大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的制作方法

本发明涉及植物生产、植物育种和农业的领域。更具体地，它涉及大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5、与大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5有关的核苷酸序列、植物、植物的部分、种子、细胞、农业产物、以及检测和生产方法。发明背景提高作物产量及其特征已成为满足食物需求所必需。由于生物技术的发展及其与农业的结合，已经开发出能够适应不同环境和/或生态条件的新作物。在植物生长过程中，植物会暴露于各种非生物胁迫：干旱、盐度和低温、高温、过度辐射、低营养物可用性、阻碍根发育的土壤压实等(Duque等人,2013;Sayed2003)。它们都能够在某个时候影响植物生长以及植物产量。合理的是，假设这些环境因素中的一些可能发生在田间作物生命周期中。在这种情况下，复杂的回答机制被触发，这将反映在执行的测量中，因为它们是这样的胁迫效应的整合的结果。减轻环境可能对作物产生的负面影响的常用技术之一是基于转基因事件，即在目标作物的基因组中插入感兴趣的基因。但是，商业上合适的转基因事件的产生和选择需要对大量个体转化事件进行广泛的研究、分析和表征。以这种方式，有可能选择具有所需性状的事件，并从而开发出适合商业目的所需的表型和农业特征，而不会对其它作物特征产生负面影响。因此，有可能选择具有所需性状的事件，并从而开发出商业上适用所必需的表型和农业特征，而不影响其它作物特征。该过程需要产生转基因事件，所述事件将在分子上和表型上进行表征，以鉴定和选择与所需表型的获得一致的表达感兴趣的异源基因的事件。事件选择意味着在受控条件下实验室开发以及在田间和/或在温室中的试验的阶段。有必要分析多年中在多个地点和在各种环境条件下对事件的响应，以便能够选择满足所需表型和遗传特征以及商业特征的事件。本发明提供了此类商业上合适的事件，这为大豆中的新有利性状留出空间。有多种基因可用于制定具有商业利益的事件。在它们中，市场上有表达抗除草剂的基因或编码杀虫蛋白的基因等的大豆植物。对其表达感兴趣的基因是编码转录因子HAHB4的基因。HAHB4(向日葵（Helianthusannuus）同源框-4)是一种属于HD-Zip家族的向日葵转录因子。HaHB4基因表达在转录水平上受外部环境因素（诸如水可用性和土壤盐度）以及与之相关的植物激素脱落酸和乙烯调节。专利AR81216B2公开了可由缺水和脱落酸诱导的基因HaHB4，该基因编码向日葵转录因子类型HD-Zip。所述专利公开了基因分离和表征，并将其引入模型植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）中。但是，携带本发明具有商业利益的事件的转基因植物未向公众提供，它们与非生物胁迫相关的有利特性也未在农业条件下共同开发。同样地，在专利AR81216B2中也没有提及表达基因HaHB4的事件的特定选择，以保留感兴趣的主要性状，即耐旱性，而不影响其它农业能力。此外，申请AR090110A1公开了可由缺水和脱落酸诱导的修饰基因HaHB4、特别是HaHB4.2，其编码修饰的向日葵转录因子类型HD-Zip，特别是mod1HaHB4。所述出版物公开了修饰的HaHB4.2表达构建体的产生和表征及其在模型植物拟南芥中的引入。此外，该出版物一般公开了含有HaHB4.2基因的大豆、小麦和玉米转基因事件的产生和选择。发明详述本发明提供了包含事件IND-ØØ41Ø-5的非生物胁迫抗性大豆植物。所述植物在不利环境条件下的生长方面具有优势，从而允许更高的产量。更具体地，本发明涉及设计为IND-ØØ41Ø-5的大豆事件，其具有以登录号PTA-125535保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的代表性种子及其衍生的后代。本发明还包括包含由SEQIDNO:1表示的IND-ØØ41Ø-5的大豆植物。在本发明的事件中和在登记的种子中存在的转基因插入物包含以下基因：可选择的bar标记基因的单拷贝，和赋予非生物胁迫耐受性HaHB4的基因的单拷贝。源自吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）的bar基因编码PAT(草胺膦乙酰基转移酶)蛋白。基因HaHB4源自向日葵植物向日葵物种（sp.Helianthusannuus），并编码具有同源结构域类型的蛋白结构域的蛋白类型HD-ZipI，该蛋白结构域与赋予非生物胁迫耐受性（主要是干旱）的亮氨酸拉链相关。感兴趣的基因的调节可以由具有不同表达水平、敏感性和组织特异性的不同启动子序列指导。本领域技术人员知道，在不改变本发明本质的情况下，可以使用引导或调节感兴趣的基因的表达的任何启动子或核酸终止子。具体地，在本发明中开发的事件包含用于赋予草铵膦除草剂抗性的bar基因的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S的启动子的部分重复2x35SCaMV版本以及终止子vsp。此外，该事件包含基因HaHB4启动子(LPF)和nos终止子的最大长度的变体以调节HaHB4编码区的表达(图1)。本发明的其它方面包含大豆植物的后代、植物的种子和/或可再生部分、包含大豆事件IND-ØØ41Ø-5的种子和后代、以及由其衍生的用于人类或动物消费的食物产品。本发明还包括包含事件IND-ØØ41Ø-5的植物的部分，包括但不限于，包含事件IND-ØØ41Ø-5的花粉、胚珠、花、芽、根、叶、细胞营养核和其它植物细胞。本发明还涉及包含大豆事件IND-ØØ41Ø-5的大豆植物，其对多种非生物胁迫具有耐受性：干旱、盐度、低温和高温、过量辐射、低营养物可用性、土壤压实等和它们的组合。本发明部分地涉及非生物胁迫耐受性植物的培养。它还包括大豆植物转化的新事件，其包含插入大豆基因组内的特定位点的如本文所述的多核苷酸，所述多核苷酸提供特定的遗传和表型特征。在某些实施方案中，所述事件/多核苷酸可以与其它性状“叠加”，所述其它性状包括例如农学性状和除草剂和/或昆虫耐受性。但是，如本文所述，本发明包括具有单个事件的植物。额外的性状可以堆叠在植物基因组内或与事件IND-ØØ41Ø-5相同的基因座中，例如，通过植物杂交、包含事件IND-ØØ41Ø-5的转基因植物的再转化或通过同源重组指导的整合添加新的性状来进行。在一个实施方案中，本发明包括位于染色体9中的大豆染色体位点。在某些实施方案中，定向位点包含异源核酸。大豆染色体位点位于SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的侧翼序列之间。在一个实施方案中，本发明包括一种用于生产大豆转基因植物的方法，所述方法包括在染色体9内的特定位置插入异源核酸。具体地，该方法包括以稳定形式用DNA序列SEQIDNO:43转化细胞或细胞培养物，并再生所述细胞，开始新的完整植物。所述植物细胞的转化可以通过多种技术进行，无论是物理的、病毒的，还是化学的，其中包括：生物弹道、电穿孔、细菌转化或其组合。所有这些技术都是本领域技术人员众所周知的。本发明还提供了一种微生物，其包含具有选自SEQIDNO:4的核苷酸序列的核酸分子。具体地，本发明使用用SEQIDNO：43的DNA分子转化、更精确地用质粒pIND2-HB4转化的根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）（图1）。此外，本发明提供了用于检测本事件在大豆样品中的存在的试验。试验可以是基于插入大豆基因组内的重组构建体的DNA序列，以及基于侧接插入位点的基因组序列。还提供了对试验有用的试剂盒和条件。因此，本发明部分地涉及整个插入片段或其部分和侧翼区域的DNA序列（在转基因大豆品系中）的克隆和分析。这些序列是独特的。可以基于这些插入物和侧翼（和联合）区域产生事件特异性引物。PCR技术证明，通过分析由事件特异性引物的这些集合产生的扩增子，可以鉴定这些事件。因此，这些和其它相关程序可用于以明确的方式鉴定包含本发明事件的大豆品系。本发明还部分地涉及PCR测定。其中包括：定量实时PCR或终点PCR，用于检测IND-ØØ41Ø-5事件、扩增子及其片段。本发明还提供了DNA分子，其包含足够部分的SEQIDNO:4的连续核苷酸序列，以作为DNA探针起作用，所述探针在严格条件下与包含选自SEQIDNO:1的核苷酸序列的DNA分子杂交并且在严格条件下不与不包含选自SEQIDNO:1的核苷酸序列的DNA分子杂交。在一些情况下，所使用的探针可以用发出可检测信号的分子标记。这样的分子的例子是荧光染料。也就是说，在两端呈现荧光染料并且具有与待扩增的DNA片段的一部分互补的序列的寡核苷酸。非限制性实例是FAM、TET、HEX、JOE、CALFluor®、Quasar®和Pulsar®染料。本发明还公开了DNA分子对，其由第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子组成，其中第一和第二DNA分子中各自包含足够部分的SEQIDNO:1的连续核苷酸以作为DNA探针起作用，所述DNA探针如果与源自事件IND-ØØ41Ø-5的DNA一起用于扩增反应中，则产生可诊断样品中大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的DNA扩增子。