用。因此，研发ca16疫苗对于控制手足口病的爆发具有重大的意义。
5.病毒毒株的免疫原性、稳定性、交叉中和能力是疫苗株筛选的重要指标。
6.ca16的基因组由7000多个核苷酸组成，为单股正链rna病毒。rna病毒因其rna聚合酶的低保真度和频繁的重组现象（zhao, k. (2011).circulating coxsackievirus a16 identified as recombinant type a human enterovirus, china. emerging infectious diseases.doi:10.3201/eid1708.101719）,导致核苷酸易发生突变，据文献报道（zhang, y., et al. (2009). molecular evidence of persistent epidemic and evolution of subgenotype b1 coxsackievirus a16
‑
associated hand, foot, and mouth disease in china. journal of clinical microbiology, 48(2), 619
–
622.doi:10.1128/jcm.02338
‑
09），其年变异速度可达0.91
×
10
‑2/核苷酸。ca16的结构蛋白p1由vp1、vp2、vp3和vp4组成，其中，vp4位于衣壳内部；vp1、vp2和vp3位于病毒颗粒的表面，是抗原决定簇的主要区域。研究表明，ca16的免疫原性对抗原结构的依赖性较大（chong, p., et al. (2012). immunological and biochemical characterization of coxsackie virus a16 viral particles. plos one, 7(11), e49973. doi:10.1371/journal.pone.0049973；卢佳,张林林,安泰学,毛群颖,李鹏飞,张夫坤,王泽鋆,李黎,周辉,王继麟,陈晓琦,梁争论,申硕.柯萨奇病毒a16疫苗候选株免疫效果评价[j].中国病毒病杂志,2018,8(06):487
‑
494.）。因此，除了关注常规的抗原表位主要区域vp1的序列外，结构蛋白p1其它序列的改变也可能引起ca16结构及免疫原性的改变，而目前并未发现关于ca16的p1序列稳定性的的研究及报道。
[0007]
不同基因型、不同亚型、甚至同一亚型不同来源的毒株间抗原性也具有一定差异，
这会导致不同毒株的交叉保护水平可能存在差异。因此，ca16毒株的交叉保护能力是疫苗毒株筛选的另一难点。yang等研究表明ca16毒株（g20，b基因型）制备的疫苗，小鼠免疫血清对同基因型毒株的中和效价≤1：256，对a基因型（g10）则中和效价＜ 1：16（yang, e., et al. (2014). comparative study of the immunogenicity in mice and monkeys of an inactivated ca16 vaccine made from a human diploid cell line. human vaccines & immunotherapeutics, 10(5), 1266
–
1273.doi:10.4161/hv.28083）。谢等研究表明ca16毒株间具有较好的交叉活性，但其选择的4个毒株皆为b基因型（谢振锋,普晶,黄泓泰,刘正玲,董承红,刘龙丁,王丽春.柯萨奇病毒a组16型免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析[j].中国生物制品学杂志,2013,26(10):1366
‑
1370 1375.），而卢等的研究则表明不同基因型之间，甚至亚基因型之间可能仅存在较低的交叉中和活性或单侧交叉（卢佳,张林林,安泰学,毛群颖,李鹏飞,张夫坤,王泽鋆,李黎,周辉,王继麟,陈晓琦,梁争论,申硕.柯萨奇病毒a16疫苗候选株免疫效果评价[j].中国病毒病杂志,2018,8(06):487
‑
494），这与yang等研究结果是一致的，因此目前的研究报道中并未筛选到对各基因型、基因亚型毒株皆有较好的中和交叉能力的ca16毒株。


技术实现要素：

[0008]
本发明的第一目的是提供一种柯萨奇病毒a16型毒株。
[0009]
本发明的第二目的是提供与该柯萨奇病毒a16型毒株相关的生物材料。
[0010]
本发明的第三目的是提供含有该柯萨奇病毒a16型毒株或其相关生物材料的免疫原性组合物以及疫苗、药物等产品。
[0011]
本发明的第四目的是提供上述毒株、生物材料、免疫组合物的用途。
[0012]
