用于选择性体内扩增
γδ
t细胞群的方法及其组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2018年12月3日提交的美国临时申请号62/774,817的优先权权益，该申请的内容在此以引用方式整体并入并用于所有目的。
背景技术：
3.t淋巴细胞的抗原识别可以通过高度多样化的异二聚体受体，即t细胞受体(tcr)实现。血液和淋巴器官中大约95％的人t细胞表达异二聚体αβtcr受体(αβt细胞谱系)。血液和淋巴器官中大约5％的人t细胞表达异二聚体γδtcr受体(γδt细胞谱系)。这些t细胞亚群可以分别称为“αβ”和“γδ”t细胞。αβ和γδt细胞的功能不同。当抗原呈递细胞(apc)在i/ii类mhc的背景下呈递抗原时，则发生αβt细胞的活化。与αβt细胞相比，γδt细胞可不依赖于mhc限制而识别抗原。此外，γδt细胞组合了先天性和过继性免疫识别和应答。
4.γδt细胞利用一组不同的体细胞重排变量(v)、多样性(d)、连接(j)和恒定(c)基因。γδt细胞比αβt细胞含有更少的v、d和j区段。尽管生殖系vγ和vδ基因的数量比vα和vβtcr基因库更有限，但是tcrγ和δ链重排期间更广泛的连接多样化过程产生了比αβtcr潜在更大的γδtcr库(carding和egan,nat rev immunol(2002)2:336)。
5.人γδt细胞使用3个主要vδ(vδ1、vδ2、vδ3)和至多六个vγ区基因来构成其tcr(hayday ac.,annu rev immunol.2000；18,975
‑
1026)。两个主要vδ亚群是vδ1和vδ2γδt细胞。具有不同vγ的vδ1t细胞在粘膜γδt细胞的上皮内亚群中占优势，在该上皮内亚群中，tcr似乎识别上皮细胞上的应激分子(beagley kw,husband aj.crit rev immunol.1998；18(3):237
‑
254)。通常共表达vγ9的vδ2t细胞在外周血和淋巴系统中是丰富的。
6.γδt细胞直接识别患病细胞上的抗原的能力以及表现出杀伤肿瘤细胞的固有能力使得γδt细胞成为有吸引力的治疗工具。γδt细胞中丰富的vγ9vδ2亚型识别焦磷酸化合物，诸如微生物化合物(e)
‑4‑
羟基
‑3‑
甲基
‑
丁
‑2‑
烯基焦磷酸盐。然而，其它γδt细胞亚型识别的配体是未知的。
7.vγ9vδ2t细胞的过继性转移对研究性癌症治疗产生了有限的客观临床反应(kondo等人,cytotherapy,10:842
‑
856,2008；lang等人,cancer immunology,immunotherapy:cii,60:1447
‑
1460,2011；nagamine等人,2009；nicol等人,british journal of cancer,105:778
‑
786,2011；wilhelm等人,blood.2003年7月1；102(1):200
‑
6)，表明需要分离和测试临床上的新型γδt细胞群。
8.选择性扩增具有有效抗肿瘤活性以及改善的纯度和临床相关水平的γδt细胞亚群的能力是非常期望的。尽管已将抗体和细胞因子混合物用于繁殖更多样化的γδt细胞群，但是还未将特异性γδt细胞亚群活化至足够的纯度和临床相关水平(dokouhaki等人,2010；kang等人,2009；lopez等人,2000；kress,2006)。
9.已经通过使用已知的vγ9vδ2配体在体外和体内证明了γδt细胞亚型的选择性扩增。例如，pressey等人,medicine(baltimore).2016年9月；95(39):e4909报告了使用静脉注射唑来膦酸盐(一种合成焦磷酸盐模拟物)和皮下il
‑
2在体内扩增vγ9vδ2。已经通过使
用选择性结合和交联的固定化抗体离体证明了其它γδt细胞亚型(例如δ1、δ2和δ3亚型)的选择性扩增。参见wo 2016/081518；wo 2017/197347；以及wo 2019/099744，这些文献的内容整体并入。然而，不幸的是，体内固定化通常是通过使抗体与细胞表面的fc受体结合来进行的，这通常被认为会诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)效应，从而减少被抗体识别的γδt细胞群。类似地，减少fc受体与抗体之间相互作用的方法也会减少固定化，因此也不被认为会实现稳健的体内扩增。因此，非常需要在体内扩增特异性γδt细胞亚群的临床相关方法，以及由此产生的细胞。
技术实现要素：
10.本发明人已经鉴定了i)通过与δ1tcr的特异性活化表位结合来选择性活化和扩增δ1t细胞的活化剂，ii)通过与δ2tcr的特异性活化表位结合来选择性活化和扩增δ2t细胞的活化剂；以及通过与δ3tcr的特异性活化表位结合来选择性活化和扩增δ3t细胞的活化剂。本发明人惊奇地发现，在生理相关环境中，此类抗体可有效地活化和扩增以及支持过继性转移的嵌合抗原受体(car)γδt细胞和/或内源性γδt细胞在体内的持续存在。
11.本文描述了用于将这些活化剂单独或组合用于γδt细胞的体内扩增的方法和组合物。这些方法和组合物可适用于一种或多种γδt细胞亚群的选择性活化和扩增。体内扩增方法和组合物可适用于维持和/或扩增内源性γδt细胞或其亚群。另外，或另选地，体内扩增方法和组合物可适用于维持和/或扩增已经向受试者施用的γδt细胞或其亚群。
12.在第一方面，本发明提供了一种用于活化、扩增和/或维持受试者体内的t细胞群的体内方法，该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂，其中一种或多种选择性扩增δ1t细胞的药剂与δ1tcr的特异性活化表位结合；并且一种或多种选择性扩增δ2t细胞的药剂与δ2tcr的特异性活化表位结合；一种或多种选择性扩增δ3t细胞的药剂与δ3tcr的特异性活化表位结合，从而活化、扩增或维持受试者体内的γδt细胞群。
13.在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种选择性扩增δ1t细胞的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂选自与选自ts
‑
1和ts8.2的抗体结合至相同表位的药剂。在一些实施方案中，与选自ts
‑
1和ts8.2的抗体结合相同表位的药剂包含ts
‑
1或ts8.2的cdr和/或是人源化ts
‑
1或ts8.2。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂选自不与ts
‑
1、ts8.2或r9.12竞争的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂选自与包含δ1可变区的表位特异性结合的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂与包含δ1可变区的残基arg71、asp72和lys120的表位结合。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂与在δj1和δj2的k120处包含突变的突变型δ1tcr多肽的结合减少。
14.在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂是结合人δ1 tcr的以下表位的药剂：δ1tcr bin 1δ1表位、bin 1bδ1表位、bin 2δ1表位、bin 2bδ1表位、bin 2cδ1表位、bin 3δ1表位、bin 4δ1表位、bin 5δ1表位、bin 6δ1表位、bin 7δ1表位、bin 8δ1表位或bin 9δ1表位。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂选自与选自由以下组成的组的抗体结合至相同或基本上相同的表位或者与该抗体竞争的药剂：δ1
‑
05、δ1
‑
08、δ1
‑
18、δ1
‑
22、δ1
‑
23、δ1
‑
26、δ1
‑
35、δ1
‑
37、δ1
‑
39、δ1
‑
113、δ1
‑
143、δ1
‑
149、δ1
‑
155、δ1
‑
182、δ1
‑
183、δ1
‑
191、δ1
‑
192、δ1
‑
195、δ1
‑
197、δ1
‑
199、δ1
‑
201、δ1
‑
203、δ1
‑
239、δ1
‑
253、δ1
‑
257、δ1
‑
278、δ1
‑
282和δ1
‑
285。
15.在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂是选自由以下组成的组的抗体：δ1
‑
05、δ1
‑
08、δ1
‑
18、δ1
‑
22、δ1
‑
23、δ1
‑
26、δ1
‑
35、δ1
‑
37、δ1
‑
39、δ1
‑
113、δ1
‑
143、δ1
‑
149、δ1
‑
155、δ1
‑
182、δ1
‑
183、δ1
‑
191、δ1
‑
192、δ1
‑
195、δ1
‑
197、δ1
‑
199、δ1
‑
201、δ1
‑
203、δ1
‑
239、δ1
‑
253、δ1
‑
257、δ1
‑
278、δ1
‑
282和δ1
‑
285。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂选择性扩增δ1t细胞和δ3t细胞。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞的药剂选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5γδt细胞。
16.在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种选择性扩增δ2t细胞的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂选自与选自15d和b6的抗体结合至相同表位的药剂。在一些实施方案中，与选自15d和b6的抗体结合相同表位的药剂包含15d或b6的cdr和/或是人源化15d和b6。在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂选自与抗体15d和/或b6结合不同表位的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂选自与包含δ2可变区的表位特异性结合的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂与在δ2可变区的g35处包含突变的突变型δ2tcr多肽的结合减少。在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂结合人δ2tcr的δ2tcr bin 1δ2表位、bin 2δ2表位、bin 3δ2表位或bin 4δ2表位。
17.在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂是与选自由以下组成的组的抗体结合至相同或基本上相同的表位或者与该抗体竞争的药剂：δ2
‑
14、δ2
‑
17、δ2
‑
22、δ2
‑
30、δ2
‑
31、δ2
‑
32、δ2
‑
33、δ2
‑
35、δ2
‑
36和δ2
‑
37。在一些实施方案中，选择性扩增δ2t细胞的药剂是选自由以下组成的组的抗体：δ2
‑
14、δ2
‑
17、δ2
‑
22、δ2
‑
30、δ2
‑
31、δ2
‑
32、δ2
‑
33、δ2
‑
35、δ2
‑
36和δ2
‑
37。
18.在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种选择性扩增δ3t细胞的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ3t细胞的药剂选自与选自由以下组成的组的抗体结合至相同或基本上相同的表位或者与该抗体竞争的药剂：δ3
‑
08、δ3
‑
20、δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58。在一些实施方案中，选择性扩增δ3t细胞的药剂选自与选自由以下组成的组的抗体结合至相同或基本上相同的表位或者与该抗体竞争的药剂：δ3
‑
08、δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58。在一些实施方案中，选择性扩增δ3t细胞的药剂选自与选自由以下组成的组的抗体结合至相同或基本上相同的表位或者与该抗体竞争的药剂：δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58。
19.在一些实施方案中，选择性扩增δ3t细胞的药剂是选自由以下组成的组的抗体或其片段：δ3
‑
08、δ3
‑
20、δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58。在一些实施方案中，选择性扩增δ3t细胞的药剂是选自由以下组成的组的抗体或其片段：δ3
‑
08、δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58。在一些实施方案中，选择性扩增δ3t细胞的药剂是选自由以下组成的组的抗体或其片段：δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58。
20.一般来讲，药剂是人或人源化药剂，诸如人抗体或其片段或者人源化抗体或其片段。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是多价的，优选地其中多价药剂包含至少两个或多于两个特异性结合相同抗原的抗原结合位点，或者其中多价药剂包含至少两个或多于两个特异性结合相同抗原的相同表位的抗原结合位点。
在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是或至少是三价、四价或五价的。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是或至少是三价、四价或五价的，并且是单特异性的。
21.在一些实施方案中，该方法包括向患者施用工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群。在一些实施方案中，该方法包括在施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞的药剂之前施用工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群。在一些实施方案中，该方法包括在施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞的药剂之后施用工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞的药剂，从受试者分离包含体内扩增的γδt细胞的样品，任选地工程改造一种或多种分离的γδt细胞，任选地离体扩增一种或多种分离的(例如，和工程改造的)γδt细胞，然后向同一或不同受试者施用分离的、工程改造和/或非工程改造的以及/或者离体扩增的γδt细胞。在一些实施方案中，施用的工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群是受试者自体的细胞群。
22.在一些实施方案中，施用的工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群是与受试者同种异体的细胞群。在一些实施方案中，施用的工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群是包含至少60％(例如，至少70％、80％或90％；约60％至约80％；或约60％至约90％)δ1γδt细胞的群，并且该方法包括施用γδt细胞以及依次或同时施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞的药剂。
23.在一些实施方案中，施用的工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群是包含至少60％(例如，至少70％、80％或90％；约60％至约80％；或约60％至约90％)δ2γδt细胞的群，并且该方法包括施用γδt细胞以及依次或同时施用一种或多种选择性扩增δ2t细胞的药剂。
24.在一些实施方案中，施用的工程改造和/或非工程改造的γδt细胞群是包含至少10％(例如，至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％；约10％至约80％；约20％至约40％；约20％至约50％；或约20％至约60％)δ3γδt细胞的群，并且该方法包括施用γδt细胞以及依次或同时施用一种或多种选择性扩增δ3t细胞的药剂。
