甘露糖的酶法生产的制作方法

甘露糖的酶法生产
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年2月12日提交的申请号为62/804,426的美国申请的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及d
‑
甘露糖生产的生物技术领域。更具体地，本发明提供了能够将糖类(例如，多糖、寡糖、二糖、蔗糖、d
‑
葡萄糖和d
‑
果糖)酶促转化为d
‑
甘露糖的改进的d
‑
甘露糖制备方法。


背景技术：

4.d
‑
甘露糖(以下称为甘露糖)是一种带温和甜味的、天然存在的单糖，存在于许多水果、蔬菜、植物材料甚至人体中。甘露糖拥有多种健康益处和药物应用。例如，甘露糖可用于治疗碳水化合物缺陷型糖蛋白综合征1b型，以及更常见的尿路感染。此外，甘露糖是一种得到验证的益生元，其不会使血糖水平升高，并具有抗炎特性。此外，它已被证明可以提高猪的胴体产量，并且是一种广泛用于护肤产品的辅助保湿剂。因此，甘露糖在制药、化妆品、消费品(饮料、食品、乳制品、糖果等)以及畜牧业中有着诸多应用。然而，由于甘露糖的售价较高，其在日常用品中的使用受到了限制。
5.目前，甘露糖主要通过从植物中提取来生产。常见的方法包括酸水解、热水解、酶水解、微生物发酵水解及这些方法的混合。不太常见的方法包括化学和生物转化。总的来说，这些方法的缺点是条件苛刻、资本支出高、原料成本高、从异构化反应中分离甘露糖的成本高以及产品收率相对较低(15
‑
35％)。
6.需要开发一种用于高产量甘露糖生产的成本效益好的合成途径，其中该方法的至少一个步骤涉及能量上有利的化学反应。此外，需要一种生产方法，其中的方法步骤可以在一个罐或生物反应器中进行。还需要一种可以在相对低浓度的磷酸盐中进行的甘露糖生产方法，其中磷酸盐可以被循环利用，和/或该方法无需使用三磷酸腺苷(atp)作为磷酸盐的来源。还需要一种甘露糖生产途径，该途径无需在任何反应步骤中使用昂贵的烟酰胺腺苷二核苷酸(nad(h))辅酶。
7.公开号为wo 2018/169957的国际专利申请描述了d
‑
甘露糖的酶促合成，该方法包括由甘露糖6
‑
磷酸磷酸酶催化，将甘露糖6
‑
磷酸(m6p)催化转化为甘露糖。然而，尽管在甘露糖酶法生产方面有所改进，仍然希望和需要提供进一步改进的甘露糖生产方法，例如，以少量的酶提供更高的产量。降低甘露糖生产的成本具有很强的工业和商业利益，这种成本的降低涉及使用减少量的酶和使用更有效的酶组合。


技术实现要素：

8.一方面，本发明提供了一种改进的d
‑
甘露糖制备方法，其能够将糖类(例如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、d
‑
葡萄糖和d
‑
果糖)酶促转化为d
‑
甘露糖。本发明用于由糖类生产甘露糖
的改进方法包括由甘露糖
‑6‑
磷酸磷酸酶(m6pp)催化，将甘露糖
‑6‑
磷酸(m6p)转化为甘露糖的步骤，其中m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。
9.在本发明的一些方法中，甘露糖是在具有将果糖6
‑
磷酸(f6p)转化为甘露糖6
‑
磷酸(m6p)步骤的方法中制备，其中该步骤由甘露糖6
‑
磷酸异构酶(m6pi)进行催化。在一些方面，该方法包括将葡萄糖6
‑
磷酸(g6p)转化为f6p，其中该步骤由磷酸葡萄糖异构酶(pgi)进行催化。在进一步方面，g6p被转化为f6p，然后通过一种酶转化为m6p，该酶为双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(pgpmi)。在其他方面，甘露糖合成方法还包括将葡萄糖1
‑
磷酸(g1p)转化为g6p的步骤，并且该转化步骤由磷酸葡萄糖变位酶(pgm)进行催化。
10.在任何方法中使用的糖类可以选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。淀粉或其衍生物可以是直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽糖或葡萄糖。在本发明的一些改进方法中，制备甘露糖的方法包括通过淀粉的酶水解或酸水解将淀粉转化为淀粉衍生物。在其他方法中，淀粉衍生物是通过异淀粉酶、支链淀粉酶、α
‑
淀粉酶或这些酶中的两种或多种的组合催化淀粉的酶水解而制备。本发明的一些方法还可以包括添加4
‑
葡聚糖转移酶(4gt)。