具体地，本发明提供以下技术方案：首先，本发明提供一种柯萨奇病毒a16型毒株，其含有p1结构蛋白以及非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d；其中，p1结构蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d的氨基酸序列分别如seq id no.4
‑
10所示。
[0013]
具体地，本发明提供的柯萨奇病毒a16型毒株的基因组编码序列如seq id no.1所示的p1结构蛋白以及序列如seq id no.4
‑
10所示的非结构蛋白。
[0014]
本发明提供序列如seq id no.1所示的p1结构蛋白与序列如seq id no.4
‑
10所示的非结构蛋白组成的融合蛋白。
[0015]
优选地，所述柯萨奇病毒a16型毒株的基因组中，p1结构蛋白的编码基因序列如seq id no.2所示，非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d的编码基因序列分别如seq id no.11
‑
17所示。
[0016]
以上所述的结构蛋白和非结构蛋白的编码基因在所述柯萨奇病毒a16型毒株的基因组上的排列顺序为（5
’‑3’
）：p1结构蛋白编码基因、2a蛋白编码基因、2b蛋白编码基因、2c蛋白编码基因、3a蛋白编码基因、3b蛋白编码基因、3c蛋白编码基因、3d蛋白编码基因。
[0017]
本发明提供由如seq id no.2所示的基因以及如seq id no.11
‑
17所示的基因顺次连接组成的重组核酸分子。
[0018]
以上所述的柯萨奇病毒a16型毒株的基因组序列还包括5
’‑
utr序列和3
’‑
utr序列，5
’‑
utr序列如seq id no.18所示，3
’‑
utr序列如seq id no.19所示。
[0019]
进一步优选地，所述柯萨奇病毒a16型毒株的基因组序列如seq id no.3所示或如seq id no.3所示序列的互补序列所示。
[0020]
具体地，本发明提供柯萨奇病毒a16型毒株v00080265，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒a16型，保藏编号为cgmcc no.20387。
[0021]
柯萨奇病毒a16型毒株v00080265的基因组编码序列如seq id no.1所示的p1结构蛋白以及序列如seq id no.4
‑
10所示的非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d，其基因组序列如seq id no.3所示。
[0022]
本发明提供的上述柯萨奇病毒a16型毒株的免疫原性好、交叉中和能力强、稳定性好，能够以vero等细胞作为基质细胞进行快速繁殖。
[0023]
进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒a16型毒株相关的生物材料，其为以下（1）
‑
（6）中的任意一种：（1）序列如seq id no.3所示或如seq id no.3所示序列的互补序列所示的核酸分子；（2）含有（1）中所述核酸分子的表达盒；（3）含有（1）中所述核酸分子的重组载体；（4）含有（1）中所述核酸分子的重组微生物；（5）含有（1）中所述核酸分子的细胞系；（6）检测（1）中所述核酸分子的引物或探针。
[0024]
以上（1）中所述的核酸分子可为dna分子或rna分子。
[0025]
以上（2）中所述的表达盒为在（1）中所述的核酸分子的上游、下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。
[0026]
以上（3）中所述的重组载体为携带（1）中所述的核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。
[0027]
以上（4）中所述的微生物可为细菌或病毒。
[0028]
以上（5）中所述的细胞系为动物细胞系。所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于rd细胞、非洲绿猴肾传代细胞（vero）等。
[0029]
以上（6）中所述的引物、探针为能够与（1）中所述核酸分子结合并进行pcr扩增的寡核苷酸。
[0030]
本发明提供所述柯萨奇病毒a16型毒株的病毒样颗粒（vlps），其含有p1结构蛋白以及选自非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d中的任意一种或多种；其中，所述p1结构蛋白具有如seq id no.1所示的序列，所述非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d分别具有如seq id no.4