本发明还描述了一种用于检测样品中从事件IND-ØØ41Ø-5获得的DNA的存在的方法，所述方法包括将样品与用作探针和引物的DNA分子进行匹配，使它们经受相同的严格杂交条件，以及检测DNA探针与使用特异性引物进行的扩增样品中的DNA的杂交，其中所述杂交指示源自大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的DNA在所述样品中的存在。本发明还提供了一种检测得自大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的DNA分子在样品中的存在的方法，其将源自所述样品的DNA制备物与用作引物的寡核苷酸对进行匹配以产生扩增反应，所述反应足以产生包含选自SEQIDNO:1的序列的DNA扩增子，并检测DNA扩增子在反应中的存在，其中所述DNA扩增子在反应中的存在指示源自IND-ØØ41Ø-5的DNA分子在所述样品中的存在。本发明进一步提供了一种DNA检测试剂盒，其包含至少一种DNA分子，所述DNA分子具有足够量的SEQIDNO:1的连续核苷酸以作为引物或特异性DNA探针起作用，以检测源自大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的DNA的存在，其中DNA检测可诊断大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5在样品中的存在。本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO:1的核酸分子的大豆植物、种子、细胞或所述植物的部分。本发明进一步提供了耐受非生物胁迫的大豆植物、种子、细胞或其部分植物。本发明进一步提供了大豆植物、种子、细胞或其部分植物，其基因组当用DNA扩增方法试验时，产生包含选自SEQIDNO:1的DNA分子的扩增子。本发明进一步提供了大豆植物或种子，其中所述大豆植物或种子从大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5产生，或者是具有至少一个源自大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的亲本的杂种或杂合体。本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO:1的重组DNA分子的无生命植物材料。本发明进一步提供了作为大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的结果而产生的商品产品，并且包含选自SEQIDNO:1的核酸分子，其中对源自商品产品的样品中核苷酸序列的检测确定商品产品源自大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5。本发明进一步提供了商品产品，其选自完整的或加工过的种子、油、粉、粉沫、絮片、生物柴油、生物气或其它生物材料等。本发明还提供了一种通过如下生产商品产品的方法：获得包含大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的大豆植物或其部分，和从该大豆植物或其部分生产大豆商品产品。本发明提供了一种通过如下生产耐受非生物胁迫的大豆植物的方法：将具有包含选自SEQIDNO:1的核酸分子的大豆转基因事件IND-ØØ41Ø-5的植物与第二大豆植物杂交，从而产生种子，收集从杂交产生的种子，培育所述种子以产生多株后代植物，和选择耐受非生物胁迫的后代植物。附图说明图1.质粒pIND2-HB4的图谱。a)带有T-DNA的二元载体质粒。从NdeI消化产生的片段表示为蓝色的左右箭头以及其大小。LB，左边界；RB，右边界。探针以黄色粗的左右箭头表示。b)pIND2-HB4质粒的详细T-DNA部分。HindIII消化片段分别显示为黑色箭头，以及它们对应于LB和RB的最小的各自大小。NdeI消化片段以蓝色显示。NdeI内部消化物的预期大小是2703bp长。图2.HB4事件的转化构建体和表达水平。A-用于获得(pIND1:HB4=a)、(pIND2:HB4=b)和(pIND3:HB4=c)转基因事件的三种不同质粒(a、b和c)中调节元件的遗传描述。B-Hahb-4和bar基因相对表达水平。相对值参考水对照处理。图3.受控条件下的水胁迫耐受性。A-在V2、R2和R4发育阶段中缺水一段时间后的代表性植物。B-恢复率，其作为来自在实验中使用的总植物的水恢复一段时间后没有萎蔫症状的植物数目。C-在10小时的时间段内以1小时的间隔测量的失水，其来自每个转基因事件和非转基因对照的脱落叶子。图4.乙烯敏感性和黑暗处理。A-在乙烯利和黑暗处理后在叶子上保持绿色的表型。还显示了在水处理过的叶子中保持绿色的表型，作为阴性对照。B-在五个乙烯利浓度下作为乙烯三重响应的一部分的下胚轴钩。C-来自在A中呈现的叶子的紫外/可见光吸收光谱。每种基因型的光合作用相关的类胡萝卜素（在480nm处达峰）和光合色素叶绿素A和B（分别在665nm和649nm处达峰）。绿线对应于从水处理收集的样品，且红线对应于从乙烯/黑暗处理收集的样品。D-在25µM乙烯利溶液下用下胚轴钩形成对幼苗的定量。图5.跨越4个独立转基因事件的环境指数的产量和产量组分差异。在低(L<2500kg/公顷)、中(M=2500-3500kg/公顷)和高(H>3500kg/公顷)产量环境，转基因事件与非转基因对照之间的种子产量(a)、种子数目(b)和种子大小(c)差异(%)。星号指示平均值在p<0.05下的统计上显著的差异。图6.跨越所选事件(b1)的环境指数的产量和产量组分差异。在低(L<2500kg/公顷)、中(M=2500-3500kg/公顷)和高(H>3500kg/公顷)产量环境，b1转基因事件与非转基因对照之间的种子产量(a)、种子数目(b)和种子大小(c)差异(%)。星号指示平均值在p<0.05下的统计上显著的差异。图7.差异表达的基因的维恩图。A-b1转基因事件和非转基因对照基因型的水胁迫和充分浇水处理之间差异表达的基因的数目。图8.DE基因中GO富集的对比。结果以生物学过程、细胞组分和分子功能进行总结。y-轴指示基因本体论类别；x-轴指示DE基因的数目。图9.用HindIII和NdeI消化的T5IND-ØØ41Ø-5植物DNA的DNA印迹。使印迹与DIG-标记的探针杂交，分别用于a)HaHB4和b)bar检测。与指定探针杂交的IND-ØØ41Ø-5消化物中的DNA条带以白框突出显示。Williams82 200pg质粒DNA和100pg质粒DNA用作阳性对照。DIG-标记的标志物VII阶梯带大小以kb表示在印迹的左侧。图10.事件IND-ØØ41Ø-5的连接序列分析。在序列比对中的垂直线指示T-DNA和大豆染色体之间的连接点。列从左到右：载体名称、JS在载体中的位置、支持JS的读出数、读出名称和部分序列。每个JS中的最后一行第四列指示JS开始的元件。通过使用Velvet汇编程序软件从头组装原始序列数据来确认插入位点和结构（仅考虑T-DNA插入物的最后30个碱基来比对序列；所有Illumina生成的读出是101bp长）。图11.IND-ØØ41Ø-5插入基因座和天然等位基因的示意图。A)IND-ØØ41Ø-5中的插入的图解，显示了在T-DNA中存在的元件和用于分析F2植物中的分离的引物。将标记的引物868和752用于测定左边界连接点的存在。B)天然等位基因的图解，显示了存在于插入区（不含T-DNA）中的元件和用于F2植物中分离的PCR试验的引物。将引物934和935用于测定天然等位基因的存在。Gm：大豆(Glycinemax)，Chr9：染色体9，UTR：非翻译区，CDS：编码序列。图12.IND-ØØ41Ø-5中插入的示意图。该图解显示了来自事件IND-ØØ41Ø-5中插入物的不同元件的4个检测系统。其中三个对应于TaqMan检测系统（HaHB4、bar和RB的侧翼），而一个对应于终点PCR系统（LB的侧翼）。图13.16个评价位点的转基因事件和对照产量。红色圆圈指示转基因事件具有高于对照的产量的位点，且黄色圆圈是所述事件具有低于对照的产量的位点。序列的简述SEQIDNO:1对应于插入物和连续基因组区域的DNA序列。SEQIDNO:2对应于右侧翼序列的DNA序列。SEQIDNO:3对应于左侧翼序列的DNA序列。SEQIDNO:4对应于插入物的DNA序列。SEQIDNO:5对应于引物750的DNA序列。SEQIDNO:6对应于引物751的DNA序列。SEQIDNO:7对应于引物752的DNA序列。SEQIDNO:8对应于引物753的DNA序列。SEQIDNO:9对应于引物754的DNA序列。SEQIDNO:10对应于引物755的DNA序列。SEQIDNO:11对应于引物756的DNA序列。SEQIDNO:12对应于引物757的DNA序列。SEQIDNO:13对应于引物758的DNA序列。SEQIDNO:14对应于引物759的DNA序列。SEQIDNO:15对应于引物760的DNA序列。SEQIDNO:16对应于引物2527的DNA序列。SEQIDNO:17对应于引物203的DNA序列。SEQIDNO:18对应于引物378的DNA序列。SEQIDNO:19对应于引物1970的DNA序列。SEQIDNO:20对应于引物1747的DNA序列。SEQIDNO:21对应于引物1748的DNA序列。SEQIDNO:22对应于引物1745的DNA序列。SEQIDNO:23对应于引物1746的DNA序列。