11.本发明的其他甘露糖制备方法还包括通过至少一种酶的催化将果糖转化为f6p的步骤。本发明的其他方法包括通过至少一种酶的催化将蔗糖转化为果糖的步骤。用于制备甘露糖的方法中所使用的g6p，也可以通过至少一种酶的催化将葡萄糖转化为g6p来产生。葡萄糖又可以通过至少一种酶的催化将蔗糖转化为葡萄糖来产生。
12.本发明的方法在约37℃至约85℃之间的温度、在约5.0至约9.0之间的ph值下进行，和/或反应时间持续约1小时至约48小时或者作为连续反应进行。在一些实施方案中，制备甘露糖的方法步骤在一个生物反应器中进行。在其他方面，这些步骤在多个串联布置的生物反应器中进行。
13.在本发明的一些方法中，制备甘露糖的步骤在不含三磷酸腺苷、不含烟酰胺腺苷二核苷酸(nad(h))、约0.1mm至约150mm的磷酸盐浓度下进行，磷酸盐被循环，和/或将m6p转化为甘露糖的步骤涉及能量上有利的化学反应。
附图说明
14.图1是用以说明将淀粉或其衍生产物转化为甘露糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：αgp，α
‑
葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；pgm，磷酸葡萄糖变位酶；pgi，磷酸葡萄糖异构酶；pgpmi，双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶；m6pi；甘露糖6
‑
磷酸异构酶，m6pp，甘露糖6
‑
磷酸磷酸酶；ia，异淀粉酶；pa，支链淀粉酶；mp，麦芽糖磷酸化酶；ppgk，多磷酸葡萄糖激酶；以及pi，磷酸盐。在根据本发明的方法中，m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。
15.图2示出了将纤维素或其衍生产物转化为甘露糖的酶促途径。使用以下缩写：cdp，纤维糊精磷酸化酶；cbp，纤维二糖磷酸化酶；ppgk，多磷酸葡萄糖激酶；pgm，磷酸葡萄糖变位酶；pgi，磷酸葡萄糖异构酶；pgpmi，双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶；m6pi，甘露糖6
‑
磷酸异构酶；m6pp，甘露糖6
‑
磷酸磷酸酶；以及pi，磷酸盐。在根据本发明的方法中，m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。
16.图3是用以说明将果糖转化为甘露糖的酶促途径的示意图。ppfk，多磷酸果糖激
酶；m6pi，甘露糖6
‑
磷酸异构酶；m6pp，甘露糖6
‑
磷酸磷酸酶；以及pi，磷酸盐。在根据本发明的方法中，m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。
17.图4是用以说明将葡萄糖转化为甘露糖的酶促途径的示意图。ppgk，多磷酸葡萄糖激酶；pgi，磷酸葡萄糖异构酶；pgpmi，双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶；m6pi，甘露糖6
‑
磷酸异构酶；m6pp，甘露糖6
‑
磷酸磷酸酶；以及pi，磷酸盐。在根据本发明的方法中，m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。
18.图5示出了将蔗糖或其衍生产物转化为甘露糖的酶促途径。sp，蔗糖磷酸化酶；ppfk，多磷酸果糖激酶；pgm，磷酸葡萄糖变位酶；pgi，磷酸葡萄糖异构酶；pgpmi，双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶；m6pi，甘露糖6
‑
磷酸异构酶；m6pp，甘露糖6
‑
磷酸磷酸酶；以及pi，磷酸盐。在根据本发明的方法中，m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。
19.图6示出了基于葡萄糖1
‑
磷酸转化为甘露糖的生成吉布斯能，中间体之间的反应吉布斯能。
20.图7示出了如实施例1所述的通过hplc色谱测量的g1p向甘露糖的转化。1＝空穴峰(void peak)；2＝磷酸化糖(g1p g6p f6p)；3＝无机磷酸盐；4＝甘露糖。
具体实施方式
21.本发明总体上涉及使用无细胞酶混合物将糖类如淀粉、纤维素、蔗糖、葡萄糖和果糖及它们的衍生产物转化为甘露糖的方法。与基于细胞的制造方法相比，本发明涉及甘露糖的无细胞制备，细胞膜通常减缓了底物/产物进出细胞的运输，本发明由于消去细胞膜而具有相对较高的反应速率。本发明的最终产品不含营养丰富的发酵培养基/细胞代谢物。