‑
10所示的序列。
[0031]
以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述结构蛋白、非结构蛋白的编码基因。
[0032]
本发明提供含有以上所述的柯萨奇病毒a16型毒株的免疫原性组合物。
[0033]
本发明还提供含有以上所述的生物材料的免疫原性组合物。
[0034]
本发明还提供含有以上所述的病毒样颗粒的免疫原性组合物。
[0035]
所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒a16型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒a16型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。
[0036]
所述免疫组合物中的柯萨奇病毒a16型毒株被灭活。
[0037]
用于灭活病毒的灭活剂可以为甲醛或β
‑
丙内酯。
[0038]
优选地，所述免疫原性组合物中，柯萨奇病毒a16型毒株的蛋白浓度为1
‑
5μg/ml，铝佐剂含量为0.5
‑
1.5μg/ml。所述铝佐剂可以为氢氧化铝或磷酸铝佐剂。
[0039]
进一步地，本发明提供所述柯萨奇病毒a16型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物的如下任意一种应用：（1）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的疫苗中的应用；（2）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物中的应用；（3）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗体中的应用；（4）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗血清中的应用；（5）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；（6）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；（7）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；（8）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；（9）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；（10）在预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物的筛选或药效评价中的应用。
[0040]
以上（1）
‑
（10）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒a16型毒株。
[0041]
以上（1）
‑
（4）和（10）中，所述柯萨奇病毒引起疾病优选为手足口病。
[0042]
以上（9）中，所述的动物模型优选为鼠模型。
[0043]
本发明提供一种抗体或抗血清，其为以所述柯萨奇病毒a16型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物为免疫原制备得到。
[0044]
本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，其包括：以所述柯萨奇病毒a16型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原免疫动物，经分离获得抗柯萨奇病毒a16型的抗体或抗血清。
[0045]
本发明提供一种产品，其含有以下（1）
‑
（5）中的任意一种或多种的组合：（1）所述柯萨奇病毒a16型毒株；（2）所述生物材料；（3）所述病毒样颗粒；（4）所述免疫原性组合物；（5）所述柯萨奇病毒a16型毒株的抗体或抗血清。
[0046]
以上所述的产品优选为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒a16型感染的产品，或者为用于柯萨奇病毒a16型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒a16型感染动物模型构建的产品。其中，用于诊断柯萨奇病毒a16型感染的产品可为诊断试剂或试剂盒；用于预防或治疗柯萨奇病毒a16型感染的产品可为疫苗或药物。
[0047]
作为一种实施方式，本发明提供预防柯萨奇病毒a16型感染的疫苗，其含有所述柯