SEQIDNO:24对应于引物822的DNA序列。SEQIDNO:25对应于引物1127的DNA序列。SEQIDNO:26对应于引物817的DNA序列。SEQIDNO:27对应于引物818的DNA序列。SEQIDNO:28对应于探针819的DNA序列。SEQIDNO:29对应于引物868的DNA序列。SEQIDNO:30对应于引物752的DNA序列。SEQIDNO:31对应于引物530的DNA序列。SEQIDNO:32对应于引物531的DNA序列。SEQIDNO:33对应于探针532的DNA序列。SEQIDNO:34对应于引物527的DNA序列。SEQIDNO:35对应于引物528的DNA序列。SEQIDNO:36对应于探针529的DNA序列。SEQIDNO:37对应于引物718的DNA序列。SEQIDNO:38对应于引物719的DNA序列。SEQIDNO:39对应于探针720的DNA序列。SEQIDNO:40对应于引物934的DNA序列。SEQIDNO:41对应于引物935的DNA序列。SEQIDNO:42对应于探针936的DNA序列。SEQIDNO:43对应于pIND2-HB4质粒的DNA序列。具体实施方式提供以下定义和方法以更好地定义本发明并使本领域技术人员能够将本发明付诸实践。除非另有说明，否则应根据相关领域技术人员的常规使用来解释术语。实施例实施例1：质粒pIND2-HB4的构建随后将用于大豆植物转化的质粒pIND2-HB4源自二元质粒家族pPZP，具体地，是基于pPZP200系列。IND-ØØ41Ø-5的转基因插入物和表达盒包含用于bar标记基因的2X花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子35S和vsp终止子。另外，包含用于基因HaHB4的向日葵基因HaHB4启动子(大启动子片段,LPF)和nos终止子。获得的质粒pIND2-HB4如图1所示。实施例2:大豆植物的转化和事件IND-ØØ41Ø-5的选择可以通过多种方法转化大豆细胞。具体地，使用了根癌土壤杆菌菌株EHA101(Hood等人,1986)，将其去保护（disarmed），用在T-DNA区域（转移DNA）内含有HaHB4和bar的二元质粒转化。使用Paz等人,(2004)描述的方法的改进，进行转化。简而言之，将大豆种子(大豆(Glycinemax)cv.Williams82)在黑暗中在基础培养基中预发芽。从用土壤杆菌感染的半成熟种子分离子叶节。在5-7天期间，将外植体与土壤杆菌菌株一起在黑暗中培养。用于芽萌发、伸长和生根的培养基补充有头孢噻肟（cefoxatime）、特美汀和万古霉素以抑制土壤杆菌过度生长。选择使用草铵膦（其抑制不表达PAT的芽的发育）转化的芽。将再生的外植体在白色荧光下以光周期照明16:8在24℃下保持两/三周。在芽诱导期间，将外植体在含有Gamborg基础培养基（大量营养物B51X、微量营养物B51X、维生素B51X、二价铁28mg/L、NaEDTA38mg/L）、蔗糖30g/L、MES0.59g/L和琼脂A型7g/L（pH5.7）的芽诱导选择性培养基（SISM）中传代培养数次。将培养基高压灭菌后，加入过滤并灭菌的BAP(2mg/L)、IBA(0.2mg/L)、特美汀(50mg/L)、头孢噻肟(100mg/L)和万古霉素(50mg/L)以及选择剂。一旦叶子可见，就切下它们的茎并将其转移到芽伸长选择性培养基(SESM)中。将伸长的芽（两个节点）转移到半固体生根培养基（RM：用Gamborg维生素MS½X(大量营养物MS½X、微量营养物MS½X、维生素B5½X、二价铁28mg/L、NaEDTA38mg/L)、蔗糖20g/L、MES0.59g/L和琼脂A型7g/L改进的基础培养基，pH5.6)。将培养基高压灭菌后，加入过滤并灭菌的吲哚-3-丁酸(IBA，2mg/L)和选择剂。将具有正常表型特征的生根植物转移到含有基质混合物的样地中进行幼苗驯化，诱导其生长用于进一步分析。表1.Gamborg基础培养基B5的微量营养物和大量营养物组成植物再生和事件选择I)种子灭菌：将种子在水性去污剂的稀释溶液中洗涤5分钟，并随后用灭菌蒸馏水洗涤6次。然后，用酒精（70%乙醇）洗涤种子1到2分钟，不时搅拌。乙醇溶液沉降后，将种子置于具有带柄的盖的钟罩干燥器中进行氯气消毒。气体消毒后，将种子浸泡在蒸馏水中12小时以软化它们的外皮。II)种子发芽：将种子去皮并在黑暗中置于发芽培养基（GM：含盐和维生素、蔗糖30g/l和琼脂A型7g/L的基础培养基Murashige&Skoog，pH5.8）中约72-96小时的时间段直到径向伸长。预发芽期后，提取根和下子叶茎。从两个子叶机械地部分地取下近轴表皮以增加接种物与外植体细胞的接触，从而提高根癌土壤杆菌感染的效率。III)转化程序a)通过浸润直接与根癌土壤杆菌共培养的外植体.通过真空渗透使预发芽的种子与感染培养基(VIIM:Gamborg基础培养基B51/10X(大量营养物B51/10X,微量营养物B51/10X,维生素B51/10X,二价铁2.8mg/L,NaEDTA3.8mg/L),蔗糖30g/L,MES3.9g/L,pH5.4)接触。在培养基高压灭菌后，向该培养基中加入含有过滤和灭菌的GA3(0.25mg/L)、BAP(2mg/L)、SilwetL-77(0.03%)和40mg/L乙酰丁香酮的细菌悬浮液（直接共培养）。将真空升至450mmHg。将外植体在真空条件下保持5-7分钟。将这个过程重复两次。b)种子解剖及其与转化的根癌土壤杆菌的间接共培养种子浸润程序后，将种子用无菌滤纸干燥并放置在无菌平面（空板）上进行切割。使用锋利的无菌解剖刀分别折断子叶并除去胚芽。c)间接共培养的外植体包括涉及一半种子外植体的脱水/再水合的额外处理以利于细菌感染。在层流净化罩下在解剖的一半种子外植体中诱导膨胀丢失30分钟。然后，将外植体在感染培养基（IM:Gamborg基础培养基B51/10X（大量营养物B51/10X、微量营养物B51/10X、维生素B51/10X、二价铁2.8mg/L、NaEDTA3.8mg/L）、蔗糖30g/L、MES3.9g/L，pH5.4）中再水合。在高压灭菌后，向该培养基中加入在24℃的含有过滤和灭菌的GA3(0.25mg/L)、BAP(2mg/L)和40mg/L乙酰丁香酮)的土壤杆菌悬浮液(DO0.7)30分钟。将外植体用无菌纸干燥并立即转移到共培养培养基(CCM:Gamborg基础培养基B51/10X(大量营养物B51/10X,微量营养物B51/10X,维生素B51/10X,二价铁2.8mg/L,NaEDTA3.8mg/L),蔗糖30g/L,MES3.9g/L和琼脂A型4.25g/L,pH5.4)。高压灭菌以后，向该培养基中加入过滤和灭菌的GA3(0.25mg/L)、BAP(2mg/L)、半胱氨酸(400mg/L)、二硫苏糖醇(154.2mg/L)和40mg/L乙酰丁香酮)在暗处在24℃保持5-7天。d)冲洗将外植体在无菌水中轻轻漂洗10分钟以除去附着在其上的细菌，然后用无菌滤纸干燥。然后，将外植体浸入芽诱导洗涤培养基(SIWM:Gamborg基础培养基B51X(大量营养物B51X,微量营养物B51X,维生素B51X,二价铁28mg/L,NaEDTA38mg/L),蔗糖30g/L,和MES0.59g/L,pH5.7)。将培养基高压灭菌后，加入过滤和灭菌的BAP(1mg/L)、TDZ(0.1mg/L)、IBA(0.2mg/L)、特美汀(100mg/L)、头孢噻肟(100mg/L)和万古霉素(50mg/L)(每瓶25个外植体)。在24℃和连续搅拌(100rpm)下，继续洗涤6-12小时，光周期照明为16:8。e)转化的外植体的选择和再生将外植体转移到芽诱导选择性培养基(SISM)并在24℃在白色荧光下以16:8光周期照明保持两周。将它们以近轴面朝上的方式放置在选择性培养基的表面上。将培养皿(100x25mm)用于选择和再生过程。每两周，将外植体在补充有植物激素和抗生素的新鲜培养基SISM中进行传代培养。当叶子出现时，将茎取下并转移到带有用于芽伸长的选择性培养基(SESM:用维生素MS1X(大量营养物MS1X、微量营养物MS1X、维生素B51X、二价铁28mg/L、NaEDTA38mg/L)、蔗糖30g/L、MES0.59g/L和琼脂A型7g/L改进的Gamborg基础培养基,pH5.7)的平板。将此培养基高压灭菌后，加入天冬酰胺(50mg/L)、L-焦谷氨酸(100mg/L)、IAA(0.1mg/L)、GA3(0.5mg/L)、玉米素-R(1mg/L)、IBA(0.2mg/L)、特美汀(50mg/L)、头孢噻肟(100mg/L)、万古霉素(50mg/L)。f)转基因芽的生根将伸长的芽（两个节点）转移到含有半固体生根培养基(RM)的培养瓶(1株植物/250x25mm烧瓶)。然后，将转基因植物转移到处于生长条件的环境中的样地中，以诱导更大的选择并进行它们的表型和分子表征。选择是基于在正常生长条件下“野生”表型的存在和对环境胁迫的更高耐受性来进行的，通过在种植条件较不有利的农业区更大的产量来表达。事件初步选择在栽培种Williams82中通过土壤杆菌介导的方案产生大豆转基因事件。使用三种不同的表达盒和策略获得T1种子的35个独立事件。第一次繁殖在温室中进行，并将从每个事件衍生出的10个T1个体取样用于通过PCR测定进行的孟德尔分离试验。在此分析之后，抛弃不具有孟德尔分离的品系。将源自来自所选事件的个体自交的品系（T1中的3:1孟德尔分离）播种。在整个生长季节都鉴定具有惩罚的异型表型并丢弃。