22.本发明涉及制备甘露糖的改进方法，包括由一种m6pp催化将m6p转化为甘露糖的步骤，与先前在生产甘露糖的方法中使用的m6pp酶类相比具有改进的活性。参见例如wo 2018/169957国际专利申请公开文件，其公开了来自tepidimonas fonticaldi的m6pp(其蛋白质数据库编号uniprot id为a0a1a6dsi3)、来自水热单胞菌(thermomonas hydrothermalis)的m6pp(uniprot id a0a1m4un08)和来自sulfurivirga caldicuralii的m6pp(uniprot id a0a1n6fcw3)。使用活性较高的酶可以减少酶的用量，从而降低整个过程的成本。
23.在本发明的改进方法中的m6pp酶类，与先前公开的来自sulfurivirga caldicuralii的m6pp(其蛋白质数据库编号uniprot id为a0a1n6fcw3)相比具有更高的活性。优选地，本发明方法中使用的m6pp酶类的酶活性相对于来自sulfurivirga caldicuralii的m6pp(uniprot id a0a1n6fcw3)提高了至少10％、至少30％、至少80％、至少100％、至少150％、至少300％或至少400％。例如，如实施例1所示，来自thermobifida cellulosilytica tb100的m6pp(uniprot id a0a147kii8)的酶活性相对于来自sulfurivirga caldicuralii的m6pp(uniprot id a0a1n6fcw3)提高了大约215％。以下实施例为本领域技术人员提供了测定多种m6pp酶类活性的方案，包括将酶与其底物一起孵育，然后通过hplc测量反应物和产物的量。任何两种酶的相对活性的测量均在相同的反应条件如缓冲液、ph值、温度等下进行。
24.在本发明的方法中使用的m6pp酶类对m6p是特异的。对于m6pp而言，特异意味着对
m6p具有相比于该过程中其他磷酸化单糖更高的去磷酸化活性。例如，m6pp对m6p的去磷酸化活性高于对如g1p、g6p和f6p的去磷酸化活性。
25.本发明方法中使用的多个m6pp的实例包括来自thermobifida cellulosilytica tb100(uniprot id a0a147kii8)的m6pp，其氨基酸序列如seq id no:1所示，以及具有与seq id no:1至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的m6pp酶类。seq id no:1氨基酸序列如下：
26.misdsdpqipqavlfdmdgtlidtepmwmdteaevaaafgytwtaedqqrclggsaaavadliaersgtrtpqseivamlyaaverrmaegvpvrpgakellteleaqgvpmalvtstyrslltvalraigehyfavsvagdevtrnkphpepylraarllgvdprrcvavedsptgvasaqaagctvvavphmasvpaaerryvvgsleevdlawlrrvspa。
27.根据本发明的由糖类改进生产甘露糖的方法包括使用甘露糖
‑6‑
磷酸磷酸酶(m6pp)将m6p转化为甘露糖的步骤，其中该m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的方法中，m6pp具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
28.优选地，将m6p转化为甘露糖的m6pp包含用于催化的罗斯曼折叠(rossmanoid fold)结构域、c1封端结构域、rossmanoid折叠的第1β链中的dxd标记、rossmonoid折叠的第2β链末端的苏氨酸(thr)或丝氨酸(ser)、rossmonoid折叠的第3β链α
‑
螺旋c
‑
末端的n
‑
末端的赖氨酸(lys)以及rossmonoid折叠的第4β链末端的gdxxxd(seq id no:2)标记。
29.在一个实施方案中，根据本发明由糖类制备甘露糖的方法还包括通过甘露糖6
‑
磷酸异构酶m6pi的催化将f6p酶促转化为m6p的步骤。可以使用的示例性m6pi包括来自嗜热假诺卡氏菌(pseudonocardia thermophila)的m6pi(uniprot ida0a1m6tly7)、来自caldithrix abyssi的m6pi(uniprot id h1xqs6)、来自嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)的m6pi(uniprot id g2q982)和来自treponema caldarium的m6pi(uniprot id f8f1z8)。参见例如wo 2018/169957国际专利申请公开文件。