25.在一些实施方案中，该方法包括施用氨基膦酸盐(例如，氨基二膦酸盐)或异戊二烯基
‑
磷酸盐。在一些实施方案中，该方法包括施用选自由以下组成的组的氨基膦酸盐：唑来膦酸盐、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸和英卡膦酸或它们的盐和/或它们的水合物。在一些实施方案中，该方法包括重复施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞和/或δ3t细胞的药剂。在一些实施方案中，该方法包括扩增或维持受试者体内施用的γδt细胞群。在一些实施方案中，该方法包括扩增或维持受试者体内的内源性γδt细胞群。在一些实施方案中，该方法包括活化、扩增或维持受试者体内的内源性γδt细胞群，从受试者分离含有内源性γδt细胞的样品，操纵分离样品的γδt细胞(例如，通过纯化、离体扩增和/或工程改造)，向同一或不同受试者施用操纵过的γδt细胞，然后通过施用一种或多种选择性体内活化剂来活化、扩增或维持同一或不同受试者体内施用的γδt细胞群。
26.在一些实施方案中，该方法包括扩增受试者体内的内源性和/或施用的γδt细胞群，使其超过未施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞和/或δ3t细胞的药剂的受试者体内的γδt细胞的量可检测量(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、2倍、
10倍或50倍；或约10％至约20％；约10％至约50％；约10％至约75％；约10％至约2倍；约10％至约10倍；约2倍至约10倍；或约10倍至约50倍)。在一些实施方案中，该方法包括维持受试者体内较大的内源性和/或施用的γδt细胞群，使其超过未施用一种或多种选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞和/或δ3t细胞的药剂的受试者体内的γδt细胞的数量可检测量(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、2倍、10倍或50倍；或约10％至约20％；约10％至约50％；约10％至约75％；约10％至约2倍；约10％至约10倍；约2倍至约10倍；或约10倍至约50倍)。
27.在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是多价的，优选地其中多价药剂包含至少两个特异性结合相同抗原的抗原结合位点，或者其中多价药剂包含至少两个特异性结合相同抗原的相同表位的抗原结合位点。在一些实施方案中，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是多价的，优选地其中多价药剂包含至少三个特异性结合相同抗原的抗原结合位点，或者其中多价药剂包含至少三个特异性结合相同抗原的相同表位的抗原结合位点。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是或至少是二价、三价、四价或五价的。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是或至少是三价、四价或五价的。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是或至少是四价的。
28.在一些实施方案中，该方法包括同时或依次向受试者施用细胞因子。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用工程改造的γδt细胞，其中工程改造的γδt细胞包含编码分泌细胞因子的转基因。在一些实施方案中，细胞因子是常见的γ链细胞因子，或选自由il
‑
2、il
‑
15和il
‑
4组成的组的细胞因子，优选地其中细胞因子是il
‑
2、il
‑
15和/或il
‑
4。在一些实施方案中，该方法包括在施用γδt细胞之前向受试者施用淋巴细胞清除(lymphodepletion)方案。
29.在第二方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中的癌症、传染病、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，该方法包括进行上述体内扩增方法中的任一种以及/或者使用本文所述的γδt细胞活化剂中的任一种或多种在有需要的受试者中体内扩增γδt细胞。
30.在第三方面，本发明提供选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞的药剂在制备用于在有需要的受试者中体内扩增γδt细胞的药物中的用途。在一些实施方案中，在受试者中体内扩增γδt细胞包括治疗受试者中的癌症、传染病、炎性疾病或自身免疫疾病。
31.以引用方式并入
32.在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入。
附图说明
33.本发明的新型特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考对其中利用了本发明原理的示例性实施方案作出阐述的以下具体实施方式以及附图(本文也称为“图”)，将更好地理解本发明的特征和优点，其中：
34.图1描绘了δ1特异性mab的重链框架和互补决定区氨基酸序列。
35.图2描绘了图1所述的δ1特异性mab的轻链框架和互补决定区氨基酸序列。
36.图3描绘了δ2特异性mab的重链框架和互补决定区氨基酸序列。
37.图4描绘了图3所述的δ2特异性mab的轻链框架和互补决定区氨基酸序列。
38.图5示出了δ3特异性抗γδtcr抗体的可变区序列。上部重链可变区的序列。下部轻链可变区的序列。
39.图6示出了在将人γδt细胞过继转移给小鼠后，γδt细胞亚型特异性活化剂对在小鼠血液、骨髓、肺和脾中检测到的总人cd45 细胞数量的体内影响。未处理的小鼠未用活化剂处理。如所示，经处理的小鼠用3μg或10μg活化剂处理。d1
‑
35是指本文所述的δ1γδt细胞特异性抗体δ1
‑
35。一些动物还在施用细胞前4
‑
5小时接受非特异性鼠igg级分的腹膜内注射，以使未占据的fc受体饱和。
40.图7a
‑
b示出了在用活化剂处理5天后血液、骨髓和脾中过继转移的人γδt细胞的增殖，如通过由于在3μg和10μg剂量水平下细胞后代中染料稀释导致的celltrace violet迹线向左移向降低的mfi所证明的。
41.图8示出了所示活化抗体d1
‑
35和d1
‑
08(δ1
‑
08)的体内活化，如通过celltrace violet所检测到的。第1行，小鼠未用活化剂处理。第2行，小鼠用活化剂d1
‑
35处理。第3行，小鼠用活化剂处理，而不用非特异性鼠igg处理。第4行，小鼠用d1
‑
35活化剂的higg4同种型版本处理。第5行，小鼠用活化剂d1
‑
08处理。
42.图9a
‑
b示出了在分别用d2
‑
37(δ2
‑
37)和d3
‑
23(δ3
‑
23)活化抗体处理的动物的骨髓和脾中检测到的vδ2和vδ3细胞的体内增殖，如通过celltrace violet染料稀释所检测到的。
具体实施方式
43.虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是将对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。本领域的技术人员可以想到许多变形、改变和替换而不脱离本发明。应当理解，可以采用本文所述的发明的实施方案的各种替代方案。
44.定义
45.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文所述的发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。为了解释本说明书，以下定义将适用，并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果阐述的任何定义与以引用的方式并入本文的任何文档发生冲突，则以下面阐述的定义为准。
46.如本文所用，术语“γδt细胞(gamma delta t细胞)”是指在其表面上表达由一条γ
‑
链和一条δ
‑
链组成的独特的t细胞受体(tcr)，即γδtcr的t细胞亚群。术语“γδt细胞”具体包括γδt细胞的所有亚群及其组合，包括但限于vδ1、vδ2和vδ3γδt细胞，以及幼稚γδt细胞、效应记忆γδt细胞、中央记忆γδt细胞和终末分化的γδt细胞。又如，术语“γδt细胞”包括vδ4、vδ5、vδ7和vδ8γδt细胞，以及vγ2、vγ3、vγ5、vγ8、vγ9、vγ10和vγ11γδt细胞。
47.如本文所用，术语“t淋巴细胞”或“t细胞”是指表达cd3(cd3 )和t细胞受体(tcr )的免疫细胞。t细胞在细胞介导的免疫中发挥重要作用。
48.如本文所用，术语“tcr”或“t细胞受体”是指形成α
‑
β或γ
‑
δ受体的二聚体异源性
细胞表面信号传导蛋白。αβtcr识别由mhc分子呈递的抗原，而γδtcr识别与mhc呈递无关的抗原。
49.术语“mhc”(主要组织相容性复合物)是指编码细胞表面抗原呈递蛋白的基因的子集。在人中，这些基因称为人白细胞抗原(hla)基因。在本文中，缩写mhc或hla可互换使用。
50.如本文所用，术语“外周血淋巴细胞”或“pbl”以最广泛的意义使用，是指包括一系列分化和功能阶段的t细胞和b细胞的白细胞、浆细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。外周血中t淋巴细胞的范围为约20
‑
80％。
51.如本文所用，术语“细胞群”是指通过直接从合适的来源，通常从哺乳动物分离获得的多个细胞。随后可以体外培养分离的细胞群。本领域的普通技术人员将理解，用于分离和培养细胞群的各种方法均适用于本发明，并且细胞群中的各种细胞数目均适用于本发明。可以通过各种培养技术和/或对特定细胞类型的阴性或阳性选择来将细胞群纯化至同质、基本同质或者耗尽一种或多种细胞类型(例如，αβt细胞)。细胞群可以是例如来源于外周血样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检样品、组织、淋巴、皮肤、肿瘤浸润性淋巴细胞的样品或含有肿瘤浸润性淋巴细胞的样品或者来自受试者的直接接触外部环境的上皮部位或来源于前体干细胞的混合异质细胞群。另选地，混合细胞群可以来源于由外周血样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检样品、组织、淋巴、皮肤、肿瘤浸润性淋巴细胞的样品或含有肿瘤浸润性淋巴细胞的样品建立的哺乳动物细胞的体外培养物，或者来自受试者的直接接触外部环境的上皮部位或来源于前体干细胞。
[0052]“富集的”细胞群或制剂是指来源于起始混合细胞群且含有特定细胞类型的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比的细胞群。例如，起始混合细胞群可以是针对特定γδt细胞群富集的。在一个实施方案中，富集的γδt细胞群含有δ1细胞的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。又如，富集的γδt细胞群可含有δ1细胞的百分比和δ3细胞的百分比大于起始群体中相应细胞类型的百分比。还如，富集的γδt细胞群可含有δ1细胞的百分比和δ4细胞的百分比大于起始群体中相应细胞类型的百分比。又如，富集的γδt细胞群可含有δ1细胞的百分比和δ5细胞的百分比大于起始群体中相应细胞类型的百分比。还如，富集的γδt细胞群可含有δ1t细胞、δ3t细胞、δ4t细胞和δ5t细胞的百分比大于起始群体中相应细胞类型的百分比。在另一个实施方案中，富集的γδt细胞群含有δ2细胞的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。在另一个实施方案中，富集的γδt细胞群含有δ3细胞的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。在又一个实施方案中，富集的γδt细胞群含有δ1细胞和δ2细胞的百分比均大于起始群体中相应细胞类型的百分比。在又一个实施方案中，富集的γδt细胞群含有δ1细胞、δ2细胞和δ3细胞的百分比大于起始群体中相应细胞类型的百分比。在所有实施方案中，富集的γδt细胞群含有αβt细胞群的百分比较小。
[0053]
如本文所用，所谓“扩增”意指富集制剂中期望或靶细胞类型(例如，δ1和/或δ2t细胞和/或δ3t细胞)的数量大于初始或起始细胞群中的数量。
[0054]
所谓“选择性扩增”意指靶细胞类型(例如，δ1、δ2或δ3t细胞)优先扩增超过其它非靶细胞类型，例如αβt细胞或nk细胞，或非靶向γδt细胞亚群。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ1、δ2和/或δ3t细胞，而不扩增或不显著扩增αβt细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ1t细胞，而不扩增或不显著扩增δ2t细胞。在其它实施方案中，本发明的活化剂选择性扩
增例如工程改造或非工程改造的δ2t细胞，而不扩增或不显著扩增δ1t细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ3t细胞，而不扩增或不显著扩增δ2t细胞和/或不扩增或不显著扩增δ1t细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ1和δ3t细胞，而不扩增或不显著扩增δ2t细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ1和δ4t细胞，而不扩增或不显著扩增δ2t细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ1和δ5t细胞，而不扩增或不显著扩增δ2t细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造或非工程改造的δ1、δ3、δ4和δ5t细胞，而不扩增或不显著扩增δ2t细胞。在该语境中，术语“不显著扩增”意指优先扩增的细胞群的扩增为参考细胞群的至少10倍、优选地100倍、以及更优选地1,000倍。
[0055]
如本文所用，术语“掺和物”是指来源于混合异质细胞群的两种或多种分离的富集细胞群的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群是分离的γδt细胞群。根据某些实施方案，本发明的细胞群被离体扩增和/或体外提供并施用给受试者，从而成为体内γδt细胞群。根据某些实施方案，本发明的细胞群通过施用一种或多种选择性扩增γδt细胞群的药剂体内扩增。
[0056]
适用于细胞群的术语“分离的”是指从人体或动物体分离的细胞群，它们基本上不含与所述体内或体外细胞群相关的一种或多种细胞群。
[0057]
如本文所用，在细胞群的语境中的术语“接触”是指使分离的细胞群与可连接至珠粒或细胞的试剂(例如抗体、细胞因子、配体、丝裂原或共刺激分子)一起孵育。抗体或细胞因子可以是可溶性形式，或可以是固定化的。在一个实施方案中，固定化抗体或细胞因子紧密结合或共价连接至珠粒或平板。在一个实施方案中，抗体固定于fc包被的孔上。在期望的实施方案中，接触体内发生。
[0058]
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与其发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。所谓“特异性结合”或“发生免疫反应”或“针对”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，并且不与其它多肽反应或以非常低的亲和力(k
d
>10
‑6摩尔)结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、sdab(重链或轻链单结构域抗体)、单链、f
ab
、f
ab’和f
(ab')2
片段、scfv、双体抗体、微抗体、纳米体和f
ab
表达文库。
[0059]