在营养体阶段期间，对植物取样进行PCR分析以鉴定纯合品系。在温室中进行纯合品系和无效品系的种子增加（T3种子）。为了继续事件选择，在田间条件下评价了15个HB4大豆选择的转基因事件和对照品系。应用了两个水平（低和高）的灌溉制度。对于低灌溉制度，从R1到R6大豆发育阶段暂停供水。因此，该制度仅由两次浇水组成，一次在季节开始时，另一次在季末。在构建内或构建之间以及同一品系内的纯合转基因事件品系比非转基因品系具有更高的产量。因为同一品系内的两个诱导型转基因事件(一个(b)(pIND2:HB4)和一个(c)(pIND3:HB4))，在转基因和非转基因品系之间存在显著的产量差异。此外，两个组成型(a)(pIND1:HB4)转基因事件比其非转基因对应物具有更高的产量。选择这四个事件以继续进行更深入表征，从而允许选择事件。大豆转基因事件和遗传构建体将Williams82大豆基因型用于用根癌土壤杆菌菌株EHA101转化。转化载体由来自pPZP200系列的二元质粒衍生物组成(Hajdukiewicz等人,1994)。存在于质粒中的来自吸水链霉菌的bar基因被用作选择标记(Thompson等人,1987)。为了评价不同表达水平对生长和耐受性应答的影响，使用三种不同的启动子进行Hahb-4表达。使用花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子获得Hahb-4TF的组成型表达，并使用两个不同的Hahb-4启动子区域获得诱导型表达。诱导型启动子之间的区别是COX5c内含子的存在或不存在（图2A）。构建体类似于Cabello等人(2007)中所描述的。使用除草剂(草铵膦)喷雾剂选择第一代(T0)的转基因植物。通过使用PCR检测HaHb-4cDNA和调节序列来选择之后的代（T1和T2）。获得了几个纯合品系，并在初步分析后，选择了四个转基因独立事件(a1、a2、b1和c1)用于进一步评价。初步分析由目视观察和选择具有无形态改变的表型的事件组成。HaHB4和bar基因转录表达分析通过转录表达分析，评价在纯合品系上的HaHB4和bar基因表达水平。将每个转基因事件的幼苗用ABA100µM溶液处理1小时或用作为对照处理的水处理。实验进行了3次，且每个单独实验取样5株幼苗。在处理期后，收获幼苗的总生物量并立即置于液氮中。从样品中，使用TriPure试剂(ROCHE)分离用于定量RT-PCR的RNA。根据制造商的说明书，将RNA(1µg)与RQ1DNA酶(Promega,Madison,WI,USA)一起温育，并然后使用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit(ROCHE)进行逆转录反应。使用LightCycler®480SYBRGreenIMaster试剂盒在20µl终体积中使用LightCylcer®480II设备(ROCHE)进行定量PCR。在40次循环期间在80-84℃测量荧光。用于定量程序的引物设计为在60℃的退火温度下工作，并分析解链曲线以检测非特异性扩增产物。在每种情况下，一式三份进行基因表达分析，并如Pfaffl(2001)所述使用对每个样品获得的Ct值计算转录物的相对表达水平。受控条件下的水胁迫实验该实验由以下组成：五种基因型（转基因事件a1、a2、b1、c1和Williams82），两种水处理（充足浇水和水胁迫），三个胁迫开始阶段：第二节（V2）、完全开花（R2)和完全结荚(R4)(Fehr和Caviness,1977)，以及15次重复。给盆(5-L)装入商业GrowMixMultiPro(TerrafertilSA,AR)。在每个单独的盆中种植三粒种子。出苗时，将植物间苗至每盆一株。通过完全停止浇水，从V2、R2和R4发育阶段开始施加水胁迫。将剩下的对照盆保持田间持水量直至成熟。在Hahb-4植物中首次出现萎蔫症状后，将盆浇水直至田间持水量。在7天恢复期后，将每个基因型和发育阶段的恢复率(%)计算为没有萎蔫症状的植物数量除以实验开始时的植物总数。乙烯敏感性实验在V4发育阶段，将a1和b1转基因事件和对照植物(Williams82)的大豆叶子（每个基因型15片叶子）从在受控条件下生长的植物分离。将分离的叶子置于培养皿中并与以下一起温育：a-水并置于正常光照条件下（对照处理）；b-水并用铝箔覆盖（暗处理），和c-100µM的2-氯乙基膦酸溶液(2-chloroethilphosfonicacid)(Tifón,Gleba,AR)（乙烯利处理）。7天的处理期后，对回收的叶子进行色素提取和定量。对于叶绿素(A和B)和光合作用相关的类胡萝卜素测定，将叶子在液氮中研磨，并在含有99.9%乙醇的溶液中避光静置过夜。将乙醇溶液的等分试样用于进一步的紫外/可见光光谱法定量。对每个等分试样进行系列稀释以避免吸收光谱中的离群值。使用JASCOV-550分光光度计(JascoAnalyticalInstruments,MD,USA)在15℃记录叶绿素A和B以及类胡萝卜素的可见电子吸收光谱。对每个样品进行350nm和750nm波长之间的光谱扫描。整个实验的值是三个独立实验的平均值。为了评价乙烯的“三重响应”形态学效应之一，将a1、b1和对照基因型的大豆种子放置在带有滤纸的发芽托盘中，该滤纸带有水或25µM2-氯乙基膦酸溶液。每种基因型和处理总共使用3个托盘（各20粒种子）。将托盘用铝箔覆盖48小时。在下胚轴出现后，对具有钩形成的种子进行定量。失水实验使每个大豆转基因事件(a1、a2、b1和c1)和非转基因对照(Williams82)的三株植物在正常浇水条件下在具有GrowMixMultiPro土壤的5-L盆中生长。在开花开始时(R1)(Fehr和Caviness,1977)，将每株植物的10片叶子分离并立即在空气隔离的分析天平中以1小时的间隔称重，持续10小时。雨养田间条件下的田间实验在2012-13生长季节期间在12个环境中关于产量和产量组分评价转基因事件a1、a2、b1、c1和野生型(Williams82)。环境被定义为位置和种植日期的组合，因为对于某些位置，播种了两个种植日期。田间试验位置是MonteBuey(Córdoba)、Chilibroste(Córdoba)、CorraldeBustos(Córdoba)、VillaSaboya(BuenosAires)、CarmendeAreco(BuenosAires)、SanAgustín(BuenosAires)、Landeta(SantaFe)、Hughes(SantaFe)和Aranguren(EntreRíos)。在SanAgustín、CarmendeAreco和Aranguren，种植了两个种植日期。根据野生型基因型的产量（环境指数），对环境进行分组。考虑不同的标准，定义了三个环境指数（低、中和高）：1）允许事件选择，使事件和非转基因对照之间的产量差异最大化；2）代表在事件选择年份阿根廷全国产量平均值（低环境指数的上限）和阿根廷两个最具生产力地区的平均产量（高环境指数下限）(BolsadeCereales,PanoramaAgricolaSemanal2013年5月30日.从www.bolsadecereales.com/pas检索)；3)平衡每个组内的环境数量。因此，低环境指数包括其中野生型产量低于2500kg/公顷的环境（SanAgustín，两个种植日期，Aranguren，两个种植日期和Landeta）；中环境指数包括其中野生型产量是在2500-3500kg/公顷之间的环境（CarmendeAreco，两个种植日期和VillaSaboya）；和最后，高环境指数包括其中野生型产量高于3500kg/公顷的环境(CorraldeBustos,Hughes,MonteBuey和Chilibroste)。基于转基因事件和野生型的种子产量和产量组分（每平方米的种子数目和100粒种子重量）的相对表现进行事件选择。将转基因相对于野生型的表现计算为转基因事件与野生型之间的相对差异。田间试验采用随机完整区组设计进行种植，重复4至7次，取决于所考虑的地点。样地由4行组成，长度为5到6米，行之间为0.4到0.7米。每个样地的中间两行在完全成熟时(R8)收获(Fehr和Caviness,1977)。以13%水分基础表示产量。根据100粒种子的重量和产量计算每平方米的种子数。使用SAS软件通过方差分析来分析种子产量、种子数目和种子重量。统计模型包括环境指数、环境指数内嵌套的环境、环境内嵌套的区组、基因型和交互项（按环境指数的基因型和按基因型的环境）。在事件选择之后，在2013-14生长季节期间在六个环境中进行了额外的田间试验。田间试验位置是MonteBuey(Córdoba)、Aranguren(EntreRíos)、Roldán(SantaFe)和VillaSaboya(BuenosAires)。在Aranguren，播种了两个实验，它们在种植时的施肥处理上有所不同：a)100kg/公顷的磷酸二氢铵肥料，和b)0kg/公顷的磷酸二氢铵。在Roldán，种植了两个种植日期（12月和1月）。2013-14年田间试验的实验设计与2012-13年相同。将两年的数据合并，并一起分析所有环境以在b1转基因事件和非转基因对照之间对比。在低环境指数内的田间试验是Aranguren，两种施肥条件。具有中环境指数的田间试验是MonteBuey和Roldán（两个种植日期）。最后，将VillaSaboya分类为中环境指数试验。使用与先前数据集相同的统计模型分析数据。文库构建和Illumina测序如“受控条件下的水胁迫实验”部分所述，从采用两种不同水处理（充分浇水和水胁迫的植物）的三株植物收集Williams82和b1转基因事件的叶组织。