30.根据本发明的一些由糖类制备甘露糖的方法还包括将葡萄糖6
‑
磷酸(g6p)酶促转化为f6p的步骤，其中该步骤由磷酸葡萄糖异构酶(pgi)催化。可以使用的示例性pgi包括wo 2017/059278国际专利申请公开文件中公开的那些：来自热纤梭菌(clostridium thermocellum)的pgi(uniprot id a3dbx9)和来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)的pgi(uniprot id q5sll6)。
31.在其他实施方案中，制备甘露糖的方法另外包括将葡萄糖1
‑
磷酸(g1p)转化为g6p的步骤，其中该步骤由磷酸葡萄糖变位酶(pgm)催化，例如wo 2017/059278国际专利申请公开文件中公开的来自thermococcus kodakaraensis的pgm(uniprot id q68bj6)。
32.在进一步的实施方案中，制备甘露糖的方法包括将g6p转化为f6p再转化为m6p，其中该步骤由双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(pgpmi)催化。pgpmi的实例包括但不限于来自syntrophysmus lipocalidus的pgpmi(uniprot id d7cph7)、来自嗜热链球菌(schleiferia thermophila)的pgpmi(uniprot id a0a085l170)和来自thermodesulfobium narugense的pgpmi(uniprot id m1e6z3)。
33.另外，根据本发明的方法还可包括将糖类转化为g1p的步骤，其中该步骤由至少一种酶催化，糖类选自由淀粉或其衍生物(图1)、纤维素或其衍生物(图2)、果糖(图3)、葡萄糖(图4)和蔗糖(图5)组成的组。在根据本发明方法将糖类转化为g1p的步骤中使用的一种或
多种酶可以是α
‑
葡聚糖磷酸化酶(αgp)、麦芽糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和/或纤维素磷酸化酶，以及它们的混合物。酶或酶组合的选择取决于该方法中使用的糖。
34.纤维素是最丰富的生物资源，且是植物细胞壁的主要成分。非食物的木质纤维素生物质包含纤维素、半纤维素和木质素以及其他次要成分。纯纤维素，包括avicel(微晶纤维素)、再生无定形纤维素、细菌纤维素、滤纸等等，可以通过一系列处理来制备。部分水解的纤维素底物包括聚合度大于7的非水溶性纤维糊精、聚合度为3
‑
6的水溶性纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖和果糖。
35.在根据本发明的某些方法中，纤维素及其衍生产物可以通过一系列步骤转化为甘露糖。参见图2。该方法提供了一种体外合成途径，包括以下步骤：通过纤维糊精磷酸化酶(cdp)和纤维二糖磷酸化酶(cbp)分别催化由纤维糊精和纤维二糖与游离磷酸盐生成g1p；通过pgm催化将g1p转化为g6p；通过pgi催化将g6p转化为f6p；通过m6pi催化将f6p转化为m6p；以及通过m6pp催化将m6p转化为甘露糖。或者，在先前的途径中，可以通过pgpmi催化g6p到f6p到m6p的转化。在该方法中，磷酸根离子可以通过将纤维糊精和纤维二糖转化为g1p的步骤来循环。在一些实施方案中，可以将多磷酸盐和多磷酸葡萄糖激酶(ppgk)加入到该过程中，从而通过将降解产物葡萄糖磷酸化为g6p来提高甘露糖的产率。
36.几种酶可用于将固体纤维素水解成水溶性纤维糊精和纤维二糖。这类酶包括内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，但不包括β
‑
葡糖苷酶(纤维二糖酶)。在纤维素水解和产生g1p之前，可以对纤维素和生物质进行预处理以增加它们的反应性并降低纤维素链的聚合度。纤维素和生物质的预处理方法包括稀酸预处理、基于纤维素溶剂的木质纤维素分馏、氨纤维膨胀、氨水浸泡、离子液体处理以及使用浓酸部分水解，浓酸包括盐酸、硫酸、磷酸及它们的组合。
37.当糖类包括纤维二糖，且酶包含纤维二糖磷酸化酶时，g1p通过纤维二糖磷酸化酶由纤维二糖产生。当糖类含有纤维糊精，且酶包含纤维糊精磷酸化酶时，g1p通过纤维糊精磷酸化酶由纤维糊精产生。当糖类包含纤维素，且酶包含纤维素磷酸化酶时，g1p通过纤维素磷酸化酶由纤维素产生。