萨奇病毒a16型毒株。
[0048]
本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。
[0049]
优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒a16型毒株被灭活。所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。
[0050]
本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒a16型毒株在细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活、纯化后获得疫苗原液。
[0051]
所述疫苗的制备方法还包括：将所述疫苗原液与佐剂混合。所述佐剂优选为铝佐剂。
[0052]
优选地，所述疫苗中，柯萨奇病毒a16型的蛋白浓度为1
‑
5μg/ml。
[0053]
优选地，所述疫苗中，铝佐剂浓度为0.5
‑
1.5μg/ml。
[0054]
作为本发明的一种优选方案，所述疫苗的制备方法包括：将所述柯萨奇病毒a16毒株在vero细胞上进行扩大培养，按moi=0.0001
‑
0.1接种病毒，待病变达 ~ 时，收获病毒液，经离心，灭活、纯化等步骤后，按蛋白浓度为1μg~5μg/ml与铝佐剂浓度为0.5~1.5μg/ml混合，制备得到灭活疫苗。
[0055]
以上所述的方法中，扩大培养方式可采用细胞工厂或生物反应器中进行。
[0056]
以上所述的方法中，灭活方式可采用与病毒液的体积比为1:1000~1:5000的甲醛灭活2~6天，或者采用与病毒液的体积比为1:1000~1:4000的β
‑
丙内酯于5
±
3℃灭活1~3天，然后37℃水解1~4小时。
[0057]
作为另一种实施方式，本发明提供治疗柯萨奇病毒a16型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒a16型毒株的抗体或抗血清。
[0058]
本发明还提供以上所述的产品在预防或治疗柯萨奇病毒a16型感染或柯萨奇病毒a16型感染引起疾病中的应用。
[0059]
本发明的有益效果在于：本发明提供了一株免疫原性好（具有较高的血清中和效价）、交叉中和能力强（与柯萨奇病毒a16型的不同基因型、不同亚型均具有较好的交叉保护力）、稳定性好（具有较高的遗传稳定性、病毒滴度稳定性和免疫原性稳定性）、vero细胞适应的柯萨奇病毒a16型毒株，该毒株可用于制备预防柯萨奇病毒a16型感染或柯萨奇病毒a16型引起疾病的疫苗。利用该毒株制备的疫苗可预防柯萨奇病毒a16型感染或柯萨奇病毒a16型引起的手足口病，具有较好的免疫效果。
附图说明
[0060]
图1为本发明实施例3中不同代次病毒滴度的检测结果。
[0061]
图2为本发明实施例3中不同代次毒株动物免疫后血清的中和效价检测结果。
[0062]
图3为本发明实施例4中ca16免疫血清对各基因型毒株的交叉中和效价检测结果。
具体实施方式
[0063]
本发明中术语的解释：moi（multiplicity of infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。选择合适的moi值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。
[0064]
细胞病变效应（cytopathiceffect）：在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆、坏死、从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用，简写cpe。cpe程度常用 ~ 表示：1 ，<25%；2 ，25%
‑
50%；3 ，50%
‑
75%；4 ，75%
‑
100%。
[0065]
本发明在临床手足口患者的标本中分离获得了一株柯萨奇病毒a16型毒株，将该毒株命名为v00080265。该毒株是一株vero细胞适应株，具有较高的免疫原性、较强的交叉中和能力，同时具有较高的稳定性。
[0066]
本发明中，柯萨奇病毒a16型毒株（ca16）的筛选和性能验证过程大致概括如下：将临床手足口病患者的标本经过处理，接种于非洲绿猴肾传代细胞（vero）上，盲传三代，经鉴定、测序、动物免疫等初步筛选与评价后，经3次蚀斑纯化，得到ca16纯化毒株，将ca16毒株按适应的moi进行连续传代，对不同代次进行免疫原性检测及基因序列检测，同时对该毒株的小鼠免疫血清进行基因型内与型间的交叉中和能力评价，并选用vero细胞进行ca16毒株培养，收获病毒液、灭活、纯化后，得到疫苗原液，制备ca16疫苗，进行小鼠动物免疫。