在扩增或维持受试者中体内γδt细胞群的体内方法的上下文中，“有效量”是指在扩增或维持受试者中体内γδt群中产生可确定的增加的剂量。例如，有效剂量可以将施用的γδt细胞的目标群选择性扩增可检测的量(例如，至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍，或约1％至约10％，或约10％至约2倍)。又如，有效剂量可以将内源性体内γδt细胞的目标群选择性扩增可检测的量(例如，至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍，或约1％至约10％，或约10％至约2倍)。又如，与未施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂的对照受试者相比，有效剂量可以在受试者或受试者的组织(例如，肿瘤组织)中维持更大量的活靶γδt细胞。
[0060]
如本文在治疗有需要的受试者中的癌症、传染病、炎性疾病或自身免疫疾病的体内方法的上下文中使用，术语“有效量”是指含有一种或多种选择性扩增施用给受试者(例如，已经患有疾病、病症或病状的人类患者)的γδt细胞的药剂的组合物的量，该量足以治
愈或至少部分阻止或在一定程度上缓解所治疗的疾病、病症或病状的一种或多种症状。此类组合物的有效性取决于多个条件，包括但不限于疾病、病状或病症的严重性和进程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的响应、以及主治医生的判断。仅举例来说，治疗有效量可以通过常规实验，包括但不限于剂量递增临床试验来确定。
[0061]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(car)”可以指人工t细胞受体、t抗体、单链免疫受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体，例如涵盖将人工特异性移植到特定的免疫效应细胞的工程改造受体。car可用于将单克隆抗体的特异性赋予t细胞，从而允许生成大量特异性t细胞，例如用于过继性细胞疗法。在特定实施方案中，例如car将细胞的特异性引入肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，car包含胞内活化结构域(允许t细胞在靶向部分与靶细胞，诸如靶肿瘤细胞接合时活化)、跨膜结构域和长度可变化的胞外结构域，并且包含疾病或病状相关的例如肿瘤
‑
抗原结合区。在特定方面，car包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(scfv)融合至cd3
‑
ξ跨膜结构域和胞内域的融合物。其它car设计的特异性可以来源于受体(例如，肽)的配体或来源于模式识别受体，诸如dectin。在某些情况下，可以改变抗原识别结构域的间隔以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，car包含另外的共刺激信号传导的结构域，诸如cd3
‑
ξ、fcr、cd27、cd28、cd137、dap 10/12和/或ox40、icos、tlr等。在一些情况下，分子可以与car一起共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因(例如，用于正电子发射计算机断层扫描)、在添加前药、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体时有条件地消融t细胞的基因产物。
[0062]
已知基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kda)和一条“重”链(约50
‑
70kda)。每条链的氨基末端部分包括约100个至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。一般来讲，从人获得的抗体分子涉及任何以下种类：igg、igm、iga、ige和igd，它们彼此不同之处在于分子中存在的重链的性质。某些种类还具有子类，诸如igg1、igg2等等。另外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
[0063]
术语“fab”是指由完整l链(v
l
和c
l
)以及h链的可变区结构域(v
h
)和一条重链的第一恒定结构域(ch1)构成的抗体片段。完整抗体的木瓜蛋白酶消化可用于产生两个fab片段，每个片段含有单个抗原结合位点。通常，木瓜蛋白酶消化产生的fab的l链和h链片段通过链间二硫键连接。
[0064]
术语"fc"是指包含通过二硫键保持在一起的两条h链(ch2和ch3)的羧基末端部分和铰链区的一部分的抗体片段。抗体的效应功能由fc区中的序列确定；该区也是由某些类型细胞上存在的fc受体(fcr)识别的部分。一个fc片段可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化获得。
[0065]
术语“f(ab')
2”是指通过完整抗体的胃蛋白酶消化产生的抗体片段。f(ab')2片段含有通过二硫键保持在一起的两个fab片段和铰链区的一部分f(ab')2片段具有二价抗原结合活性，并且能够交联抗原。
[0066]
术语fab'是指作为f(ab')2片段的还原产物的抗体片段。fab'片段与fab片段的不同之处在于在ch1域的羧基末端具有几个另外的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。fab'
‑
sh是本文对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的fab'的称谓。
[0067]
术语“fv”是指由一个重链可变区和一个轻链可变区结构域紧密、非共价缔合形成的二聚体构成的抗体片段。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(3个环各自来自h链和l链)，这六个高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基，并将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常其亲和力小于整个结合位点。
[0068]
术语“单链fv”也缩写为“sfv”或“scfv”，是指包含连接成单个多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。通常，scfv多肽还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，所述接头使scfv能够形成抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见例如pluckthun,the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,springer
‑
verlag,new york,第269
‑
315页(1994)；以及malmborg等人,j.immunol.methods 183:7
‑
13,1995。
[0069]
表述“线性抗体”用于指包含一对串联v
h
‑
c
h
1区段(v
h
‑
c
h1‑
v
h
‑
c
h
1)的多肽，所述区段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的，并且例如由zapata等人,protein eng.8(10):1057
‑
1062(1995)描述。
[0070]
术语"可变"是指以下事实，可变结构域的某些部分的序列在抗体之间广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不均匀地分布于整个抗体的可变结构域。它集中在位于轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区的区段。可变结构域的更加高度保守的部分称为框架区(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr，主要采用β
‑
折叠构型，所述fr通过三个高变区连接，形成连接β
‑
折叠结构并且在一些情况下形成β
‑
折叠结构的一部分的环。每条链中的高变区通过fr紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区一起，促成抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。
[0071]
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合位点由重(“h”)链和轻(“l”)链的n
‑
末端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的v区内的三条高度差异链称为“高变区”，它们插入称为“框架区”或“fr”的更保守的侧接链之间。因此，术语“fr”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并且与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对布置，形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且每条重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“cdr”。每个结构域的氨基酸分配符合kabat sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health,bethesda,md.(1987年和1991年))或chothia&lesk j.mol.biol.196:901
‑
917(1987),chothia等人.nature 342:878
‑
883(1989)的定义。
[0072]
术语“高变区”、“hvr”或“hv”是指在序列上是高变的和/或形成结构限定的环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个hvr；vh中有三个(h1、h2、h3)，并且vl中有三个(l1、l2、l3)。在天然抗体中，h3和l3显示出这六个hvr最具多样性，并且据信h3特别在赋予抗体精细特异性方面发挥了独特的作用。参见例如xu等人,immunity 13:37
‑
45(2000)；johnson和wu,methods in molecular biology 248:1
‑
25(lo编辑,human press,totowa,
n.j.,2003)。实际上，仅由重链构成的天然存在的骆驼科动物抗体在不存在轻链的情况下具有功能并且是稳定的。参见例如hamers
‑
casterman等人,nature 363:446
‑
448(1993)；sheriff等人,nature struct.biol.3:733
‑
736(1996)。
[0073]“框架区”(fr)是除cdr残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个fr，称为fr1、fr2、fr3和fr4。如果根据kabat定义cdr，轻链fr残基位于约残基1
‑
23(lcfr1)、35
‑
49(lcfr2)、57
‑
88(lcfr3)和98
‑
107(lcfr4)，并且重链fr残基在重链残基中位于约残基1
‑
30(hcfr1)、36
‑
49(hcfr2)、66
‑
94(hcfr3)和103
‑
113(hcfr4)。如果cdr包含来自高变环的氨基酸残基，轻链fr残基在轻链中位于约残基1
‑
25(lcfr1)、33
‑
49(lcfr2)、53
‑
90(lcfr3)和97
‑
107(lcfr4)，并且重链fr残基在重链残基中位于约残基1
‑
25(hcfr1)、33
‑
52(hcfr2)、56
‑
95(hcfr3)和102
‑
113(hcfr4)。在一些情况下，当cdr包含来自kabat定义的cdr和高变环的那些氨基酸时，将相应地调整fr残基。例如，当cdrh1包括氨基酸h26
‑
h35时，重链fr1残基处于位置1
‑
25，fr2残基处于位置36
‑
49。
[0074]“人共有区框架”是在人免疫球蛋白vl或vh框架序列的选择中代表最常见的氨基酸残基的框架。一般来讲，人免疫球蛋白vl或vh序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般来讲，序列的亚组是kabat所述的亚组。在某些情况下，对于vl，亚组是kabat所述的亚组κi。在某些情况下，对于vh，亚组是kabat所述的亚组iii。
[0075]
本文所述的抗体可以是人源化的。非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有来自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或具有所需抗体特异性、亲和力和能力的非人类灵长类动物)的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修改是为了进一步改进抗体性能。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有的fr是人免疫球蛋白序列的那些fr。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。有关更多细节，参见jones等人,nature 321:522
‑
525(1986)；riechmann等人,nature 332:323
‑
329(1988)；以及presta,curr.op.struct.biol.2:593
‑
596(1992)。还可参见其中引用的以下综述文章和参考文献：vaswani和hamilton,ann.allergy,asthma and immunol.,1:105
‑
115(1998)；harris,biochem.soc.transactions,23:1035
‑
1038(1995)；hurle和gross,curr.op.biotech.,5:428
‑
433(1994)。
[0076]“人抗体”是具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已使用如本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的人抗体。人抗体的这一定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中所述的方法：cole等人,monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,p.77(1985)；boerner等人,j.immunol.,147(1):86
‑
95(1991)。还可参见van dijk和van de winkel,curr.opin.pharmacol.,5:368
‑
74(2001)。人抗体可通过向已被修饰以响应抗原性挑战产
生此类抗体但其内源性基因座已被禁用的转基因动物(例如免疫异种小鼠)施用抗原来制备(参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584关于xenomouse
tm
技术)。还可参见例如li等人,proc.natl.acad.sci.usa,103:3557
‑
3562(2006)关于通过人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
[0077]
本文所述的可用于活化例如γδt细胞的抗原结合部分(诸如本文所述的抗体或其抗原结合片段)可以是多价的。例如，f(ab')2片段具有二价抗原结合活性，并且能够交联抗原。类似地，抗原结合部分(诸如igg或其它经典抗体架构)可以具有二价结构。在一些情况下，抗原结合部分大于二价。在一些情况下，抗原结合部分可以是三价部分，诸如三价抗体。在一些情况下，抗原结合部分可以是四价部分，诸如四价抗体，例如iga抗体。在一些情况下，抗原结合部分可以具有10价。例如，抗原结合部分可以是igm抗体。本文所述的优选多价抗原结合部分(例如抗体或其片段)通常在每个抗原结合位点结合相同抗原，并且在一些情况下，结合相同抗原的相同表位。在一些情况下，多价抗原结合部分包含与多价抗原结合部分的另一个抗原结合位点不同的至少一个抗原结合位点。
[0078]
如本文所用，"kd"或"kd值"是指通过使用表面等离子共振测定而测量的解离常数，该分析例如使用biacore.tm.