38.当糖类包括麦芽糖，且酶包含麦芽糖磷酸化酶时，g1p通过麦芽糖磷酸化酶由麦芽糖产生。如果糖类包括蔗糖，且酶包含蔗糖磷酸化酶，则g1p通过蔗糖磷酸化酶由蔗糖产生。
39.当糖类是淀粉或淀粉衍生物时，衍生物可以选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽糖和葡萄糖及它们的混合物组成的组。在本发明的某些方法中，用于将糖类转化为g1p的酶包括αgp。在该步骤中，当糖类含有淀粉时，通过αgp由淀粉产生g1p；当糖类包含可溶性淀粉、淀粉糊精或麦芽糊精时，g1p通过αgp由可溶性淀粉、淀粉糊精或麦芽糊精产生。αgp的一个实例是来自海栖热袍菌(thermotoga maritima)的αgp(uniprot id g4feh8)，其在wo 2017/059278国际专利申请公开文件中公开。
40.根据本发明的一些方法还可包括将淀粉转化为淀粉衍生物的步骤，其中淀粉衍生物通过淀粉的酶水解或通过淀粉的酸水解来制备。在本发明的某些方法中，麦芽糖磷酸化酶(mp)可用于通过将降解产物麦芽糖磷酸化切割成g1p和葡萄糖来提高甘露糖产率。或者，4
‑
葡聚糖转移酶(4gt)可用于通过将降解产物葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖再循环为更长的麦芽低聚糖来提高甘露糖产率；麦芽低聚糖可以被αgp磷酸化切割以产生g1p。4gt的一个实
例是来自嗜热高温球菌(thermococcus litoralis)的4gt(uniprot id o32462)，其在wo 2017/059278国际专利申请公开文件中公开。在本发明的一些方法中，可以将多磷酸盐和多磷酸葡萄糖激酶(ppgk)加入到该过程中，从而通过将降解产物葡萄糖磷酸化为g6p来提高甘露糖的产率。
41.淀粉是自然界中使用最为广泛的储能化合物，主要储存在植物种子中。天然淀粉含有线性直链淀粉和分支支链淀粉。淀粉衍生物的实例包括直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽糖、果糖和葡萄糖。纤维素衍生物的实例包括预处理的生物质、再生无定形纤维素、纤维糊精、纤维二糖、果糖和葡萄糖。蔗糖衍生物包括果糖和葡萄糖。
42.当该方法使用淀粉衍生物时，淀粉衍生物可以通过异淀粉酶、支链淀粉酶、α
‑
淀粉酶或它们的组合催化淀粉的酶水解来制备。玉米淀粉含有许多阻碍αgp作用的分支。异淀粉酶可用于淀粉去支化，产生线性淀粉糊精。异淀粉酶预处理的淀粉可产生更高的f6p浓度。异淀粉酶和支链淀粉酶切割α
‑
1,6
‑
糖苷键，从而使α
‑
葡聚糖磷酸化酶能够更完全地降解淀粉。α
‑
淀粉酶切割α
‑
1,4
‑
糖苷键，因此α
‑
淀粉酶用于将淀粉降解成片段以便更快地转化为甘露糖。
43.甘露糖也可以由果糖产生。参见图3。根据本发明的方法还可包括将果糖转化为f6p的步骤，其中该步骤由至少一种酶催化，以及任选地，还包括将蔗糖转化为果糖的步骤，其中该步骤由至少一种酶催化。例如，该方法涉及通过多磷酸果糖激酶(ppfk)催化由果糖和多磷酸盐生成f6p。f6p向甘露糖的转化如上所述。果糖可以通过例如蔗糖的酶转化来产生。m6p转化为甘露糖时产生的磷酸根离子可以在蔗糖转化为g1p的步骤中被循环使用。
44.甘露糖也可以由葡萄糖产生。参见图4。该过程涉及以下步骤：通过多磷酸葡萄糖激酶(ppgk)催化由葡萄糖和多磷酸盐生成g6p；通过pgi催化将g6p转化为f6p；通过m6pi催化将f6p转化为m6p；以及通过m6pp催化将m6p转化为甘露糖。或者，由g6p到f6p到m6p的转化可以由pgpmi催化进行。葡萄糖可以通过例如蔗糖的酶转化来产生。参见图5。
45.当m6p转化为甘露糖时产生的磷酸根离子然后可以在由蔗糖转化为g1p的步骤中被循环，特别是如果该过程在单个反应容器中进行。参见图5。此外，ppfk和多磷酸盐可用于通过由sp磷酸化切割蔗糖产生的果糖产生f6p来提高甘露糖产率。
46.例如，由糖类制备甘露糖的方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种酶将糖类转化为葡萄糖1
‑
磷酸(g1p)；(ii)使用磷酸葡萄糖变位酶(pgm，ec 5.4.2.2)将g1p转化为g6p；(iii)使用磷酸葡萄糖异构酶(pgi，ec 5.3.1.9)将g6p转化为f6p；(iv)通过甘露糖6
‑