在R2阶段收集组织样品。如“Hahb-4和bar基因表达水平”部分所述，使用SV总RNA分离系统(Promega,Madison,WI,USA)从叶组织中提取总RNA。使用Agilent2100BioanalyzerEukaryoteTotalRNANano(Agilent,SantaClara,California,USA)评价RNA质量，并使用Quant-iTRiboGreenRNAAssayKit(ThermoFisherScientific,Waltham,Massachusetts,USA)测定RNA浓度。使用单因素方案设计RNAseq差异表达测定，每个因素水平有两个水平（水胁迫和充分浇水）和三个生物学重复。根据生产商的推荐(Illumina,SanDiego,CA,USA)，使用TruSeqRNALibraryPrepKitv2构建RNA-seq文库。使用Agilent2100BioanalyzerDNA1000芯片(Agilent,SantaClara,California,USA)进行文库质量检查。使用适用于Illumina平台的KAPALibraryQuantificationKit(KAPABiosystems,Wilmington,Massachusetts,USA)对文库进行定量，合并，稀释并加载以用于在IlluminaHiSeq1500RR2x100bp泳道中进一步测序。在InstitutodeAgrobiotecnologíaRosario(Rosario,阿根廷共和国)使用下一代测序设备将所有样品测序。作图、差异表达和基因本体论(GO)富集分析使用FastQCv0.11.4(Andrews,S.2010)进行原始数据质量检查。使用Trimmomaticv0.33执行修剪和连接物移除。使用在TopHatv2.1.0(Trapnell等人,2009)中包含的Bowtie2v2.2.6(Langmead和Salzberg,2012)使用默认参数将配对末端RNA-seq读出映射到大豆参考基因组(phytozomeGmax_275_Wm82.a2.v1)。将Cufflinksv2.2.1(Trapnell等人,2012)用于转录物组装，使用每百万映射读出每千碱基转录物的片段(FPKM)测量丰度估计，并使用cuffdiff进行差异表达分析(FDR=0.05)。将差异表达的基因用基因本体论（GO）术语进行注释。以大豆Wm82.a2.v1基因作为背景，使用agriGO万维网服务器(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO)进行奇异富集分析(SEA)（Fisher氏精确检验；0.05显著性水平）(ZhouD.,等人,2010)。为了概览转录物功能，我们使用GOSlimViewer工具(http://www.agbase.msstate.edu/)将GO术语映射到GOslims植物类别。使用phytozome11.0v存储库获得基因ID。在两个组成型转基因事件（a1和a2）和两个诱导型转基因事件（b）和（c）之间选择事件对属于三种不同构建体的四个独立转基因品系(a1、a2、b1和c1)进行了HaHB4相对表达水平的评价（图2B）。正如预期的那样，与未暴露于植物激素的对照植物相比，当暴露于脱落酸(ABA)时，具有诱导型启动子的转基因事件b1和c1显示出更高水平的HaHB4表达。相反，对于两种处理，具有组成型启动子的转基因事件a1和a2显示出相似的HaHB4表达。如预期的，bar基因的表达水平在两种条件下都保持相似。在表达分析之后，在受控条件下进行耐旱性实验。因此，在四个独立的转基因品系(a1、a2、b1和c1)中评价了三个不同发育阶段的耐旱性。经过一段时间的缺水后，与非转基因植物(Williams82)相比，所有转基因品系都显示出更少的萎蔫植物（图3A）。对每个独立的转基因品系进行了灌溉后缺水一段时间后萎蔫恢复（恢复率）的观察（图3B）。在V2，发育阶段的第二节(Fehr和Caviness,1977)，只有7%的对照植物表现出组织恢复，而转基因事件的平均恢复率为67%。在R2(完全开花)和R4(完全结荚)发育阶段(Fehr和Caviness,1977)也发现了类似的结果，其中对照植物的恢复率分别为12%和13%，而转基因事件分别表现出68%和65%的值。计算跨发育阶段的平均恢复率（最终恢复率）以估计每个转基因事件的平均表现。结果显示转基因事件之间的一些差异，其中a1和b1事件显示出比a2和c1事件更高的最终恢复率值（图3B）。另一方面，在10小时内以1小时的间隔测量从植物分离的大豆叶子的失水率，以测试气孔关闭调节是否有助于转基因品系胁迫耐受性。结果表明，所有独立品系和野生型的失水量是相似的（图3C），表明较早的气孔关闭不是参与HaHB4介导的耐旱性的机制。HaHB4转基因植物的乙烯敏感性和延迟衰老评价较低的乙烯敏感性和随之而来的延迟衰老将是赋予HaHB4拟南芥属转基因植物更高耐旱性的主要机制(Manavella等人,2006;Cabello等人,2007)。为了评价大豆中的这种生理机制，选择了具有不同启动子（a1组成型和b1诱导型）的两个独立的转基因品系进行评价。当两者都暴露于乙烯利(2-氯乙基磷酸)外源施用或黑暗以触发组织衰老时，转基因品系b1保持比非转基因对照(Williams82)更长的光合活性。用乙烯利处理或在黑暗下处理的转基因品系b1的叶子显示出与未受胁迫的叶子相似的叶绿素A和B以及光合作用相关的类胡萝卜素的丰度（图4C）。相反，在用乙烯利或黑暗处理叶子时，非转基因对照基因型显示出与未受胁迫的叶子相比更低的叶绿素A和B以及类胡萝卜素水平。对于具有组成性应答的转基因事件(a1)发现了中间应答。当暴露于乙烯利或黑暗时，在转基因b1叶子中也观察到更长的延迟衰老（图4A）。因此，虽然转基因b1叶子显示出保持绿色的表型，但非转基因品系在这些处理下显示出黄化症状。另一方面，对幼苗施用乙烯会导致顶端钩的明显弯曲。这种被称为“三重应答”的效应会导致茎伸长抑制、茎径向膨胀和正常向地应答的缺失(Guzman和Ecker,1990)。图4B显示了与非转基因品系相比，转基因品系a1和b1对乙烯利的敏感性更低，表明在大豆中乙烯利感应的时机差异。此外，暴露于不同乙烯利浓度的转基因品系的幼苗显示出比非转基因品系在更高浓度的下胚轴钩形成。同时，在25µM乙烯利浓度观察到转基因品系钩形成的最初症状，而10µM的浓度足以在非转基因对照中形成钩。以相同的方式，在25µM乙烯利浓度，转基因品系显示17%(b1品系)和9%(a1品系)的具有钩形成的幼苗，而在非转基因对照中，几乎50%的幼苗在该浓度呈现钩形成（图4D）。因此，与非转基因对照相比，大豆转基因事件对乙烯的敏感性更低，这通过叶绿素水平的维持和在乙烯利和黑暗处理下没有钩形成的较高下胚轴的观察来证明。在雨养田间条件下独立的HaHB4转基因事件表现在2012-2013年生长季节期间在12项试验中，最初在田间条件下评价了四个独立的转基因事件。根据非转基因对照产量，将试验分组为低、中和高产量环境。所有转基因事件显示出低于非转基因对照的100粒种子重量(基因型主效应:p<0.0001)。另一方面，每平方米种子数目和种子产量显示出显著的基因型-环境相互作用（对于种子产量p=0.013，对于种子数目p=0.033）。a2和b1事件的种子产量显著高于低产量环境中的对照（图5A）。与非转基因对照相比，a2的种子产量高9.4%，且b1的种子产量高11.2%。在低产量环境下的这些表现差异是种子数目的显著增加小于种子重量的成比例减少的结果。a2转基因事件显示种子数目的15.3%增加（图5B）和种子重量的-4.8%减少（图5C），而转基因事件b1显示种子数目的20.6%增加（图5B）和种子重量的-7.6%减少(图5C)。对于中和高产量环境，除了c1之外的任何事件的种子产量都没有差异。转基因事件c1显示显著的种子产量减少(-8.4%)(图5A)，这由种子数目(-5.8%)(图5B)和种子重量(-2.6%)(图5C)的显著减少来解释。基于b1事件在低产量环境中的更好表现以及在高产量环境中没有种子产量损失，因此选择b1事件进行进一步的田间试验。在2013-14年生长季节期间在一组扩大的环境中对选定的转基因事件b1的进一步评价显示与前一年相比一致的结果。对两个生长季节的b1事件和非转基因对照的组合分析显示种子产量(p=0.048)和种子数目(p=0.050)的统计上显著的基因型-环境相互作用，而种子重量显示出显著的基因型主效应(p<0.0001)。在低产量环境下，两种基因型之间的种子产量是显著不同的（图6A）。种子数目增加(23.3%)成比例高于种子重量减少(-6.7%)，导致显著的种子产量增加(14.9%)(图6A、B、C)。对于中和高产量环境，在种子重量和种子数目之间存在补偿。种子重量减少（中和高产量环境分别为-6.8%和-4.2%）（图6C）具有与种子数目增加（中和高产量环境分别为7.3%和6.2%）（图6B）相似的幅度。差异表达的基因的分类与鉴定为了评价大豆转基因b1事件中赋予耐旱性的转录水平的变化，使用Illumina技术在b1事件和非转基因对照(Williams82)中进行了RNA-Seq转录组分析。对比灌溉与干旱处理的第一方法鉴定了在HaHB4基因型中的1931个差异表达的(DE)基因(FC>= /-2)。在野生型基因型中发现了相似数量的DE基因，有2215个DE基因(FC>= /-2)响应于水胁迫。