‑
2000或biacore.tm.
‑
3000(biacore,inc.,piscataway,n.j.)，在25℃下，通过固定有抗原或抗体的cm5芯片以约10个反应单位(ru)进行。对于二价或其它多价抗体，通常抗体是固定化的，以避免解离常数测量伴随的亲和力诱导的干扰。有关更多细节，参见例如chen等人,j.mol.biol.293:865
‑
881(1999)。
[0079]“或更好”在本文中用于指结合亲和力时是指分子与其结合配偶体之间更强的结合。“或更好”在本文中使用时是指由更小的k
d
数值表示的更强的结合。例如，对抗原的亲和力为“0.6nm或更好”的抗体，抗体对抗原的亲和力≤0.6nm，即为0.59nm、0.58nm、0.57nm等，或任何小于或等于0.6nm的值。
[0080]
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体的任何蛋白决定簇、脂质或碳水化合物决定簇。表位决定簇通常由分子(诸如氨基酸、脂质或糖侧链)的活性表面基团构成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当平衡解离常数(k
d
)在10
‑6至10
‑
12
m或更好的范围内时，抗体被称为特异性结合抗原。特异性结合可指与结合其它非靶表位的解离常数相比，以紧密至少10倍、优选100倍或更优选1,000倍的解离常数(较低的k
d
)结合靶表位。在一些情况下，靶表位是δ
‑
3tcr的δ1、δ2或δ3链的表位。在一些情况下，非靶表位是αβtcr。在一些情况下，非靶表位是不同的亚型δ链。结合的特异性可在与γδ
‑
tcr和/或αβ
‑
tcr的胞外区(例如，作为固定在elisa板上或在细胞上表达的fc融合体)结合的情况下确定。
[0081]“活化表位”能够在结合时活化特定γδt细胞群。t细胞增殖表明t细胞活化和扩增。
[0082]
当两种抗体识别相同的或空间上重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否结合相同的或空间上重叠的表位的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，它可以使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同形式配置。在一些实施方案中，将抗原固定在96孔板上，并使用放射性或酶标记测量未标记的抗体阻断标记的抗体的结合的能力。或者，使用标记的和未标记的抗体的竞争研究在表达抗原的细胞上使用流式细胞术进行。
[0083]“表位作图”是鉴定抗体对其靶抗原的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续，但在蛋白质折叠为其三维结构时聚集在一起的氨基酸形成。
[0084]
如本文所定义，“表位鉴定(epitope binning)”是基于抗体识别的表位对其进行分组的过程。更具体地讲，表位鉴定包括用于区分不同抗体的表位识别性质的方法和系统，连同基于抗体的表位识别性质对其进行聚类并鉴定具有不同结合特异性的抗体的计算过程。
[0085]
根据本发明的“药剂”或“化合物”包括小分子、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段。在本发明的语境中，小分子在一个实施方案中意指分子量小于1000道尔顿，特别地小于800道尔顿，更特别地小于500道尔顿的化学品。术语“治疗剂”是指具有生物学活性的药剂。术语“抗癌剂”是指具有对癌细胞的生物学活性的药剂。
[0086]
如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及体外维持的任何其它细胞群，包括干细胞、血液细胞、胚胎脐带血细胞、肿瘤细胞、转导细胞等。
[0087]
术语"治疗(treat)"或"治疗(treatment)"是指治疗性处理和预防性或防治性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病状。有益的或期望的临床结果包括但不限于可检测的或不可检测的症状的减轻、疾病程度的降低(例如，肿瘤大小、肿瘤负荷，或肿瘤分布的减少)、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的推迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(部分或完全)。“治疗”也可意指与未接受治疗的预期存活期相比延长的存活期。需要治疗的人包括已患有病症或病状的人以及容易患上病症或病状的人或其中病症或病状将得到预防的人。
[0088]
与一种或多种另外的治疗剂“组合”施用包括同时(共同)和以任何顺序连续施用。
[0089]
如本文所用，术语“相同的”是指相同的两个或多个序列或子序列。此外，如本文所用，术语"基本上相同的"是指当在比较窗口上，或使用比较算法或通过手动比对和目视检查所测定的指定区域上比较和比对以获得最大对应性时具有相同的序列单元的百分比的两个或多个序列。仅举例来说，如果序列单元在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同的，或约95％相同，则两个或多个序列可以是“基本上相同的”。这种百分比描述两个或多个序列的“同一性百分比”。序列的同一性可以在长度为至少约75
‑
100个序列单元的区域上，在长度为约50个序列单元的区域上，或在未指定的情况下，在整个序列上存在。该定义也涉及测试序列的互补序列。此外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或多个多核苷酸序列是相同的，而如果核酸残基在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，则两个或多个多核苷酸序列是“基本上相同的”。同一性可以存在于长度为至少约75至约100个核酸的区域上，长度为约50个核酸的区域上，或在不指定的情况下，在多核苷酸序列的整个序列上。
[0090]
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物学活性或性质的物质(包括但不限于盐、载剂或稀释剂)，并且是相对无毒的，即该物质可以施用于个体而不导致不期望的生物学效应或以有害的方式与纳入其的组合物的任何组分相互作用。
[0091]
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物
是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、农场动物(诸如奶牛)、运动动物和宠物(诸如猫、狗和马)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
[0092]
术语抗原呈递细胞(apc)是指野生型apc，或工程改造的或人工抗原呈递细胞(aapc)。apc可以以经辐射的apc群体提供。apc可以从永生化细胞系(例如，k562或来源于永生化细胞系的工程改造的aapc)或作为来自供体的细胞(例如，pbmc)的一部分提供。
[0093]
如本文所用，关于蛋白质或其多肽片段或表位的术语“结构上不同的”和“结构上各异的”是指至少两种不同蛋白质、其多肽片段或表位之间的共价(即，结构)差异。例如，两种结构上不同的蛋白质(例如，抗体)可以指具有不同的一级氨基酸序列的两种蛋白质。在一些情况下，结构上不同的活化剂结合结构上不同的表位，诸如具有不同的一级氨基酸序列的表位。
[0094]
如本文所用，与指定的受体活性(例如，nkp30活性、nkp44活性和/或nkp46活性)"无关"的术语"抗肿瘤细胞毒性"是指无论指定的受体或指定的受体组合是否由细胞表达或具有功能性而表现出的抗肿瘤细胞毒性。因此，表现出与nkp30活性、nkp44活性和/或nkp46活性无关的抗肿瘤细胞毒性的γδt细胞也可表现出nkp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性、nkp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性和/或nkp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。
[0095]
如本文所用，术语“nkp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”、“nkp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”和“nkp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”是指需要指定受体的功能性表达的抗肿瘤细胞毒性。这种受体依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在或不存在可通过执行标准体外细胞毒性测定(诸如在pct/us17/32530的实施例48中在存在或不存在指定受体的拮抗剂的情况下执行的)来确定。例如，nkp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在或不存在可通过将在存在抗nkp30拮抗剂的情况下的体外细胞毒性测定的结果与在不存在抗nkp30拮抗剂的情况下获得的结果进行比较来确定。
[0096]
此外，应当理解，可测定γδt细胞或γδt细胞群的一种或多种细胞毒性受体nkp30、nkp44和/或nkp46的mrna表达。在这种情况下，表达测定可指示受体依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在或不存在。例如，可使用确实表现出特定受体依赖性细胞毒性(例如，如通过在存在和不存在拮抗剂的情况下进行的体外细胞毒性测定所证实)的细胞或细胞系将所测量的γδt细胞或γδt细胞群的mrna表达与阳性对照进行比较。
[0097]
如本文所用，包含抗肿瘤细胞毒性的γδt细胞群(其中至少指定“％”的抗肿瘤细胞毒性与指定的受体活性(例如，nkp30活性、nkp44活性和/或nkp46活性)“无关”)是指其中阻断指定受体减少测定的抗肿瘤细胞毒性不超过一定数值％的细胞。因此，与在不存在nkp30拮抗剂的情况下相比，在存在nkp30拮抗剂的情况下包含抗肿瘤细胞毒性的γδt细胞群(其中至少50％的抗肿瘤细胞毒性与nkp30活性无关)将表现出体外抗肿瘤细胞毒性减少50％或更少。
[0098]
概述
[0099]
在人中，γδt细胞是提供先天性和过继性免疫应答之间的联系的t细胞亚群。这些细胞经历v
‑
(d)
‑
j区段重排以生成抗原特异性γδt细胞受体(γδtcr)和γδt细胞，并且可以通过γδtcr或其它单独或共同发挥作用的非tcr蛋白进行的抗原识别来直接活化，以活化γδt细胞效应功能。γδt细胞在哺乳动物中占总t细胞群的一小部分，在外周血和淋巴器官中占t细胞的大约1
‑
5％，并且它们似乎主要存在于富含上皮细胞的区室中，如皮肤、肝、
消化道、呼吸道和生殖道。与αβtcr识别结合主要组织相容性复合物分子(mhc)的抗原不同的是，γδtcr可以直接识别完整蛋白质或非肽化合物形式的细菌抗原、病毒抗原、患病细胞表达的应激抗原和肿瘤抗原。
[0100]
ts
‑
1、ts8.2、b6和15d可以活化γδt细胞。不受理论的束缚，来源于不同供体的培养物的不同水平的活化和扩增可以是由于供体γδ可变tcr库和抗体结合表位的特异性。据发现，并非每种结合特定γδt细胞亚群的药剂都能够活化特定γδt细胞，特别是活化特定γδt细胞群达到临床相关水平，即在富集的培养物中>108个目标γδt细胞。类似地，并非γδt细胞群的每个结合表位都是活化表位，即在结合时能够活化特定γδt细胞群。
[0101]
本发明的发明人已经鉴定了与特异性γδt细胞亚型的有效活化相关的特异性γδ可变tcr结合区，从而能够实现γδt细胞亚型的特异性体内或离体活化和扩增。通过与所鉴定的tcr结合区结合进行的离体活化和扩增可用于产生临床相关水平的纯度增加的高度富集的γδt细胞群及其掺和物，它们可被施用给患者。体内活化可用于扩增和/或维持施用的γδt细胞群(或其一种或多种亚型)，诱导内源性γδt细胞群(或其一种或多种亚型)的扩增，或它们的组合。在一些情况下，体内活化可用于体内扩增内源性γδt细胞群，并且扩增的群的一部分可使用本文所述的方法分离和离体扩增。体内扩增、分离和离体扩增的γδt细胞可以被储存、任选地工程改造和/或施用给有需要的受试者。工程改造可以在离体扩增之前或在离体扩增之后进行。施用的细胞可通过向受试者施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂来体内扩增和/或维持。
[0102]
本文还考虑并进一步描述了特异性结合能够诱导γδt细胞亚型的增强活化和扩增的活化表位的活化配体，包括抗体或其它结合剂。在一些实施方案中，在本文所述的方法和组合物(包括体内扩增γδt细胞和/或施用给有需要的受试者的方法)中使用的活化剂是pct/us2015/061189和/或pct/us17/32530中描述的用于离体扩增的药剂。在一些实施方案中，在本文所述的方法和组合物(包括体内扩增γδt细胞和/或施用给有需要的受试者的方法)中使用的活化剂是pct/us18/061384中描述的用于离体扩增的δ3特异性活化剂。pct/us17/32530和pct/us18/061384以引用方式整体并入用于所有目的，包括与γδt细胞活化剂、γδt细胞组合物以及γδt细胞活化、γδt细胞扩增、治疗、施用和给药有关的所有公开内容。