磷酸异构酶(m6pi，ec 5.3.1.8)将f6p转化为m6p；(v)通过双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(pgpmi，ec 5.3.1.8和5.3.1.9)将g6p转化为m6p；以及(vi)通过m6pp将m6p转化为甘露糖。其中糖类为淀粉的方法实例如图1所示。在这类方法中，例如，步骤(i)中的酶可以是αgp。
47.通常，该方法中使用的酶单位的比例为1:1:1:1:1(αgp：pgm：pgi：m6pi：m6pp)。酶单位是在1分钟内将1umol底物转化为产物所需的酶量。因此，与催化相同反应的具有较低活性的酶相比，具有较高活性的酶将具有较低的酶量，酶量以每一酶单位的酶毫克数表示。为了优化产物产率，这些比例可以以任意数量的组合进行调整。例如，相对于其他酶的量，特定的酶可以以大约2倍、3倍、4倍、5倍等的量存在。
48.根据本发明的制备甘露糖的方法可以包括以下步骤：通过酶水解或酸水解由多糖和寡糖产生葡萄糖，通过至少一种酶催化将葡萄糖转化为g6p，通过酶水解或酸水解由多糖和寡糖产生果糖，以及通过至少一种酶催化将果糖转化为f6p。上面列举了多糖和寡糖的实例。
49.根据本发明制备甘露糖的方法可以在单个生物反应器或反应容器中进行。或者，这些步骤也可以在多个串联布置的生物反应器或反应容器中进行。在优选的方法中，甘露糖的酶法生产在单个反应容器中进行。
50.本发明中使用的酶可以采用可溶性、固定化、组装或聚集蛋白的形式。如本领域所知的，这些酶可以吸附在常用于提高功能性的不溶性有机或无机载体上。这些载体包括聚合物载体如琼脂糖、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯或葡聚糖，以及无机载体如玻璃、金属或碳基材料。这些材料通常生产为具有较大的表面积
‑
体积比和促进固定化酶附着与提高活性的特殊表面。酶可以通过共价、离子或疏水相互作用附着在这些固体载体上。这些酶也可以通过基因工程相互作用来固定，例如共价融合到另一种对固体载体具有亲和力的蛋白质或肽序列上，最常见的是多组氨酸序列。酶可以直接附着在表面或表面涂层上，也可以附着在表面或表面涂层上已存在的其他蛋白质上。酶可以全部固定在一个载体上、单独的载体上或两者的组合上(例如，每个载体两种酶，然后混合这些载体)。这些变型可以均匀混合或在限定的层中混合，以优化连续反应器中的周转。例如，反应器的开始可以有一层αgp，以确保高的初始g1p浓度。酶可以全部固定在一个载体上、单独载体上或成组地固定。这些酶可以均匀混合或在限定的层或区域中混合，以优化周转。
51.本领域已知的任何合适的生物缓冲液可用于本发明的方法，例如hepes、pbs、bis
‑
tris、mops、dipso、trizma等。所有实施方案的反应缓冲液可具有介于5.0
‑
9.0的ph范围。更优选地，反应缓冲液的ph值可以在约6.0至约7.3的范围内。例如，反应缓冲液的ph值可以是6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3。
52.反应缓冲液还可以含有二价金属阳离子。金属离子的实例包括mg
2
和zn
2
。二价金属离子的浓度可以介于约0mm至约150mm、约0mm至约100mm、约1mm至约50mm，优选地，介于约5mm至约50mm，或更优选地，介于约10mm至约50mm的范围内。例如，反应金属阳离子浓度可以为约0.1mm、约0.5mm、约1mm、约1.5mm、约2mm、约2.5mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm或约55mm。
53.方法步骤可以在37
‑
85℃的范围内的反应温度下进行。更优选地，这些步骤可以在约37℃至约85℃的温度范围内进行。温度可以是例如约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃。优选地，反应温度为约50℃。在本发明的一些方法中，反应温度是恒定的，并且在方法过程中不发生变化。
54.所公开方法的反应时间可以根据需要可以在约1小时至约48小时的范围内进行调整。例如，反应时间可以为约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时、约42小时、约44小时、约46小时或约48小时。更优选地，反应时间为约24小时。
55.该反应可以使用填充床反应器或类似装置以分批或以连续工艺进行。在连续工艺中，例如，将麦芽糊精溶液泵送通过固定化酶床的速率，使得当溶液离开柱子进行下游处理时将完全转化为甘露糖。例如，可以将200g/l的麦芽糊精泵入装有固定化酶(保持在例如50