[0067]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0068]
实施例1ca16毒株的分离及培养（一）临床样本的处理1、粪便标本和肛拭子的处理：（1）在离心管上标记标本号；（2）每管中加入10ml磷酸盐缓冲溶液（pbs）、1g玻璃珠、1ml氯仿；（3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；（4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于
‑
20℃；（5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；（6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；（7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；（8）1管粪便悬液冻存于
‑
20℃作为备份，另1管存于4
‑
8℃以备接种。
[0069]
（2）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在2~8℃条件下，10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上。如果发现有细菌污染，需用滤器过滤除菌。
[0070]
（3）病毒分离将处理好的样品，按一定比例接种至80
‑
90%密度的健康无污染非洲绿猴肾传代细胞（vero）中，35℃、5%co2培养箱中吸附0.5
‑
1.5小时，补液至培养体积，35℃、5%co2培养箱中培养，同时设置未加样本的细胞对照。
[0071]
使用倒置显微镜每天观察细胞，如出现肠道病毒致细胞病变效应（cpe）：细胞变圆，折光增强并脱离管壁等，记录其变化，连续观察7天内接种孔和对照孔细胞所发生的变
化cpe（1 ~4 ）。
[0072]
如cpe出现，观察到75%的细胞发生变化（3 ），收获培养液并储藏在
‑
20℃以下冰箱，冻融3次后，2000 rpm、4℃离心10 min，进行下一次传代，连续培养3代后，将第4代病毒液冻存。如7d后没有cpe出现，则继续盲传3代，如仍未出现cpe，则判定为阴性。
[0073]
经上述分离、培养以及病毒的免疫原性、交叉中和能力和稳定性的筛选，最终筛选得到一株免疫原性好、交叉中和能力强、且稳定性好的柯萨奇病毒a16型毒株v00080265，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒a16型，保藏编号为cgmcc no.20387。
[0074]
实施例2 ca16毒株的鉴定及检测将实施例1中收获的柯萨奇病毒a16型毒株v00080265（以下简称ca16毒株）的第4代病毒液进行分子学鉴定、基因组测序、滴度检测及免疫原性检测，具体如下：1、分子鉴定及基因组测序（1）采用rt
‑
pcr法鉴定病毒，肠道病毒核酸检测通用引物及vp1特异性引物如表1所示。表1所示的引物中，y代表c/t，m代表a/c，w代表a/t。
[0075]
表1 肠道病毒核酸检测通用引物及vp1特异性引物（2）病毒核酸提取取第4代病毒液，按照说明书添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸，将提取好的核酸保存至
‑
70℃冰箱。
[0076]
（3）hev
‑ꢀ
5utr通用引物pcr检测应用hev
‑
5utr的两对通用引物59f/588r与153f/541r进行巢式pcr。
[0077]
第1轮pcr扩增反应体系组成如表2所示。
[0078] 表2 第1轮pcr扩增反应体系反应程序如下：
55℃，30min;94℃，2min；20个循环：94℃，15s；55℃，30s;68℃，40s；68℃延伸5min。
[0079]
以第1轮pcr扩增产物为模板，进行第2轮pcr扩增，pcr扩增反应体系组成如表3所示。
[0080]
表3第2轮pcr扩增反应体系反应程序如下：94℃，2min；30个循环：94℃，15s；55℃，30s；72℃，40s；72℃延伸5min。
[0081]
（4）cv
‑
a16vp1特异性序列的扩增应用cv16
‑
vp1特异性引物进行vp1的扩增，反应体系组成如表4所示。
[0082]
表4vp1的pcr扩增反应体系反应程序如下：55℃，30min;94℃，2min；30个循环：94℃，15s；55℃，30s；68℃，70s；68℃延伸5min。
[0083]
（5）结果判断将pcr扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，hev
‑
5utr通用引物扩增产物目的条带大小为400bp，cv16