[0103]
在一些方面，本发明提供了用于扩增工程改造或非工程改造的γδt细胞的离体方法。通常，离体扩增方法与体内扩增和/或维持方法结合用于本文所述的工程改造或非工程改造的γδt细胞的扩增。例如，γδt细胞可通过施用一种或多种选择性扩增γδt细胞或其一种或多种亚群的药剂来体内选择性扩增。可分离选择性体内扩增的γδt细胞的一部分，然后进一步例如选择性离体扩增。在一些情况下，可向有需要的受试者施用离体扩增的γδt细胞(无论先前是否体内扩增)。在一些情况下，向与从中分离初始群的同一受试者施用离体扩增的γδt细胞或其一部分。在一些情况下，向与从中分离初始群的不同受试者施用离体扩增的γδt细胞或其一部分。在一些情况下，施用的离体扩增的γδt细胞通过向受试者施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂在体内进一步扩增或维持。
[0104]
γδt细胞的体内扩增
[0105]
本公开提供了用于体内扩增和/或维持非工程改造或工程改造的γδt细胞群的方法。本公开的非工程改造或工程改造的γδt细胞可以在体内扩增或维持之前和/或之后另
外离体活化和/或扩增。在一些实施方案中，本公开的非工程改造或工程改造的γδt细胞的体内活化、扩增和/或维持可在不施用氨基膦酸盐或异戊二烯基
‑
磷酸盐的情况下进行。在一些实施方案中，本公开的非工程改造或工程改造的γδt细胞的体内活化、扩增和/或维持可至少部分地通过施用氨基膦酸盐或异戊二烯基
‑
磷酸盐进行。例如，体内活化和/或扩增可通过包括施用一种或多种药剂的方法进行，所述一种或多种药剂通过与δ1、δ2或δ3γδt细胞或它们的组合的特异性表位结合来选择性扩增本公开的非工程改造或工程改造的γδt细胞，其中该方法进一步包括施用氨基膦酸盐或异戊二烯基
‑
磷酸盐。
[0106]
通常，该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂。在一些实施方案中，该方法包括提供包含γδt细胞群和一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂的药物组合物，以及向受试者施用所提供的药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用γδt细胞，然后施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂。在一些实施方案中，该方法包括施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂，然后向受试者施用γδt细胞。在某些实施方案中，γδt细胞被施用一次或多次，并且一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂以有效量被定期施用给受试者以扩增或维持所施用的γδt
‑
细胞。
[0107]
在一些情况下，该方法包括多次向受试者施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂，例如至少两次、至少三次或至少四次。在一些情况下，该方法包括向受试者施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂1至2次、1至3次、1至5次、1至10次、2至4次、2至10次或5至10次。在一些情况下，该方法包括以二至四周、二至六周、一个月(例如，约30天)、两个月或一至两个月的剂量期向受试者施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂。在一些情况下，该方法包括定期向受试者施用一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂，持续至少两个月(例如，约60天)、至少三个月(例如，约90天)、至少四个月(例如，约120天)或至少六个月(例如，约180天)。
[0108]
本发明的方法可扩增各种γδt细胞群，诸如体内vγ1
、vγ2
或vγ3
γδt细胞群。在一些情况下，本发明的方法可扩增vδ1
t细胞群；vδ1
和vδ3
t细胞群；vδ1
和vδ4
t细胞群；vδ1
和vδ2
t细胞群；或vδ1
、vδ3
、vδ4
和vδ5
t细胞群。
[0109]
在一些情况下，可将γδt细胞群在少于45天、少于40天、少于35天或少于30天内体内扩增可检测的量(例如，至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍，或约10％至约2倍)。在一些情况下，可将γδt细胞群在少于45天、少于40天、少于35天或少于30天内体内扩增约10％至约10倍、约50％至约10倍或更多。在一些情况下，可将γδt细胞群在少于45天、少于40天、少于35天或少于30天内体内扩增约10至约50倍。
[0110]
在一些方面，提供了用于通过使γδt细胞与活化剂接触来体内选择性扩增各种γδt细胞(包括工程改造和非工程改造的γδt细胞)的方法。在一些情况下，活化或活化剂与γδt细胞的细胞表面受体上的特异性表位结合。活化剂可以是抗体，诸如单克隆抗体。活化剂可特异性活化一种或多种类型的γδt细胞的生长，诸如δ1；δ2；δ3；δ1和δ3；δ1和δ4；δ1和δ5；δ1、δ3和δ4；或δ1、δ3、δ4和δ5细胞群，或它们的组合。在一些实施方案中，活化剂特异性活化δ1细胞群的生长，以体内扩增或维持δ1t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ2细胞群的生长，以体内扩增或维持δ2t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ3细胞群的生长，以体内扩增或维持δ3t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ1和δ3细胞群的生长，以体内扩增或维持δ1和δ3t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ1和δ4细胞群的
生长，以体内扩增或维持δ1和δ3t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ1和δ5细胞群的生长，以体内扩增或维持δ1和δ5t细胞群。
[0111]
在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是多价的，优选地其中多价药剂包含至少两个特异性结合相同抗原的抗原结合位点，或者其中多价药剂包含至少两个特异性结合相同抗原的相同表位的抗原结合位点。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂包含至少三个特异性结合相同抗原的抗原结合位点，或者其中多价药剂包含至少三个特异性结合相同抗原的相同表位的抗原结合位点。在一些情况下，选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞或δ3t细胞或它们的组合的药剂是或至少是二价、三价、四价或五价的。
[0112]
一种或多种活化剂可体内接触γδt细胞(例如，活化剂γδt细胞先天受体)，同时或依次，共刺激分子可接触γδt细胞，以提供进一步的刺激并扩增γδt细胞。在一些实施方案中，活化剂和/或共刺激剂可以是植物和非植物来源的凝集素、活化γδt细胞的单克隆抗体以及其它非凝集素/非抗体药剂。在其它情况下，植物凝集素可以是刀豆蛋白a(cona)，但可以使用诸如其它植物凝集素。凝集素的其它实例包括蛋白质花生凝集素(pna)、大豆凝集素(sba)、小扁豆凝集素(lca)、豌豆凝集素(psa)、罗马蜗牛凝集素(hpa)、禾本蚕豆凝集素(vga)、菜豆红细胞凝集素(pha
‑
e)、菜豆白细胞凝集素(pha
‑
l)、西洋接骨木凝集素(sna、ebl)、朝鲜槐凝集素ii(mal ii)、龙爪槐凝集素(sja)、二花扁豆凝集素(dba)、小扁豆凝集素(lca)、多花紫藤凝集素(wfa、wfl)。
[0113]
活化剂和共刺激分子的非限制性实例包括对本文所述的δ链或γ链或其亚型具有选择性的任何一种或多种抗体，诸如5a6.e9、b1、ts8.2、15d、b6、b3、ts
‑
1、γ3.20、7a5、immu510、r9.12、11f2或它们的组合的抗体。活化剂和共刺激分子的其它实例包括唑来膦酸盐、12
‑
十四烷酰
‑
13
‑
乙酸佛波醇酯(tpa)、密执毒素(mezerein)、葡萄球菌肠毒素a(sea)、链球菌蛋白a或它们的组合。
[0114]
在其它情况下，活化剂和/或共刺激剂可以是αtcr、βtcr、γtcr、δtcr、cd277、cd28、cd46、cd81、ctla4、icos、pd
‑
1、cd30、nkg2d、nkg2a、hvem、4
‑
1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd70、cd80、cd86、dap、cd122、gitr、fcεriγ、cd1、cd16、cd161、dnax、辅助分子
‑
1(dnam
‑
1)、一种或多种ncr(例如，nkp30、nkp44、nkp46)、slam的抗体或配体、柯萨奇(coxsackie)病毒和腺病毒受体或它们的组合。
[0115]
γδt细胞的体内活化、扩增和/或维持可使用本文所述的活化和共刺激剂触发特异性γδt细胞增殖和持久群体来进行。在一个方面，提供特异性γδt细胞活化信号的药剂可以是针对γδtcr的不同单克隆抗体(mab)。
[0116]
在一个方面，mab可与δtcr和/或γtcr的恒定区或可变区上的不同表位结合。在一个方面，mab可包括γδtcr泛mab。在一个方面，γδtcr泛mab可以识别γ链或δ链或它们二者(包括δ1、δ2和δ3t细胞群)上的不同γ和δtcr共有的结构域。在一个方面，抗体可以是5a6.e9(thermo scientific)、b1(biolegend)、immu510和/或11f2(11f2)(beckman coulter)。
[0117]
在一个方面，mab可针对γ链的可变区独有的特异性结构域(7a5 mab，针对vγ9tcr(thermo scientific#tcr1720))，或vδ1可变区上的结构域(mab ts8.2(thermo scientific#tcr1730；mab ts
‑
1(thermofisher#tcr 1055)、mab r9.12(beckman coulter#
im1761))，或vδ2链(mab 15d(thermo scientific#tcr1732或life technologies#tcr2732)b6(biolegend#331402)，图1
‑
2中所述的δ1
‑
#抗体中的一种、图3
‑
4中所述的δ2
‑
#抗体中的一种、或图5中所述的δ3
‑
#抗体中的一种。
[0118]
在某些实施方案中，活化剂是与图1
‑
2中所述的δ1
‑
#抗体中的一种、图3
‑
4中所述的δ2
‑
#抗体中的一种或图5中所述的δ3
‑
#抗体中的一种结合至相同或基本上相同的表位的药剂。在某些实施方案中，活化剂是与图1
‑
2中所述的δ1
‑
#抗体中的一种、图3
‑
4中所述的δ2
‑
#抗体中的一种或图5中所述的δ3
‑
#抗体中的一种竞争的药剂。另外的活化剂在本文中以及2017年5月12日提交的pct/us17/32530和与本技术共同提交的代理人案卷号adc
‑
0003
‑
pr1即美国临时申请号62/586,782中描述。
[0119]
在某些实施方案中，体内活化、扩增和/或维持可通过同时或依次施用细胞因子或其它刺激剂(诸如il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
19、il
‑
21、il23、il
‑
33、ifnγ、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)或粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf))来进一步支持。在一些情况下，细胞因子是il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12或il
‑
21。在一些情况下，细胞因子是il
‑
2。在一些情况下，细胞因子是il
‑
15。在一些情况下，细胞因子是il
‑
4。在一些情况下，细胞因子是选自由il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15和il
‑
21或它们的组合组成的组的常见γ链细胞因子。
[0120]
在某些实施方案中，体内扩增或维持可通过在施用活化剂之前和/或在施用γδt细胞(例如，γδcar
‑
t细胞)之前向受试者施用淋巴细胞清除方案来进一步支持。在一些情况下，淋巴细胞清除方案包括施用氟达拉滨和环磷酰胺。在一些情况下，淋巴细胞清除包括或进一步包括白细胞清除术。在一些情况下，淋巴细胞清除包括或进一步包括苯达莫司汀。在一些情况下，对于在施用car t细胞时是、被诊断为或怀疑为淋巴细胞减少的患者，不施用淋巴细胞清除。
[0121]
γδt细胞的分离