866个DE基因在两种基因型之间共享（图7B）。进行了对比处理内基因型的第二方法以鉴定与HaHB4转基因相关的DE基因。正如预期的那样，由于HaHB4启动子的诱导特性，当在灌溉植物中对比转基因和非转基因植物时，仅观察到298个DE基因(FC>= /-2)。在灌溉条件下对比基因型的富集基因本体论(GO)注释鉴定了在生物学过程类别中与DE基因相关的941个GO术语，而在干旱处理下鉴定了DE基因中的9931个GO术语（图7）。此外，水胁迫下最大比例的DE基因对应于代谢和生物学过程，而细胞和生物合成过程也显示出相当数量的基因型之间的DE基因（图8）。在生物学过程主组中，在水胁迫下的DE基因主要参与光合作用、植物防御应答、转录因子和信号转导(表2)。在提到的类别中，根据倍数变化值对DE基因进行了第二次选择。选择FC<=-2（下调）或FC>=2（上调）的值用于进一步鉴定和分析。总共12个光合作用相关的基因被下调，其中9个仅与光系统II(PSII)反应中心蛋白相关，特别检测到编码光系统II反应中心蛋白A、B、C、D、E和M的基因的下调(Tikkanen等人,2014)。关于参与对胁迫的植物防御应答的基因，当在水胁迫条件下对比转基因和非转基因植物时，脂氧合酶1(LOX1)、脂氧合酶2(LOX2)和β-1、3-葡聚糖酶1基因被上调。此外，一组参与水运输的基因也是DE。从这个意义上说，转基因植物中的三种水通道蛋白样超家族蛋白受到了相当大的抑制(Johansson等人,2000;Sade和Moshelion,2017)。观察到在干旱条件下在转基因和非转基因基因型之间差异表达的大豆转录因子(Wang等人,2010)，其涉及在发育过程和响应于环境胁迫中发挥重要作用的基因（表2）。从这个意义上说，K-框区域和MADS-框(Shu等人,2013)、Squamosa启动子结合蛋白样(Tripathi等人,2017)、碱性螺旋-环-螺旋(Hudson和Hudson,2015)和Myb样转录因子(Du等人,2012)的一些成员在水胁迫下对比基因型时被下调，而其它被上调。另一方面，盐耐受性锌指(Yuan等人,2018)、WRKYDNA-结合蛋白(Yin等人,2013;Yang等人,2017)、碱性亮氨酸拉链(Zhanq等人,2018)和GBF\\'spro-富集区域-相互作用因子1的拟南芥属同源物(Tokumaru等人,2017)和整合酶型DNA结合超家族蛋白(Licausi等人,2010;Yan,2014)被上调。最后，编码参与信号转导的蛋白的基因(Ahanger等人,2018)在水胁迫条件下对比基因型时显示出变化。具体地，这些基因是钙结合EF-手家族、磷酸酶和激酶蛋白，其表达与水胁迫下的对照基因型相比在HaHB4中明显更高（表2）。表2-水胁迫下转基因和非转基因基因型之间差异表达的基因的选择的倍数变化(fc)值.基因的组从上到下对应于(A)水通道蛋白相关基因、(B)光合作用相关基因、(C)植物防御应答基因、(D)转录因子和(D)信号转导。转基因事件在低产量环境中的效力与在高产量环境中产量损失的存在之间的差异提示，启动子类型（诱导型或组成型）和HaHB4表达水平有助于对环境条件的最终应答和表现。我们在选定的具有诱导型启动子的转基因事件b1中的结果表明，由HaHB4诱导的生理学应答可以在低产量环境中转化为更高的产量，而在高产量环境中没有产量损失（图6）。实施例3:大豆事件IND-ØØ41Ø-5DNA序列表征通过分子技术表征插入植物的基因组DNA中的大豆事件IND-ØØ41Ø-5以及侧翼基因组序列。为此目的，进行了事件IND-ØØ41Ø-5的DNA测序，确定了转基因插入物的数量（在大豆基因组内整合位点的数量），还确定了在六代内序列的完整性和稳定性。此外，将下一代测序(NGS)技术与常规技术并行使用来描述事件IND-ØØ41Ø-5。将NGS用于确定：IND-ØØ41Ø-5的全基因组序列；这包括T-DNA序列；以及在T-DNA和天然大豆基因组之间的连接序列(JS)。侧翼序列允许进一步监测T-DNA插入在六个自体受精世代中的稳定性和完整性，以及在与另一种大豆品种异型杂交产生的植物中的稳定性和完整性。从事件IND-ØØ41Ø-5的纯合植物（来自温室或田间种植）或大豆植物Williams-82品种的叶组织中分离DNA用于DNA印迹分析。对于F2植物中的全基因组测序和分离分析，从胚胎组织中提取DNA。将商购可得的大豆栽培种Bio6.5(BioceresSemillasS.A.,Ocampo210bis,Rosario,阿根廷)用于携带事件IND-ØØ41Ø-5的植物的杂交。一般而言，在提取之前，将在液氮中冷冻的叶组织在带有研杵的研钵中或在“96磨机”中的管中加工成细粉以进行小量制备。以下技术用于提取植物DNA，具体取决于实验目的所需的DNA的量：-CTAB方法(十六烷基三甲基溴化铵或鲸蜡基三甲基溴化铵)：所述方法用于从植物样品中提取基因组DNA(http://irc.igd.cornell.edu/Protocols/DoyleProtocol.pdf)。将600μlCTAB缓冲液(2%w/vCTAB、100mMTrisHCl、20mMEDTA、1.4MNaCl和β-巯基乙醇)和5μgRNA酶A加入大约100mg磨碎的叶组织，并将匀浆物在55-60℃在间歇混合的情况下温育15-20分钟。将600μL氯仿加入样品中并手动混合2-3分钟，然后在10,000rpm离心8分钟。将上层水相放入干净的微管中，用400μL异丙醇沉淀DNA。将样品在12,500rpm离心10分钟以沉淀沉淀的DNA。通过在12,500rpm离心样品（5分钟），用300μl70%乙醇洗涤DNA沉淀。将DNA沉淀风干，然后重新悬浮于100μlTE缓冲液(10mMTrisHCl,1mMEDTA,pH8.0)中。将所有提取的DNA都在4℃冰箱或-20℃冰柜中储存。-Qiagen(Valencia,CA)的KitDNeasyPlantMaxi用于大制备（DNA印迹分析），或QIAprep®Miniprep(QiagenInc.)用于小制备。-从胚胎组织中分离出的DNA用于基于Illumina的测序，并用于来自IND-ØØ41Ø-5杂交和Bio6.5的F2后代的分离研究。在提取之前，将携带事件IND-ØØ41Ø-5、Williams82和F2的种子在37℃的水中温育以促进种子的破碎。然后将胚胎组织与子叶分离，并按照CTAB方法提取其DNA。使用Quant-iT™PicoGreen®(Invitrogen,Carlsbad,CA)或通过QuBit荧光计(Invitrogen)和Quant-iT™dsDNABRAssayKit(Invitrogen)，对DNA进行定量。然后，将DNA在4℃或在-20℃储存。在0.8%(w/v)琼脂糖凝胶上来回移动DNA以评估样品的完整性。将凝胶用TAE1X缓冲液(40mMTris,20mM乙酸和1mMEDTA)制备并在120v下运行。将DNA样品在负载缓冲液6x(甘油30%和溴酚蓝)和GelRedTMNucleicAcidGelStain200x(Biotium,Inc.,Hayward,CA)中稀释。将1.5%(w/v)的琼脂糖凝胶用于分离长度在200bp到1500bp之间的扩增子，而将1%(w/v)琼脂糖凝胶用于较大的DNA片段。电泳在TAE1x缓冲液中进行，并在120v运行。如上所述处理样品。根据要分辨的扩增子大小，选择分子量标志物100bp(100-2080bp)和/或LambdaBstII(从117bp至14140bp)(P-BL,阿根廷)。在大多数研究中进行的标准PCR反应是使用100ng基因组DNA模板在40μl反应体积中进行，所述反应体积的最终浓度为：1.8mMMgCl2,2mMDMSO,0.4μM每种引物,50μM每种dNTP和1U的FastStartHighFidelity(Roche,Indianapolis,IN)。将以下循环程序应用于具有400bp和700bp之间的预期大小的扩增子：1个在95℃保持30秒的循环；35个在95℃保持30秒、在55℃保持30秒、在72℃保持30秒的循环；最终的延伸：1个在72℃保持10分钟的循环。为了生成大小为1100bp至1300bp的扩增子，在72℃的延伸步骤的持续时间从30秒增加到60秒。在使用ExpandLongRange聚合酶进行整个插入物扩增的情况下，使用2.5mMMgCl2、6%DMSO、0.3μM每种引物、500μM每种dNTP和3.5U的ExpandLongRange(Roche,Indianapolis,IN)的终浓度。在以下条件下进行扩增：1个在92℃保持2分钟的循环；10个在92℃保持10秒、在55℃保持15秒、在68℃保持10分钟的循环;25个在92℃保持10秒、在55℃保持15秒、在68℃保持10分钟的循环，对于每个循环，将该最终步骤的时间增加20秒；1个在68℃保持7分钟的循环。使用来自NewEnglandBioLabs(Ipswich,MA)的Phusion®High-FidelityDNA聚合酶产生用于确定T-DNA插入序列的扩增子。如上所述通过琼脂糖凝胶电泳分辨所有测序的PCR产物，并使用IllustraGFXPCRDNA和GelBandPurificationKit(GE,Piscataway,NJ)进一步纯化。克隆（Invitrogen的TOPOTACloning®试剂盒）扩增子以通过Sanger方法测定T-DNA序列。