‑
vp1特异性条带大小为1kb，具体判定标准如表5所示，其中，ev（－）代
表hev
‑
5utr通用引物未扩增出目的条带，ev（＋）代表hev
‑
5utr通用引物扩增出目的条带；cv
‑
a16vp1（－）代表cv16
‑
vp1特异性引物未扩增出目的条带，cv
‑
a16vp1（＋）代表cv16
‑
vp1特异性引物扩增出目的条带。
[0084]
表5pcr扩增产物结果判断标准取鉴定为cv
‑
a16阳性的样本的第4代病毒液进行基因组测序，并根据vp1序列分型。经全基因组测序，柯萨奇病毒a16型毒株v00080265的基因组序列如seqidno.3所示，基因型为b1a型，其中，p1蛋白的编码基因序列如seqidno.2所示，p1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d的氨基酸序列如seqidno.4
‑
10所示，非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d的编码基因序列分别如seqidno.11
‑
17所示。
[0085]
2、滴度检测取第4代病毒液，10倍梯度稀释，从10
‑1稀释至10
‑8。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μlvero细胞悬液（1
×
105个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加病毒维持液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃、5%co2培养箱中静置培养，第7天判断结果，每个样品进行3次重复检测。
[0086]
病毒滴度计算：按behrens
‑
karber公式计算lgccid
50
。
[0087]
lgccid
50
=l
‑
d(s
‑
0.5)，其中：l=实验中使用的病毒的最低稀释度的对数值；d=稀释梯度的对数值；s=终判时阳性部分的总和（即出现cpe的细胞孔所占的比例之和）。
[0088]
具体参见中华人民共和国卫生部．手足口病预防控制指南(2009版)．[eb/ol]．(2009
‑
06
‑
04)http://www.gov.cn/gzdt/2009
‑
06/04/content_1332078.htm。
[0089]
经检测，柯萨奇病毒a16型毒株v00080265的病毒滴度结果为5.5lgccid
50
/ml。
[0090]
3、免疫原性检测取第4代病毒液，进行动物免疫。按病毒滴度5.5lgccid
50
/ml，免疫10只小鼠（nih，spf，雌性，18~22g），0、14天两针免疫，腹腔注射0.5ml/只，第14、28天采血，同时免疫病毒维持液作为对照。
[0091]
采用微量细胞病变法检测血清中和抗体，具体方法如下：将血清56℃，30min水浴灭活后，从1:8开始稀释，加入96孔板，每个样品2孔，100μl/孔，2倍倍比稀释后，加入32~320ccid
50
/0.05ml的病毒液，36
±
1℃，5%co2培养箱，中和1~2小时。加入rd细胞悬液（1~2
×
105个/ml），100μl/孔。置于5%co2培养7天，判定结果，中和效价＜8判为阴性，≥8为阳性。结果显示，柯萨奇病毒a16型毒株v00080265的病毒液一免后14天，100%阳转，二免疫后14天，血清中和效价gmts可达1：645；对照组的阳转率为0%，血清中和效价gmts＜1:8。
[0092]
实施例3ca16毒株的稳定性检测1、遗传稳定性将进行3次蚀斑纯化后的柯萨奇病毒a16型毒株v00080265，按相同moi进行连续传
代。具体方法如下：将代次≤147的健康无污染的vero细胞，接种于细胞培养瓶中，待生长至90%左右密度，按moi=0.0001~0.1接种病毒液，待病变达 ~ 时，收获病毒液，于
‑
60℃及以下保存。每收获一代，代次增加一代。将收获的病毒液采用同样的方法，连续传代至p15，取各代病毒收获液进行p1基因序列的扩增与测序。
[0093]
p1基因序列扩增引物如下，目的片段大小约3kb，扩增反应体系如表6所示。
[0094]
seqidno.26：cva16
‑
p1
‑
f1(5'
‑
3')：gttaccatatagctattggattggccatcc；seqidno.27：cva16
‑
p1
‑
r(5'
‑
3')：ctagagctgtcctcccacacaaggtttgcc。
[0095]
表6p1基因的pcr扩增反应体系反应程序如下：55℃，30min;94℃，2min；30个循环：94℃，15s；55℃，30s；68℃，3min；68℃延伸5min。
[0096]