[0122]
在一些实施方案中，本发明提供了用于从分离的混合细胞群产生富集的γδt细胞群的离体方法，该方法包括使混合细胞群与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂通过分别与δ1tcr、δ1和δ4tcr或δ1、δ3、δ4和δ5tcr的特异性表位结合来选择性扩增δ1t细胞、δ1t细胞和δ3t细胞、δ1t细胞和δ4t细胞或δ1、δ3、δ4和δ5t细胞，以提供富集的γδt细胞群。在其它方面，本发明提供了用于从分离的混合细胞群产生富集的γδ2t细胞群的离体方法，该方法包括使混合细胞群与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂通过与δ2tcr的特异性表位结合来选择性扩增δ2t细胞，以提供富集的γδ2t细胞群。在其它方面，本发明提供了用于从分离的混合细胞群产生富集的γδ3t细胞群的离体方法，该方法包括使混合细胞群与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂通过与δ3tcr的特异性表位结合来选择性扩增δ3t细胞，以提供富集的γδ3t细胞群。
[0123]
在其它方面，本公开提供了用于对已经从受试者分离的γδt细胞进行基因工程改造的方法。通过例如阳性和/或阴性选择或基因工程改造进行富集、扩增、纯化的方法可单独或组合以任何顺序进行。在一个实施方案中，可将γδt细胞在受试者中体内扩增、从受试者分离、基因工程改造，然后离体扩增，并且任选地施用给受试者。在另一个实施方案中，可将γδt细胞从受试者分离、基因工程改造、任选地离体活化和扩增、施用给受试者，然后体内扩增或维持。在一些情况下，从中分离γδt细胞的受试者和向其施用γδt细胞的受试者
是同一受试者。在一些情况下，从中分离γδt细胞的受试者和向其施用γδt细胞的受试者是不同受试者。
[0124]
可例如直接从受试者的复合样品扩增工程改造或非工程改造的γδt细胞群。在一些情况下，通过使复合样品与一种或多种选择性扩增靶γδt细胞群的药剂直接接触来分离和离体扩增复合样品。在一些情况下，在进行离体扩增之前分离复合样品，然后通过阳性或阴性选择进行纯化。
[0125]
复合样品可以是外周血样品(例如，pbl或pbmc)、白细胞单采样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检样品、组织、淋巴，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞。在一些情况下，本公开提供了用于选择性扩增vδ1
细胞、vδ2
细胞、vδ3
细胞、vδ1
细胞和vδ3
细胞、vδ1
细胞和vδ4
细胞、vδ1
细胞、vδ3
细胞、vδ4
细胞和vδ5
细胞或它们的任何组合的方法。
[0126]
可例如用包括ficoll
‑
paque
tm
plus(ge healthcare)系统或其它合适的装置/系统的单采血液分离机从受试者收集外周血单核细胞。可用例如流式细胞术技术从收集的样品中纯化γδt细胞或所需的γδt细胞亚群。脐带血细胞也可以在受试者出生时从脐带血获得。参见wo 2016/081518，该专利全文以引用的方式并入本文用于所有目的，包括但不限于用于pbmc分离、γδt细胞活化以及制备和使用γδt细胞活化剂的方法和组合物。
[0127]
例如在第一富集步骤中，γδt细胞可以从体外培养的分离的复合样品或混合细胞群扩增，所述扩增通过使混合细胞群与一种或多种药剂接触来进行，所述一种或多种药剂通过特异性结合至γδtcr的表位来扩增γδt细胞，以提供富集的γδt细胞群。在一些实施方案中，可以活化和扩增包含在整个pbmc群体中的γδt细胞，不需要预先剔除一种或多种特定细胞群(诸如以下非γδt细胞单核细胞中的一种或多种或全部：αβt细胞、b细胞和nk细胞)，以得到富集的γδt细胞群。在一些方面，γδt细胞的活化和扩增在不存在天然或工程改造的apc的情况下进行。在一些方面，可使用固定化γδt细胞丝裂原(包括对γδtcr的活化表位具有特异性的抗体)和其它活化剂(包括结合本文提供的γδtcr的活化表位的凝集素)进行γδt细胞的分离和扩增。
[0128]
在某些实施方案中，通过例如阳性和/或阴性选择任选地纯化分离的混合细胞群，并使其与一种或多种扩增γδt细胞的药剂接触约或至少约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约17天、约19天、约21天、约25天、约29天、约30天或其中的任何范围。例如，使分离的混合细胞群与扩增γδt细胞的一种或多种药剂接触约1至约4天、约2至约4天、约2至约5天、约3至约5天、约5至约21天、约5至约19天、约5至约15天、约5至约10天或约5至约7天，以提供第一富集的γδt细胞群。又如，使分离的混合细胞群与扩增γδt细胞的一种或多种药剂接触约7至约21天、约7至约19天、约7至约23天或约7至约15天，以提供第一富集的γδt细胞群。
[0129]
在一些情况下，纯化或分离步骤在第一扩增步骤和第二扩增步骤之间进行。在一些情况下，分离步骤包括除去一种或多种活化剂。在一些情况下，分离步骤包括特异性分离γδt细胞或其亚型。在一些情况下，在第一扩增步骤和第二扩增步骤之间除去一种或多种(例如，所有)活化剂(例如，不是细胞培养基的常见组分，诸如血清组分和/或il
‑
2的所有活化剂))，但γδt细胞不从其它细胞类型(αβt细胞)特异性分离。
[0130]
在一些实施方案中，在第一富集步骤和任选地第二富集步骤中，在使用结合γδ
tcr的活化表位的活化剂活化和扩增γδt细胞之后，例如在第二、第三、第四、第五等富集步骤中，还可以使用本领域已知的技术富集或纯化本发明的第一富集的γδt细胞群，以获得第二或另外富集的γδt细胞群。例如，可以剔除例如第一富集的γδt细胞群的αβt细胞、b细胞和nk细胞。正向和/或负向选择在收集的γδt细胞上表达的细胞表面标志物可以用于从例如第一富集的γδt细胞群直接分离表达相似的细胞表面标志物的γδt细胞或γδt细胞群。例如，可以根据标志物(诸如cd2、cd3、cd4、cd8、cd24、cd25、cd44、kit、tcrα、tcrβ、tcrγ(包括一种或多种tcrγ亚型)、tcrδ(包括一种或多种tcrδ亚型)、nkg2d、cd70、cd27、cd28、cd30、cd16、ox40、cd46、cd161、ccr7、ccr4、nkp30、nkp44、nkp46、dnam
‑
1、cd242、jaml、以及其它合适的细胞表面标志物)的阳性或阴性表达从富集的γδt细胞群分离γδt细胞(例如，在第一扩增步骤和/或第二扩增步骤之后)。
[0131]
在一些实施方案中，在第一扩增步骤之后(例如，在第一扩增步骤之后进行的分离步骤之后)，在第二扩增步骤中，任选地稀释和培养扩增的细胞。在优选的实施方案中，第二扩增步骤在其中在第二扩增步骤中约每1
‑
2天、1
‑
3天、1
‑
4天、1
‑
5天、2
‑
5天、2
‑
4天或2
‑
3天补充培养基的条件下进行。在一些实施方案中，第二扩增步骤在其中细胞稀释或调整至支持γδt细胞进一步扩增1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次的密度的条件下进行。在一些情况下，细胞密度调整与补充培养基同时进行(即，在同一天，或在相同的时间)。例如，在第二扩增步骤中细胞密度可以每1
‑
2天、1
‑
3天、1
‑
4天、1
‑
5天、2
‑
5天、2
‑
4天或2
‑
3天调整。进一步支持γδt细胞扩增的典型细胞密度包括但不限于约1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106个细胞/ml、10x106个细胞/ml、15x106个细胞/ml、20x106个细胞/ml或30x106个细胞/ml培养物。
[0132]
在一些实施方案中，细胞密度调整至约0.5x106至约1x106个细胞/ml、约0.5x106至约1.5x106个细胞/ml、约0.5x106至约2x106个细胞/ml、约0.75x106至约1x106个细胞/ml、约0.75x106至约1.5x106个细胞/ml、约0.75x106至约2x106个细胞/ml、约1x106至约2x106个细胞/ml，或约1x106至约1.5x106个细胞/ml、约1x106至约2x106个细胞/ml、约1x106至约3x106个细胞/ml、约1x106至约4x106个细胞/ml、约1x106至约5x106个细胞/ml、约1x106至约10x106个细胞/ml、约1x106至约15x106个细胞/ml、约1x106至约20x106个细胞/ml或约1x106至约30x106个细胞/ml的密度。
[0133]
在一些实施方案中，第二扩增步骤在其中监测细胞并维持细胞在预定的细胞密度(或密度区间)和/或维持细胞在具有预定葡萄糖含量的培养基中的条件下进行。例如，细胞可以维持在约0.5x106至约1x106个细胞/ml、约0.5x106至约1.5x106个细胞/ml、约0.5x106至约2x106个细胞/ml、约0.75x106至约1x106个细胞/ml、约0.75x106至约1.5x106个细胞/ml、约0.75x106至约2x106个细胞/ml、约1x106至约2x106个细胞/ml或约1x106至约1.5x106个细胞/ml、约1x106至约3x106个细胞/ml、约1x106至约4x106个细胞/ml、约1x106至约5x106个细胞/ml、约1x106至约10x106个细胞/ml、约1x106至约15x106个细胞/ml、约1x106至约20x106个细胞/ml、约1x106至约30x106个细胞/ml的活细胞密度下。
[0134]
在一些情况下，对于扩增的至少一部分细胞可以维持在高浓度下。例如，对于第一扩增或第二扩增的第一部分，在高细胞浓度下细胞活力可以增加。又如，对于第一扩增或第二扩增的最后部分，可以在高细胞浓度下最有效地利用培养物体积。因此，在一些实施方案中，对于第一扩增培养物或第二扩增培养物的至少一部分或全部第一扩增培养物或第二扩
增培养物，细胞可以维持在约1x106个细胞/ml至约20x106个细胞/ml的活细胞密度下。
[0135]
又如，细胞可以维持在具有约0.5g/l至约1g/l、约0.5g/l至约1.5g/l、约0.5g/l至约2g/l、约0.75g/l至约1g/l、约0.75g/l至约1.5g/l、约0.75g/l至约2g/l、约1g/l至约1.5g/l、约1g/l至约2g/l、1g/l至3g/l或1g/l至4g/l的葡萄糖含量的培养基中。在一些实施方案中，细胞可以维持在具有约1.25g/l的葡萄糖含量的培养基中。在一些情况下，诸如维持高细胞密度培养物时，细胞可以维持在具有约1g/l至约5g/l、约1g/l至约4g/l、约2g/l至约5g/l或约2g/l至约4g/l的葡萄糖含量的培养基中。
[0136]
通常通过将新鲜含血清或无血清培养基加入培养物来维持葡萄糖含量。在一些实施方案中，例如通过监测每个参数和添加新鲜培养基，以维持参数在预定限度内，可以将细胞维持在预定的活细胞密度区间和具有预定的葡萄糖含量区间的培养基中。在一些实施方案中，通过在培养物中添加新鲜含血清或无血清培养基，同时除去灌注生物反应器中废培养基，保留细胞在里面来维持葡萄糖含量。在一些实施方案中，在γδt细胞扩增(例如，选择性γδt细胞扩增)期间或在本文所述的第一γδt细胞扩增或第二γδt细胞扩增(例如，选择性γδt细胞扩增)步骤期间监测和/或维持另外的参数(包括但限于以下一者或多者：ph、o2分压、o2饱和度、co2分压、co2饱和度、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、铵、钠、钾和钙)。
[0137]
可以通过使混合细胞群与一种或多种药剂接触从体外培养的分离的复合样品或混合细胞群选择性扩增γδt细胞亚型，所述一种或多种药剂：
[0138]
i)通过与δ1tcr的表位特异性结合来选择性扩增δ1t细胞，
[0139]
ii)通过与δ2tcr的表位特异性结合来选择性扩增δ2t细胞，
[0140]
iii)通过与δ1和δ4tcr的表位特异性结合来选择性扩增δ1和δ4t细胞；
[0141]
iv)通过与δ1、δ3、δ4和δ5tcr的表位特异性结合来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5t细胞；或者
[0142]
v)通过与δ3tcr的表位特异性结合来选择性扩增δ3t细胞，
[0143]
以例如在第一富集步骤中提供富集的γδt细胞群。
[0144]
在一些情况下，一种或多种药剂特异性结合至δ1j1、δ1j2或δ1j3tcr或它们中的二者或它们的全部。在一些实施方案中，可以活化和扩增整个pbmc群体中的γδ细胞，不需要预先剔除特定细胞群(诸如单核细胞、αβt细胞、b细胞和nk细胞)，得到富集的γδt细胞群。在一些方面，γδt细胞的活化和扩增在不存在天然或工程改造的apc的情况下进行。在一些方面，从肿瘤样本分离和扩增γδt细胞可以使用固定化γδt细胞丝裂原进行，包括对δ1tcr；δ1、δ3、δ4和δ5tcr；δ1和δ4tcr；δ3tcr；或δ2tcr的特异性的活化表位特异性的抗体，以及结合本文提供的δ1tcr；δ1、δ3、δ4和δ5tcr；δ1和δ4tcr；；δ3tcr；或δ2tcr的特异性的活化表位的其它活化剂(包括凝集素)。
[0145]