引物名称SEQIDNO:引物序列5’-3’7505ACGCAACTGAACTCAGACCA7516AAGTGGCGATATGGTTCCAG7527GGCTGCAAGTTTTGGTCAAT7538TTCGGCTACATTTCTCAGCA7549AGCCAATGAATCCTCACCAG75510ATTAGGCGAGTAGGCAGCAA75611CAACACACCTACAAACGTGTCA75712GGGTGGGGGCTACTACTTTT75813CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG75914AGTCGACCGTGTACGTCTCC76015GTTGGGTCAGCCTGAGTGAT表3.用于通过Sanger常规测序方法确定事件IND-ØØ41Ø-5中的插入序列的引物的列表.然后通过Qiagen(Valencia,CA)按照QIAprepSpinMiniprepKit纯化克隆。将质粒DNA送到DavisSequencing(Davis,CA)进行测序。使用来自DNASTAR(Madison,WI)的软件SeqManPro分析序列。为每个扩增子至少对三个克隆进行测序。a)DNA印迹分析通过DNA印迹分析在纯合的T5IND-ØØ41Ø-5植物中确定T-DNA插入物的数量。将来自该事件的DNA用两种酶消化：HindIII和NdeI。在T-DNA中有两个HindIII位点，位于彼此附近(图1A和1B)。假设在IND-ØØ41Ø-5的基因组中出现单个完整的T-DNA，通过HaHB4探针的杂交检测到的最小片段大小将为1.85kb。另一方面，可选择bar基因的探针将检测在左边界上延伸进入大豆基因组的消化物。这些片段应该长于2.6kb(图1B)。在图9所示的DNA印迹中，突出显示的片段具有预期的大小，并且与单个T-DNA插入物一致。在构建体中有四个NdeI限制位点(图1Aa)，两个在T-DNA中，且两个在二元载体中。T-DNA中的完整NdeI消化应释放精确2703bp长的DNA区段，其包含bar探针的结合靶标。假设单个完整的T-DNA，预计HaHB4探针将检测到最小大小为1.35kb的DNA片段。NdeI消化物中的杂交带长于8.6kb(图9A)，这与单个完整T-DNA插入物的存在一致。使用液氮速冻来自IND-ØØ41Ø-5或Williams82的一克叶组织，并使用预冷的研杵和研钵研磨成细粉。按照生产商的方案，用QiagenDNeasyMaxiPrepKit提取DNA。洗脱后，通过加入1/10体积的3M醋酸钠和2-3体积的100%乙醇来沉淀DNA。用70%乙醇洗涤沉淀并悬浮在80µl1xTE缓冲液中。使用QuBit荧光计定量DNA。IND-ØØ41Ø-5的DNA浓度为1120ng/µl，且Williams82的DNA浓度为800ng/µl。为了获得用限制性酶消化的片段，对于每个50µl消化反应，将5µg基因组DNA与HindIII酶或NdeI酶以10U/µg的DNA浓度混合。将样品在37℃消化过夜（约16小时）。对于质粒对照的消化物，使用了100-200皮克的质粒DNA。将消化后的IND-ØØ41Ø-5和Williams82基因组DNA的片段与DIG标记的分子量标志物VII(Roche目录号1669940910)一起加载到0.7%琼脂糖凝胶中。将样品在50V运行过夜。将凝胶在变性缓冲液中温育两次，每次30分钟。在碱性转移之前，将变性凝胶在转移缓冲液中洗涤15分钟。按照RochePCRDIGProbeSynthesisKit(目录号11636090910)中概述的程序合成HaHB4和bar基因的分子探针（表4）。表4.用于制备在DNA印迹分析中使用的探针的引物列表.使用Turboblotter-Rapid向下转移系统(Whatman)，从琼脂糖凝胶碱性转移DNA。将DNA转移到12x21cm尼龙膜(Nytran™SuPerCharge,Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MO)4小时。在中和缓冲液(0.2M磷酸钠,pH6.8)中洗涤膜。通过UltravioletCrosslinker(CL-1000)，进行2次1500mJ曝光，将DNA永久交联到膜上。将膜在50ml的RocheDIGEasyHyb杂交缓冲液(目录号11603558001)中在预先计算的杂交温度（bar基因和HaHB4基因探针分别为45℃、55℃）在定轨摇床上温育。通过分别添加65和55µl的1xTE缓冲液来稀释35µl和45µlbar和HaHB4探针的等分试样。将探针溶液在95℃温育10分钟，并冷却至4℃保持2分钟。将它们添加到8.75mlDIG杂交缓冲液中并倒入杂交瓶的底部。将膜在带有定轨摇床的分子杂交仪(VWRscientificproducts)中在所描述的杂交温度温育16小时。杂交后，根据与Roche,DIGLuminescentDetectionKit一起提供的说明书，用洗涤缓冲液洗涤膜。用1x封闭试剂封闭1小时后，将膜在含有50ml1x封闭试剂和5µl抗地高辛配基-AP的溶液中温育30分钟。将膜用洗涤缓冲液洗涤两次，每次30分钟，最后用检测缓冲液处理5分钟。在此时将膜置于KPLHybridizationBag(KPL目录号60-00-51)中。将来自DIGLuminescentDetectionKit的5mlCSPD溶液均匀地施加在膜上。将膜与CSPD溶液一起在室温温育5分钟。将带有膜的杂交袋热封并在37℃温育15分钟。将杂交袋在暗室中放入装有KodakBiomaxLightFilm(目录号1788207)的盒中并曝光20分钟。使用KonikaQX-60AX-射线胶片处理器在暗处使胶片显影。根据需要在1小时或2小时进行后续曝光。b)事件IND-ØØ41Ø-5的T-DNA序列的连接序列分析(JSA)使用Illumina生成的序列数据的IND-ØØ41Ø-5的连接序列分析(JSA)与单个基因座处的插入物的整合或单个拷贝一致。该结果得到了在包含事件IND-ØØ41Ø-5的测序全基因组中仅两个连接序列的发现的支持。连接序列(JS)以在其中整合T-DNA的染色体命名。根据SoyBase数据在大豆基因组中的位置为JS-9L-32743826和JS-9R-32743683。JSA如图10所示。从Illumina生成的DNA序列读出从头组装T-DNA插入物及其侧翼大豆序列的完整序列(SEQIDNO:1)。经验证，事件IND-ØØ41Ø-5中的T-DNA插入物序列与二元质粒中的T-DNA序列相同，每个基因和每个调节元件都有单个拷贝，除了RB的几乎完全缺乏以外（图1B）。覆盖整个插入序列及其侧翼序列的多个扩增子的常规Sanger测序证实了Illumina生成的序列的JSA分析。此外，使用ExpandLongRangePCR和一组与侧翼序列互补的引物，有可能生成4710bp的单个扩增子。使用IND-ØØ41Ø-5或Williams82DNA作为模板获得的扩增子具有预期的大小，并且该IND-ØØ41Ø-5扩增子的DNA序列与来自全基因组测序的T-DNA序列相同。c)IND-ØØ41Ø-5T-DNA在大豆基因组中的定位.通过使用BLASTN(Altschul等人.1990)的同源性搜索将侧翼序列映射到大豆基因组。T-DNA的插入发生在染色体9的单个位置。插入位于F-框At1g60400-样推定基因(对应于参照基因组(Williams82)中的Glyma.09g142000，以前称作Glyma09g26270)的最后一个外显子（外显子编号5）下游752bp，和最近证实的基因ATL6-样E3泛素连接酶上游405,138bp。应当注意的是，大豆染色体的142bp片段在T-DNA插入位点丢失。所述插入没有破坏大豆基因组中的任何基因或任何其它已知的注释特征（图11）。d)转基因二元质粒元件的不存在：大体而言，土壤杆菌应仅将其T-DNA（被包含在左边界(LB)和右边界(RB)序列之间的质粒部分）转移到宿主细胞中。但是，已经报道，土壤杆菌也可以转移不对应于T-DNA的二元质粒的一部分，或甚至其全部(DeBuck等人.2000)。对所述非故意DNA在IND-ØØ41Ø-5大豆基因组中的存在的测定结果为阴性。使用IlluminaNGS技术对全基因组进行测序，以明确确定在事件IND-ØØ41Ø-5中不存在质粒序列的其余部分。此外，进行DNA印迹测定以提供第二个测定以证明载体序列的其余部分的不存在。对T-DNA外源的质粒序列特异的探针(aadA、STA和REP)均未与IND-ØØ41Ø-5的基因组DNA杂交。e)以IND-ØØ41Ø-5和T-DNA完整性计的插入基因座稳定性：监测跨六代的IND-ØØ41Ø-5T-DNA的位置。选择一组PCR引物对以提供跨越IND-ØØ41Ø-5T-DNA的插入基因座的重叠扩增子，包括大豆染色体9侧翼序列。从这些重叠PCR产物组装的重叠群的序列提示，T-DNA是完整的和稳定的。IND-ØØ41Ø-5大豆事件中遗传元件的组构与用于转化以获得该转基因品系的二元质粒T-DNA中存在的组构相同。在六个测试世代中没有检测到DNA序列的变化。f)性转移中的T-DNA分离：使用PCR在来自IND-ØØ41Ø-5和商业大豆栽培种(Bio6.5)之间杂交的F2后代植物中评估T-DNA的分离。一组PCR反应（其诊断在左边界处的T-DNA连接点和天然大豆等位基因）清楚地表明T-DNA分离为单个基因座。将纯合的IND-ØØ41Ø-5转基因植物与Bio6.5杂交以产生F1后代。使四株F1植物自花授粉以产生用于分离分析的F2种子。使用73粒F2种子进行DNA分离和相应的实验。当左边界连接点的扩增子存在而天然等位基因的扩增子不存在时，F2植物被评为IND-ØØ41Ø-5T-DNA纯合子(I)。