℃)的柱中，这样当麦芽糊精离开柱子时，可以实现最大的甘露糖产率。这种方法提供了比批量方法更高的体积生产率。这限制了甘露糖产物与柱子接触的时间和反应条件，从而降低了产物降解的机会(例如，潜在的羟甲基糠醛的形成)。
56.通过m6pp对m6p的去磷酸化产生的磷酸根离子(pi)然后可以在将糖类转化为g1p的方法步骤中被再循环，特别是当所有方法步骤都在单个生物反应器或反应容器中进行时。在所公开的方法中使磷酸盐循环的能力使得能够使用非化学计量用量的磷酸盐，这将使反应磷酸盐浓度保持在低水平。这会影响整体途径和该过程的整体速率，但不会限制单个酶的活性，并保证甘露糖在制造过程的整体效率。
57.例如，反应磷酸盐浓度可以介于约0mm至约300mm、约0mm至约150mm、约1mm至约50mm，优选地，介于约5mm至约50mm，或更优选地，介于约10mm至约50mm的范围内。例如，反应磷酸盐浓度可以为约0.1mm、约0.5mm、约1mm、约1.5mm、约2mm、约2.5mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm或约55mm。
58.因此，由于磷酸盐浓度低，因总磷酸盐用量少，使得生产成本降低，并降低了去除磷酸盐的成本。它还可以防止高浓度游离磷酸盐对m6pp的抑制，并降低磷酸盐污染的可能性。
59.此外，本文公开的方法可以在不添加作为磷酸盐来源的atp，即不含atp的情况下进行。该方法也可以在不需要添加nad(h)，即不含nad(h)的情况下进行。其他优点还包括，所公开的制造甘露糖方法的至少一个步骤涉及能量上有利的化学反应。如图6所示。虽然使用具有较高活性的酶不会影响整体能量学，但在改进的方法中使用较少酶的能力是有利的。其优点是降低了在产品总生产成本中酶的总成本。
60.由于具有对整个反应非常有利的平衡常数，根据本发明的方法可以实现高产率。参见图6。理论上，如果起始原料完全转化为中间体，产率可达到99％。此外，根据本发明将m6p转化为甘露糖的步骤是不可逆的磷酸酶反应，与原料无关。因此，甘露糖的产率非常高。
61.本发明的方法采用低成本起始原料，并通过降低与原料和产品分离相关的成本来降低生产成本。淀粉、纤维素、蔗糖及它们的衍生物是比较便宜的原料，例如相比于乳糖。当由乳糖生产甘露糖时，葡萄糖和半乳糖以及甘露糖需通过色谱法分离，这导致较高的生产成本。
62.根据本发明的方法，允许容易地回收甘露糖，并且使分离成本最小化。优选地，在本发明的方法中，甘露糖的回收不通过色谱分离。在连续反应中生产甘露糖后，产物通过微滤、离子交换(先阳离子交换，然后是阴离子交换，不使用混合离子交换)、浓缩、结晶、晶体分离和干燥。由于甘露糖的高产率，结晶步骤是纯化甘露糖所需的全部步骤。为了在结晶前进一步纯化甘露糖，可以采用纳滤来消除结晶过程中酶存在的风险，并去除任何可能与甘露糖共结晶或限制母液可回收性的未转化糊精(麦芽糊精、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖等)。
63.如以下实施例所示，根据本发明制备甘露糖的方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种酶将糖类转化为g1p；(ii)使用pgm将g1p转换为g6p；(iii)使用pgi将g6p转换为f6p；(iv)使用m6pi将f6p转化为m6p；以及(v)使用m6pp将m6p转化为甘露糖，其中m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。该方法优选在单个生物反应器或反应
容器中进行。
64.在本发明生产甘露糖的一些方法中，步骤(i)使用m6pi将f6p转化为m6p，(ii)使用m6pp将m6p转化为甘露糖，其中m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列，步骤(i)和(ii)在单个生物反应器或反应容器中进行。优选地，根据本发明制备甘露糖的改进方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种酶将糖类转化为g1p；(ii)使用pgm将g1p转换为g6p；(iii)使用pgi将g6p转换为f6p；(iv)使用m6pi将f6p转化为m6p；以及(v)使用m6pp将m6p转化为甘露糖，其中m6pp包含具有与seq id no:1至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中方法步骤(i)
‑
(v)在单个生物反应器或反应容器中进行。该方法可以结合上述各种工艺条件中的一种或多种。
65.实施例
66.原料与方法