在某些实施方案中，使分离的混合细胞群与选择性扩增δ1、δ1和δ4、δ2、δ3、δ1和δ2或δ1、δ2和δ3t细胞的一种或多种药剂接触约5天、6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天或其中的任何范围。例如，使分离的混合细胞群与选择性扩增δ1或δ2t细胞的一种或多种药剂接触约1至约3天、约1至约4天、约1至约5天、约2至约3天、约2至约4天、约2至约5天、约3至约4天、约3至约5天、约4至约5天、约5至约15天，或约5至约7天，以提供第一富集的γδt细胞群。在一些实施方案中，选择性扩增的δ1、δ1和δ3、δ1和δ4、δ2、δ3、δ1和δ2或δ1、δ2和δ3t细胞在如本文所述的第二扩增步骤中进一步扩增。
[0146]
在某些实施方案中，起始分离的混合细胞群，例如外周血样品包含在约20
‑
80％范围内的t淋巴细胞。在某些实施方案中，在本发明的富集的γδt细胞群中残留的αβt细胞和nk细胞的百分比分别为约或小于约2.5％和1％。在某些实施方案中，在本发明的富集的γδt细胞群中残留的αβt细胞或nk细胞的百分比为约或小于约1％、0.5％、0.4％、0.2％、0.1％或0.01％。在某些实施方案中，在本发明的富集的γδt细胞群中残留的αβt细胞的百分比为约或小于约0.4％、0.2％、0.1％或0.01％(例如，在正向选择γδt细胞或其亚型的步骤之后或在剔除αβt细胞之后)。在一些实施方案中，在第一γδt细胞扩增和/或第二γδt细胞扩增之前或之后，剔除αβt细胞，但不剔除nk细胞。在某些方面，分离的混合细胞群来源于单个供体。在其它方面，分离的混合细胞群来源于多于一个供体或多个供体(例如，2个、3个、4个、5个，或2
‑
5个、2
‑
10个或5
‑
10个供体，或更多个)。
[0147]
因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以从仅一个供体提供一定临床相关数(>108个、>109个、>10
10
个、>10
11
个或>10
12
个或约108个至约10
12
个)的扩增的γδt细胞。在一些情况下，本发明的方法可以从获得供体样品时的小于19天或21天内提供一定临床相关数(>108个、>109个、>10
10
个、>10
11
个或>10
12
个或约108个至约10
12
个)的扩增的γδt细胞。
[0148]
在第一富集步骤中，使用结合至δ1、δ1和δ3tcr、δ1和δ4tcr或δ2tcr的特异性的活化表位的活化剂特异性活化和扩增特定γδt细胞亚群后，在第二、第三、第四、第五等富集步骤中，还可以使用本领域已知的技术富集或纯化本发明的第一富集的γδt细胞群，以获得第二或另外富集的γδt细胞群。例如，第一富集的γδt细胞群可以剔除αβt细胞、b细胞和nk细胞。正向和/或负向选择在收集的γδt细胞上表达的细胞表面标志物可以用于从第一富集的γδt细胞群直接分离表达相似的细胞表面标志物的γδt细胞或γδt细胞群。例如，可以根据标志物(诸如cd2、cd3、cd4、cd8、cd24、cd25、cd44、kit、tcrα、tcrβ、tcrγ(或其一种或多种亚型)、tcrδ(或其一种或多种亚型)、nkg2d、cd70、cd27、cd28、cd30、cd16、ox40、cd46、cd161、ccr7、ccr4、dnam
‑
1、jaml、以及其它合适的细胞表面标志物)的阳性或阴性表达从第一富集的γδt细胞群分离γδt细胞。
[0149]
在一些实施方案中，在本发明的第一γδt细胞扩增、第一富集步骤、第二γδt细胞扩增和/或第二富集步骤之后，例如在小于10ml、25ml、50ml、100ml、150ml、200ml、500ml、750ml、1l、2l、3l、4l、5l、10l、20l，或25l的培养物体积中，富集的γδt细胞群包含>108个细胞的临床相关水平的γδt细胞亚群。例如，本发明的方法可以在具有10
‑
100ml；25
‑
100ml；50
‑
100ml；75
‑
100ml；10
‑
150ml；25
‑
150ml；50
‑
150ml；75
‑
150ml；100
‑
150ml；10
‑
200ml；25
‑
200ml；50
‑
200ml；75
‑
200ml、100
‑
200ml；10
‑
250ml；25
‑
250ml；50
‑
250ml；75
‑
250ml、100
‑
250ml；150
‑
250ml；5
‑
1,000ml；10
‑
1,000ml或100
‑
1,000ml；150
‑
1,000ml；200
‑
1,000ml；250
‑
1,000ml、400ml至1l、1l至2l、2l至5l、2l至10l、4l至10l、4l至15l、4l至20l或4l至25l的体积的扩增培养物中提供>108个细胞的临床相关水平的γδt细胞亚群。在其它实施方案中，在本发明的第二、第三、第四、第五等富集步骤之后，富集的γδt细胞群包含>108个的临床相关水平的γδt细胞亚群。
[0150]
在一些实施方案中，γδt细胞可以响应于与一种或多种抗原的接触而快速扩增。在组织培养期间，一些γδt细胞，诸如vγ9vδ2
γδt细胞在体外响应于与一些抗原，如焦磷酸异戊二烯酯、烷基胺和代谢物或微生物提取物的接触而快速扩增。此外，一些野生型γδt细胞，诸如vγ2vδ2
γδt细胞在人体中响应于某些类型的接种而在体内快速扩增。受刺激
的γδt细胞可以表现出可促进从复合样品分离γδt细胞的许多抗原呈递、共刺激和粘附分子。复合样品中的γδt细胞可以使用至少一种抗原体外刺激1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、约5
‑
15天、5
‑
10天或5
‑
7天或另外合适的时期，例如在扩增之前或之后，与本文所述的选择性γδt细胞扩增药剂(诸如抗体或固定化抗体)组合。用合适的抗原刺激γδt细胞可通过向受试者施用一种或多种合适的药剂来体内或体外扩增γδt细胞群。
[0151]
可以用于刺激从复合样品体外扩增γδt细胞的抗原的非限制性实例包括焦磷酸异戊二烯酯，诸如焦磷酸异戊烯酯(ipp)、烷基胺、人微生物病原体的代谢物、共生细菌的代谢物、
‑
甲基
‑3‑
丁烯基
‑1‑
焦磷酸(2m3b1pp)、(e)焦磷酸
‑4‑
羟基
‑3‑
甲基
‑
丁
‑2‑
烯酯(hmb
‑
pp)、焦磷酸乙酯(epp)、焦磷酸法尼酯(fpp)、磷酸二甲基烯丙酯(dmap)、焦磷酸二甲基烯丙酯(dmapp)、乙基腺苷三磷酸(epppa)、焦磷酸香叶酯(gpp)、焦磷酸香叶基香叶酯(ggpp)、异戊烯基腺苷三磷酸(ipppa)、磷酸单乙酯(mep)、焦磷酸单乙酯(mepp)、焦磷酸3
‑
甲酰基
‑1‑
丁酯(tubag1)、x
‑
焦磷酸(tubag2)、3
‑
甲酰基
‑1‑
丁基
‑
尿苷三磷酸(tubag3)、3
‑
甲酰基
‑1‑
丁基
‑
脱氧胸苷三磷酸(tubag4)、单乙基烷基胺、焦磷酸烯丙酯、焦磷酸巴豆酯、二甲基烯丙基
‑
γ
‑
尿苷三磷酸、巴豆基
‑
γ
‑
尿苷三磷酸、烯丙基
‑
γ
‑
尿苷三磷酸、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含氮双膦酸盐(例如氨基膦酸盐)。
[0152]
γδt细胞的活化和扩增可使用本文所述的活化和共刺激剂触发特异性γδt细胞增殖和持续群体来进行。在一些实施方案中，从不同的培养物活化和扩增γδt细胞可以实现不同的克隆或混合多克隆群体亚群。在一些实施方案中，不同的激动剂可用于鉴定提供特定γδ活化信号的药剂。在一个方面，提供特定γδ活化信号的药剂可以是针对γδtcr的不同单克隆抗体(mab)。
[0153]
在一个方面，mab可与γtcr和/或δtcr的恒定区或可变区上的不同表位结合。在一个方面，mab可包括γδtcr泛mab。在一个方面，γδtcr泛mab可以识别γ或δ链或它们二者(包括δ3细胞群)上的不同γ和δtcr共有的结构域。在一个方面，抗体可以是5a6.e9(thermo scientific)、b1(biolegend)、immu510和/或11f2(11f2)(beckman coulter)。在一个方面，mab可针对γ链的可变区独有的特异性结构域(7a5 mab，针对如vγ9tcr(thermo scientific#tcr1720))，或vδ1可变区上的结构域(mab ts8.2(thermo scientific#tcr1730；mab ts
‑
1(thermofisher#tcr 1055)、mab r9.12(beckman coulter#im1761))，或vδ2链(mab 15d(thermo scientific#tcr1732或life technologies#tcr2732)b6(biolegend#331402)，图1
‑
2中所述的δ1
‑
#抗体中的一种或多种，图3
‑
4中所述的δ2
‑
#抗体中的一种或多种，或图5中所述的δ3
‑
08、δ3
‑
20、δ3
‑
23、δ3
‑
31、δ3
‑
42、δ3
‑
47和δ3
‑
58中的一种或多种。
[0154]
在一些实施方案中，可组合针对γδtcr的不同结构域的抗体(识别亚群上的特异性可变区表位的泛抗体和抗体)，以评估它们增强γδt细胞的活化的能力。在一些实施方案中，γδt细胞活化剂可包括γδtcr结合剂，诸如mica、nkg2d的激动剂抗体，例如mica、ulbp1或ulbp3的fc标签融合蛋白(r&d systems minneapolis,mn)ulbp2或ulbp6(sino biological beijing,china)。在一些实施方案中，可鉴定伴随共刺激剂，以帮助触发特定γδt细胞增殖，而不诱导细胞反应性失效和细胞凋亡。这些共刺激剂可包括在γδ细胞上表达的受体的配体，诸如以下一者或多者的配体：nkg2d、cd161、cd70、jaml、dnax、cd81辅助分子
‑
1(dnam
‑
1)icos、cd27、cd196、cd137、cd30、hvem、slam、cd122、dap和cd28。在一些方面，
共刺激剂可以是对cd2和cd3分子上的独特表位具有特异性的抗体。当cd2和cd3在αβ或γδt细胞上表达时，它们可具有不同的构象结构，并且在一些情况下，对cd3和cd2具有特异性的抗体可引起γδt细胞的选择性活化。
[0155]
γδt细胞群可以在γδt细胞的工程改造之前离体扩增。可用于促进γδt细胞群的体外扩增的试剂的非限制性实例包括抗cd3或抗cd2、抗cd27、抗cd30、抗cd70、抗ox40抗体、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
19、il
‑
21、il 23、il
‑
33、ifnγ、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)、cd70(cd27配体)、刀豆蛋白a(cona)、商陆(pwm)、蛋白质花生凝集素(pna)、大豆凝集素(sba)、小扁豆(lens culinaris)凝集素(lca)、豌豆(pisum sativum)凝集素(psa)、罗马蜗牛(helix pomatia)凝集素(hpa)、禾本蚕豆(vicia graminea)凝集素(vga)、菜豆(phaseolus vulgaris)红细胞凝集素(pha
‑
e)、菜豆白细胞凝集素(pha
‑
l)、西洋接骨木(sambucus nigra)凝集素(sna、ebl)、朝鲜槐(maackia amurensis)凝集素ii(mal ii)、龙爪槐(sophora japonica)凝集素(sja)、二花扁豆(dolichos biflorus)凝集素(dba)、小扁豆凝集素(lca)、多花紫藤(wisteria floribunda)凝集素(wfa、wfl)或能够刺激t细胞增殖的其它合适的丝裂原。
[0156]
γδt细胞的基因工程改造可包括将表达肿瘤识别部分(诸如αβtcr、γδtcr、编码抗体、其抗原结合片段的car或淋巴细胞活化结构域)的构建体稳定整合进分离的γδt细胞的基因组、细胞因子(例如，il
‑
15、il
‑
12、il
‑
2、il
‑
7、il
‑
21、il
‑
18、il
‑
19、il
‑
33、il
‑
4、il
‑
9、il
‑
23或il1β)，以增强t细胞增殖、存活以及离体和体内功能。在一些情况下，细胞因子是il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12或il
‑
21。在一些情况下，细胞因子是il
‑
2。在一些情况下，细胞因子是il
‑
15。在一些情况下，细胞因子是il
‑
4。在一些情况下，细胞因子是选自由il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15和il
‑
21或它们的组合组成的组的常见γ链细胞因子。分离的γδt细胞的基因工程改造也可以包括使基因表达从分离的γδt细胞的基因组中的一个或多个内源性基因(诸如mhc基因座(基因座位))缺乏或破坏。
[0157]
γδt细胞的离体扩增
[0158]
在其它方面，本公开提供了用于离体扩增用于过继性转移疗法的非工程改造和工程改造的γδt细胞群的方法。可以离体扩增本公开的非工程改造或工程改造的γδt细胞。离体扩增可在体内扩增、分离和任选的纯化之后进行。离体扩增可另外或另选地在体内扩增之前进行，以提供γδt细胞群，然后将其施用给受试者并进行本文所述的一种或多种体内扩增或维持方法。离体扩增可用混合细胞群通过例如使含有γδt细胞的分离样品与一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂直接接触来进行。另外或另选地，离体扩增可在对γδt细胞或其一种或多种亚型进行阳性选择和/或进行阴性选择以除去αβt细胞、b细胞或nk细胞中的一种或多种之后进行。