将扩增的目的条带送检测序。测序结果显示，实施例1中蚀斑纯化前与蚀斑纯化后连续传代至p15的各代次p1序列100%一致，结果表明该毒株具有较高的遗传稳定性。
[0097]
2、滴度稳定性将上述1中的各代柯萨奇病毒a16型毒株v00080265进行滴度检测，方法同实施例2的滴度检测，结果如图1所示。
[0098]
结果表明，柯萨奇病毒a16型毒株v00080265不同代次的滴度稳定，p2~p15各代次的滴度值为5.7~6.0lgccid
50
/ml，结果表明该毒株具有较高的滴度稳定性。
[0099]
3、免疫原性稳定性取上述1中p5、p10、p15代次的柯萨奇病毒a16型毒株v00080265进行动物免疫，检测毒株的免疫原性。动物免疫方法及中和效价检测方法同实施例2的免疫原性检测。结果如图2所示，p5、p10、p15的动物免疫结果中和效价为1：527~1：1122，无统计学差异（p＞0.05），不同代次间免疫原性一致。
[0100]
实施例4ca16毒株的交叉中和能力检测将柯萨奇病毒a16型毒株v00080265的免疫血清（以下简称ca16免疫血清）分别与12株不同基因型、不同亚型的cv
‑
a16病毒株进行交叉中和检测，这12株毒株包括a、b、c三种基因型，其中3株a基因型（a2
‑
1、a2
‑
2、a各1株），8株b基因型（2株b1a以及b1、b
‑
1、b
‑
2、b
‑
3、b1b、b
‑
4各1株，1株c基因型。具体方法如下：试验前，先测定12株毒株的滴度，使每株病毒稀释适宜倍数后，病毒稀释能够准确落在32~320ccid
50
/0.05ml内。将柯萨奇病毒a16型毒株v00080265的免疫血清样品（参见实施例2的3中的免疫方法）于56℃，30min水浴灭活后，从
1:8开始稀释，2倍倍比稀释后，将12株毒株分别稀释至100ccid
50
/0.05ml，加入病毒液50μl/孔，于36
±
1℃、5%co2培养箱，中和2小时后，加入rd细胞悬液（1
‑2×
105个/ml），100μl/孔，置于5%co2培养7天判定结果，中和效价＜8判为阴性，≥8为阳性，同时计算最大中和抗体效价（max）和最小中和抗体效价（min）的比值（交叉中和检测委托中国食品药品检定研究院进行，用于检测的12株毒株均来自中国食品药品检定研究院并用于测试）。结果显示，ca16免疫血清对各基因型、基因亚型毒株皆具有较好的中和能力（图3和表7），且中和抗体效价gmts(max)（1:1024）/min（1:128）=8，差异较小。以上结果表明，柯萨奇病毒a16型毒株v00080265对现有的柯萨奇病毒a16型的a、b、c三种基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。
[0101]
表7ca16毒株的交叉中和能力检测实施例5ca16毒株三级种子库的建立及检定按照《中国药典》（2020版）中生物制品生产鉴定用菌毒种管理及质量控制，建立三级种子库，即原始种子、主种子批及工作种子批，并进行相关检定。三级种子库检定内容包括无菌检查，鉴别试验、病毒滴定、外源因子检查、支原体检查、免疫原性、基因序列测定等检查项目，各检测项目合格后，才能使用工作种子批。种子库的建立方法如下：将柯萨奇病毒a16型毒株v00080265按moi（0.1~0.0001）接种于处于对数生长期的单层vero细胞，每天观察病变情况，至病变达 ~ ，收获病毒液，建立三级种子库。
[0102]
实施例6ca16疫苗的制备取实施例5建立的柯萨奇病毒a16型毒株v00080265工作种子批，采用细胞工厂或者生物反应器在vero细胞上进行扩大培养，按moi=0.001接种病毒，待病变达 ~ 收获病毒液。将收获的病毒液经离心或过滤后，采用甲醛1:4000灭活4天，或者β
‑
丙内酯1:2000于5
±
3℃灭活1天，37℃水解1小时。将灭活液进行超滤浓缩、层析纯化，纯化液经除菌过滤后获得疫苗原液。灭活也可在病毒纯化后进行。
[0103]
将上述原液与氢氧化铝或磷酸铝佐剂按适宜比例吸附后，制备成ca16疫苗。疫苗蛋白浓度为2μg/ml，铝浓度1.0μg/ml。
[0104]
实施例7ca16疫苗的免疫原性将实施例6中配制的ca16疫苗进行小鼠免疫试验。其中，小鼠的免疫方法如下：将小鼠随机分成2组，每组小鼠10只按0、14天的免疫程序进行ca16疫苗的腹腔免疫，0.5ml/只，于第28天进行采血，同时免疫病毒维持液作为对照组。采集的血清进行中和抗体检测，
具体方法见实施例2。结果显示，二免后14天，试验组血清效价100%阳转，中和抗体水平gtms 可达1:641，对照组阳转率为0%，gtms＜1：8，表明使用柯萨奇病毒a16型毒株v00080265制备的ca16疫苗具有很好的免疫效果。
[0105]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。