67.所有化学品，包括葡萄糖1
‑
磷酸、氯化镁、磷酸钠(一元和二元)，均为试剂级或更高级别，购自西格玛奥德里奇公司(sigma
‑
aldrich，美国密苏里州圣路易斯)或飞世尔科技公司(fisher scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡)，除非另有说明。大肠杆菌bl21(de3)(sigma
‑
aldrich，美国密苏里州圣路易斯)被用作重组蛋白表达的宿主细胞。含50mg l
‑1卡那霉素的zym
‑
5052培养基用于大肠杆菌细胞生长和重组蛋白表达。
68.重组酶的生产和纯化
69.将携带蛋白质表达质粒(pet28a)的大肠杆菌bl21(de3)菌株用100ml含有50mg l
‑1卡那霉素的zym
‑
5052培养基在1l锥形瓶中进行培养。细胞在37℃、220rpm旋转振荡下生长16
‑
24小时。通过在12℃下离心收集细胞，用含有50mm nacl和5mm mgcl2的20mm hepes(ph 7.5)(热沉淀)或者含有300mm nacl和5mm咪唑的20mm hepes(ph 7.5)(镍纯化)洗涤一次。将细胞团在相同的缓冲液中重悬并通过超声裂解。离心后，将上清液中的目标蛋白进行纯化。his标记蛋白通过profinity imac ni交换树脂(美国加州赫拉克勒斯伯乐公司，bio
‑
rad)进行纯化。在50
‑
80℃下热沉淀5
‑
30分钟用于纯化热稳定酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)检测重组蛋白的纯度。
70.实施例1：wo 2018/169957 a1的m6pp相对活性
71.使用以下酶：pgi(uniprot id q5sll6)、pmi(uniprot id f8f1z8)和m6pp(uniprot id为a0a1a6dsi3、a0a1m4un08和a0a1n6fcw3)将g6p转化为甘露糖的情况，进行比较以确定相对m6pp速率。将含有38.5mm g6p、50mm hepes ph 7.2、5mm mgcl2、0.05g/l pgi、0.06g/l pmi和0.3g/l m6pp的0.20ml反应混合物在50℃下孵育3小时。m6pp是该级联反应中的限速酶。
72.通过用vivaspin 2浓缩器(10,000mwco)过滤酶来终止反应，并使用安捷伦hi
‑
plex氢色谱柱和折光率检测器通过hplc(安捷伦1100系列)进行分析。样品在5mm h2so4中在0.6ml/min、65℃下运行15.5分钟。结果表明uniprot id a0a1n6fcw3是wo 2018/169957 a1中最高效的m6pp(见表1)。
73.表1：先前公开的m6pp酶类的相对活性
74.m6pp uniprot id相对活性(％)a0a1a6dsi345a0a1m4un0849
a0a1n6fcw3100
75.实施例2：具有更高活性的m6pp
76.使用以下酶：pgm(uniprot id a0a150llz1)、pgi(uniprot id q5sll6)、pmi(uniprot id h1xqs6)和m6pp(uniprot id a0a1n6fcw3)将g1p转化为甘露糖，与使用本发明改进方法中有利的酶m6pp(uniprot id a0a147kii8)将g1p转化为甘露糖的情况进行比较。将含有38.5mm g1p、50mm hepes ph 7.2、5mm mgcl2、0.05g/l pgm、0.05g/l pgi、0.05g/l pmi和0.05g/l m6pp的0.20ml反应混合物在50℃下培养0.5小时。m6pp是该级联反应中的限速酶。
77.通过用vivaspin 2浓缩器(10,000mwco)过滤酶来终止反应，并使用安捷伦hi
‑
plex氢色谱柱和折光率检测器通过hplc(安捷伦1100系列)进行分析。样品在5mm h2so4中在0.6ml/min、65℃下运行15.5分钟。结果显示，与先前公开的酶相比，改进方法的酶使甘露糖产量提高了3.2倍(图7和表2)。表3示出了将先前公开的m6pp酶类与m6pp(uniprot id a0a147kii8)进行比较的归一化相对活性。
78.表2：改进的m6pp活性
79.m6pp uniprot id相对活性(％)a0a1n6fcw3100a0a147kii8320
80.表3：m6pp酶类的归一化相对活性
81.m6pp uniprot id相对活性(％)a0a1a6dsi345a0a1m4un0849a0a1n6fcw3100a0a147kii8320