当上述两种扩增子都存在时，F2植物被评为半合子(H)。当左边界连接点的扩增子不存在而天然等位基因的扩增子存在时，F2植物被评为天然Williams82栽培种等位基因的纯合子(W)。这些结果支持这样的结论，即IND-ØØ41Ø-5T-DNA位于大豆基因组内的单个基因座处，并根据孟德尔遗传原则进行遗传。选定的转基因事件IND-ØØ41Ø-5与亲本Williams82相差单个T-DNA。该T-DNA带有选择标记基因bar的单拷贝和HaHB4基因的单拷贝以及它们的调节序列。T-DNA被整合到染色体9中的两个编码F-框At1g60400-样蛋白和AtL6-样E3泛素连接酶的天然基因之间。整合不会破坏任何已知的基因或注释序列，但会导致与基因间区域对应的142对碱基对的序列的丢失。插入的基因座和T-DNA结构在六代自花授粉中是稳定的。显示了T-DNA插入以孟德尔方式分离。在T-DNA边界之外的序列没有整合到IND-ØØ41Ø-5事件中。实施例4:用于鉴定样品中的IND-ØØ41Ø-5的有用方法以下实施例描述了可用于鉴定大豆样品中的事件IND-ØØ41Ø-5的DNA的事件特异性的检测系统。该方法是位点特异性的，因此，仅扩增事件IND-ØØ41Ø-5的插入位点之一的序列。使用特异性寡核苷酸和分别连接到FAM和HEX用于HaHB4和Le1的不同荧光探针进行HaHB4和Le1(参考大豆基因卵磷脂1)的多路qPCR。多路qPCR技术也用于使用分别用FAM和HEX标记的探针的事件IND-ØØ41Ø-5和bar转基因的RB。另一方面，通过终点PCR检测事件的LB，并将qPCR用于使用用HEX标记的探针对野生型等位基因(WT)的检测。图12显示了在IND-ØØ41Ø-5中插入的方案以及用于检测构建体的不同元件的寡核苷酸位置和探针。-朝向RB的插入位点的检测RB(T-DNA右边界)的大部分在插入过程中丢失；只剩下3bp。提及它的目的是为了知道相对于原始构建体的插入物。寡核苷酸817(SEQIDNO:)和818(SEQIDNO:)扩增由左侧翼序列(大豆基因组“Gmchr9”)和插入构建体的一部分形成的200bp嵌合(quimeric)片段。寡核苷酸和探针：817(SEQIDNO:26):5GCAACTGAACTCAGACCACTG3818(SEQIDNO:27):5GAGCTTGAGCTTGGATCAGA3819(SEQIDNO:28):5-FAM-TTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAA-BHQ1-3qPCR方案:扩增程序：-朝向LB的插入位点的检测寡核苷酸868(SEQIDNO:29)和752(SEQIDNO:30)扩增由右侧翼序列(大豆基因组“Gmchr9”)和事件IND-ØØ41Ø-5的一部分形成的356bp嵌合片段。寡核苷酸：868(SEQIDNO:29):5CCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC3752(SEQIDNO:30):5GGCTGCAAGTTTTGGTCAAT3PCR方案:扩增程序:-HaHB4检测寡核苷酸530(SEQIDNO:31)和531(SEQIDNO:32)扩增在HaHb4转基因内的68bp片段。寡核苷酸和探针：530(SEQIDNO:31):5CGCCACTTGACGAGGATGA3531(SEQIDNO:32):5CGAGACCCGAGTTAAGGATGAAAC532(SEQIDNO:33):5-FAM-AGCCCGAGTTTATGTGCCAACTGGT-BHQ1-3qPCR方案:扩增程序：Bar检测寡核苷酸527(SEQIDNO:34)和528(SEQIDNO:35)扩增在bar转基因内的84bp片段。寡核苷酸和探针：527(SEQIDNO:34):5CTGCACCATCGTCAACCACTAC3528(SEQIDNO:35):5GGTCGTCCGTCCACTCCTG3529(SEQIDNO:36):5´-HEX-TCGAGACAAGCACGGTCAACTTCC-BHQ1-3´qPCR方案:扩增程序:在需要HaHB4和bar检测的情况下，可以用最后两个系统通过多路qPCR同时进行。HaHB4探针具有FAM荧光团，而Bar探针具有HEX荧光团，使得能够使用不同的过滤器检测两种扩增。此外，HaHB4以及bar（单独地）可以通过多路qPCR用内源性对照同时检测，前提条件是，所述对照具有与感兴趣的基因不同的荧光团。内源性对照的实例是大豆特异性卵磷脂基因。多路PCR的方案和扩增程序详述如下。多路qPCR方案:扩增程序:le1检测寡核苷酸718(SEQIDNO:37)和719(SEQIDNO:38)扩增在卵磷脂1基因内的118bp片段。寡核苷酸和探针：718(SEQIDNO:37):5CTACTGACCAGCAAGGCAAA3719(SEQIDNO:38):5TCACAATAGCGTCTCCTTGG3720(SEQIDNO:39):5´-HEX-TCGTGCCGAAGCAACCAAACA-BHQ1-3´qPCR方案:扩增程序：杂合个体的检测事件插入与基因Glyma.09g142000（以前称作Glyma09g26270）的3’UTR区域相邻。使用在插入位点的侧翼序列中杂交的寡核苷酸，有可能将野生等位基因（它们扩增205bp片段）与具有IND-ØØ41Ø-5的插入物的等位基因（在该情况下，它们扩增4710bp）区分开。对于杂合个体的检测，借助于前面提到的2个事件特异性系统中的任何一个首先进行事件IND-ØØ41Ø-5的检测，并然后进行qPCR以检测野生等位基因。寡核苷酸934(SEQIDNO:40)和935(SEQIDNO:41)扩增由IND-ØØ41Ø-5事件插入位点的侧翼序列和在转化过程中丢失的142bp的一部分（在事件IND-ØØ41Ø-5中不存在）形成的205bp片段。寡核苷酸和探针：934(SEQIDNO:40):5AGACCACTGAAATAGAGAGAAAG3935(SEQIDNO:41):GGAGTTCTGATAATTGTTATCGTC936(SEQIDNO:42):5HEX-TGAAGTGAGATGATTGAGGGTGGG-BHQ13PCR方案:扩增程序:实施例5:对非生物胁迫因素和产量的敏感性在其中评估事件IND-ØØ41Ø-5和对照的环境在其潜在产量方面存在差异，这可能是由于胁迫因素诸如干旱、盐度和低温(渗透胁迫)、高温、过量辐射、低营养物可用性、阻碍根发育的土壤压实等的组合所致。在不同位置和不同播种日期在三个生长季节评估了转基因事件的效力，评估了总共16个地点。组合的这些胁迫因素的集合允许将环境分为高、中和低产量潜力的类别。具有转基因事件的情况下，对于产量低于2000kg/公顷的地点(W1、W2、P、I1和J1)，获得了高于对照的产量，其统计显著性水平为10%(p=0.09)。产量差异为12%，有利于转基因事件。对于更高的产量类别，在事件和对照之间没有发现显著差异，表明在中产量潜力(2000-3000Kg/公顷)(I2、G1、G2、J2和K)或高产量潜力(>3000Kg/公顷)(D2、C、Q2、L、A和F)的条件下没有损失（表5）。这些结果证实了存在由于每个地点或环境特有的非生物胁迫的不同组合所致的预期基因型-环境相互作用(p=0.02)，并表明转基因事件中对这些因素的敏感性与基因作用模式的相关特征特别有关。在各个地点分析了对事件IND-ØØ41Ø-5及其对照观察到的产量，因为特定环境条件在与引入的基因相关的表型的表达中起关键作用。在不同位置和不同播种日期在三个生长季节评估了引入基因的效力，评估了总共16个地点。十六个地点中的十二个对应于生长季节2012-2013，其中测量了在转基因事件和对照中以及在用作参考的品种中的所有农学参数。在所述生长季节，北部和南部核心区的产量大大高于以前的产量，此外，在孤立的土地块(BolsadeCereales,2013)上观察到了前所未有的历史产量。其余四个地点对应于在之前的生长季节中进行以确定与对照相比事件的效力的测定。这四个测定对应于以下位置：Hughes,SantaFe(地点L,2011-2012),Quimili,SantiagodelEstero(2009-2010,地点K)和LiborioLuna,SanLuis(2009-2010)，以及两种水文条件：低可用性(J1)和高可用性(J2)。通过使用地点和基因型作为因素的方差分析并评价基因型-环境相互作用的显著性来分析数据。使用最小显著差异(LSD)检验进行“后验”对比。结果证实了对于评价的地点，存在基因型-环境相互作用(p=0.02)。转基因事件在16个地点中的11个具有更高的产量，对于具有正差异的地点而言平均差异为11%（图13）。还在根据产量类别分组的地点中相对于对照在产量方面评价了引入的基因应答。将具有相似等级的地点分组允许评价在不同潜在产量条件下的事件应答。对于具有低于2000kg/公顷的产量的地点(W1、W2、P、I1和J1)，转基因事件相对于对照获得了更高的产量，显著性水平为10%(p=0.09)。产量差异为12%，有利于转基因事件。对于较高的产量类别，在事件和对照之间没有发现显著差异，表明在中(2000-3000Kg/公顷)(I2、G1、G2、J2和K)或高(>3000Kg/公顷)(D2、C、Q2、L、A和F)(表5)产量潜力的条件下没有损失。*:指示显著差异(α=0.1)NS:无显著差异表5.低、中和高产量潜力环境的转基因事件和对照的平均产量。当前第1页12