[0159]
本公开的非工程改造的或工程改造的γδt细胞可以体外扩增，而不通过apc活化，或不与apc和/或氨基膦酸盐共培养。另外或可替代地，本公开的非工程改造的或工程改造的γδt细胞可以通过至少一个扩增步骤体外扩增，所述扩增步骤包括通过与apc和/或与一种或多种氨基膦酸盐一起共培养来活化。
[0160]
在一些实施方案中，本公开的非工程改造的或工程改造的γδt细胞可以在第一γδt细胞扩增中不通过apc活化来体外扩增，然后在第二γδt细胞扩增中通过apc活化来体外扩增。在一些情况下，第一γδt细胞扩增包括使γδt细胞与一种或多种药剂接触，所述一种
或多种药剂(a)扩增γδt细胞，或(b)通过分别与δ1tcr、δ2tcr、δ1和δ4tcr或δ1、δ3、δ4和δ5tcr的特异性活化表位结合来选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞、δ1t细胞和δ3t细胞、δ1t细胞和δ4t细胞或δ1、δ3、δ4和δ5t细胞。
[0161]
在一些情况下，第二γδt细胞扩增在不含第一γδt细胞扩增所用的一种或多种药剂的培养基中进行。在一些情况下，第二γδt细胞扩增在含有一种或多种第二药剂的培养基中进行，所述一种或多种第二药剂(a)扩增t细胞，(b)扩增γδt细胞，或(c)通过分别与δ1tcr、δ2tcr、δ1和δ4tcr或δ1、δ3、δ4和δ5tcr的特异性活化表位结合来选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞、δ1t细胞和δ3t细胞、δ1t细胞和δ4t细胞或δ1、δ3、δ4和δ5t细胞。
[0162]
在一些情况下，第二药剂与用于第一γδt细胞扩增的药剂不同(例如，具有不同的一级氨基酸序列和/或结合结构上不同的γδtcr表位)。在一些情况下，第二药剂结合重叠的γδtcr表位、相同的γδtcr表位，或可以与用于第一γδt细胞扩增的药剂竞争与γδtcr的结合。在一些情况下，第二药剂在apc的细胞表面上表达。在一些情况下，第二药剂例如通过第二药剂的恒定区和apc的表面上的fc受体之间的结合相互作用结合至apc的表面。在一些情况下，第二药剂是可溶性的。在一些情况下，第二γδt细胞扩增在含有可溶性第二药剂和apc的培养基中进行，任选地其中apc在其细胞表面上表达扩增或选择性扩增γδt细胞群的药剂或结合至其细胞表面。
[0163]
在一些情况下，第一γδt细胞扩增在不存在apc的情况下进行，第二γδt细胞扩增在存在apc的情况下进行。在一些情况下，第二γδt细胞扩增使用apc和一种或多种第二药剂进行，所述一种或多种第二药剂(a)扩增t细胞，(b)扩增γδt细胞，或(c)通过分别与δ1tcr、δ2tcr、δ1和δ4tcr或或δ1、δ3、δ4和δ5tcr的特异性活化表位结合来选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞、δ1t细胞和δ3t细胞、δ1t细胞和δ4t细胞或δ1、δ3、δ4和δ5t细胞。
[0164]
本领域的技术人员将理解，在某些实施方案中，本文所述的第二扩增步骤的方法可以如第一扩增步骤所述进行，并且本文所述的第一步骤的方法可以如第二扩增步骤所述进行。例如，但不限于，在一些实施方案中，混合的细胞群(例如pbmc)可在第一步骤中通过与apc接触来扩增，然后在不存在apc的情况下例如通过使来自第一扩增步骤的扩增群与固定化药剂接触来扩增，所述固定化药剂通过分别与δ1tcr、δ2tcr、δ1和δ4tcr或δ1、δ3、δ4和δ5tcr的特异性活化表位结合来选择性扩增δ1t细胞、δ2t细胞、δ1t细胞和δ3t细胞、δ1t细胞和δ4t细胞或δ1、δ3、δ4和δ5t细胞。
[0165]
本发明的方法可扩增各种γδt细胞群，诸如vγ1
、vγ2
或vγ3
γδt细胞群。在一些情况下，本发明的方法可扩增vδ1
t细胞群；vδ1
和vδ3
t细胞群；vδ1
和vδ4
t细胞群；vδ1
和vδ2
t细胞群；或vδ1
、vδ3
、vδ4
和vδ5
t细胞群。
[0166]
在一些情况下，γδt细胞群可以在少于36天、少于35天、少于34天、少于33天、少于32天、少于31天、少于30天、少于29天、少于28天、少于27天、少于26天、少于25天、少于24天、少于23天、少于22天、少于21天、少于20天、少于19天、少于18天、少于17天、少于16天、少于15天、少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天或少于3天内体外扩增。
[0167]
在一些方面，提供了用于通过使来自混合细胞群的γδt细胞与活化剂接触来选择性扩增各种γδt细胞(包括工程改造的和非工程改造的γδt细胞)的方法。在一些情况下，活化或活化剂与γδt细胞的细胞表面受体上的特异性表位结合。活化剂可以是抗体，诸如
单克隆抗体。活化剂可特异性活化一种或多种类型的γδt细胞(诸如δ1、δ2,、δ1和δ3,或δ1和δ4细胞群)的生长。在一些实施方案中，活化剂特异性活化δ1细胞群的生长，以提供富集的δ1t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ2细胞群的生长，以提供富集的δ2t细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ3细胞群的生长，以提供富集的δ3t细胞群。
[0168]
活化剂可以刺激工程改造的和非工程改造的γδt细胞以快速生长速率扩增。例如，药剂刺激以在小于30小时内1次细胞分裂、在小于29小时内1次细胞分裂、在小于28小时内1次细胞分裂、在小于27小时内1次细胞分裂、在小于26小时内1次细胞分裂、在小于25小时内1次细胞分裂、在小于24小时内1次细胞分裂、在小于23小时内1次细胞分裂、在小于22小时内1次细胞分裂、在小于21小时内1次细胞分裂、在小于20小时内1次细胞分裂、在小于19小时内1次细胞分裂、在小于18小时内1次细胞分裂、在小于17小时内1次细胞分裂、在小于16小时内1次细胞分裂、在小于15小时内1次细胞分裂、在小于14小时内1次细胞分裂、在小于13小时内1次细胞分裂、在小于12小时内1次细胞分裂、在小于11小时内1次细胞分裂、在小于10小时内1次细胞分裂、在小于9小时内1次细胞分裂、在小于8小时内1次细胞分裂、在小于7小时内1次细胞分裂、在小于6小时内1次细胞分裂、在小于5小时内1次细胞分裂、在小于4小时内1次细胞分裂、在小于3小时内1次细胞分裂、在小于2小时内1次细胞分裂的平均速率扩增γδt细胞群。
[0169]
在一些情况下，活化剂可以刺激工程改造的和非工程改造的γδt细胞以每约4小时约1次分裂的平均速率、每约5小时约1次分裂的平均速率、每约6小时约1次分裂的平均速率、每约7小时约1次分裂的平均速率、每约8小时约1次分裂的平均速率、每约9小时约1次分裂的平均速率、每约10小时约1次分裂的平均速率、每约11小时约1次分裂的平均速率、每约12小时约1次分裂的平均速率、每约13小时约1次分裂的平均速率、每约14小时约1次分裂的平均速率、每约15小时约1次分裂的平均速率、每约16小时约1次分裂的平均速率、每约17小时约1次分裂的平均速率、每约18小时约1次分裂的平均速率、每约19小时约1次分裂的平均速率、每约20小时约1次分裂的平均速率、每约21小时约1次分裂的平均速率、每约22小时约1次分裂的速率、每约23小时约1次分裂的速率、每约24小时约1次分裂的平均速率、每约25小时约1次分裂的平均速率、每约26小时约1次分裂的平均速率、每约27小时约1次分裂的平均速率、每约28小时约1次分裂的速率、每约29小时约1次分裂的速率、每约30小时约1次分裂的平均速率、每约31小时约1次分裂的平均速率、每约32小时约1次分裂的平均速率、每约33小时约1次分裂的平均速率、每约34小时约1次分裂的速率、每约35小时约1次分裂的速率、每约36小时约1次分裂的平均速率扩增。
[0170]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的快速扩增，其中所述快速扩增以前述细胞分裂的平均速率中的任一者进行，并且维持在约连续1天和约连续19天之间、在约连续1天和约连续14天之间、在约连续1天和约连续7天之间、在约连续1天和约连续5天之间、在约连续2天和约连续19天之间、在约连续2天和约连续14天之间、在约连续2天和约连续7天之间、在约连续2天和约连续5天之间、在约连续4天和约连续19天之间、在约连续4天和约连续14天之间、在约连续4天和约连续7天之间或在约连续4天和约连续5天之间。
[0171]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的扩增，所述γδt细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10
‑
12小时)
约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10
‑
13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10
‑
14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10
‑
15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10
‑
16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10
‑
17小时或12
‑
17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10
‑
18小时或12
‑
18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10
‑
19小时或12
‑
19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12
‑
20小时、16
‑
20小时或18
‑
20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12
‑
21小时、16
‑
21小时或18
‑
21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12
‑
22小时、16
‑
22小时或18
‑
22小时)约1次分裂的速率、每约23小时或更少(例如，12
‑
23小时、16
‑
23小时或18
‑
23小时)约1次分裂的速率、每约24小时(例如，12
‑
24小时、16
‑
24小时或18
‑
24小时)约1次分裂的平均速率维持约连续2天和约7天之间，或约连续2天和约5天之间。
[0172]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的扩增，所述γδt细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12
‑
25小时、16
‑
25小时、18
‑
25小时或20
‑
25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12
‑
26小时、16
‑
26小时、18
‑
26小时或20
‑
26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12
‑
27小时、16
‑
27小时、18
‑
27小时或20
‑
27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12
‑
28小时、16
‑
28小时、18
‑
28小时、20
‑
28小时或22
‑
28小时)约1次分裂的速率、每约29小时(例如，16
‑
29小时、18
‑
29小时、20
‑
29小时或22
‑
29小时)约1次分裂的速率、每约30小时(例如，16
‑
30小时、18
‑
30小时、20
‑
30小时或22
‑
30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16
‑
31小时、18
‑
31小时、20
‑
31小时、22
‑
31小时或24
‑
31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18
‑
32小时、20
‑
32小时、22
‑
32小时或24
‑
32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18
‑
33小时、20
‑
33小时、22
‑
33小时或24
‑
33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18
‑
34小时、20
‑
34小时、22
‑
34小时或24
‑
34小时)约1次分裂的速率、每约35小时(例如，18
‑
35小时、20
‑
35小时、22
‑
35小时或24
‑
35小时)约1次分裂的速率、每约36小时(例如，18
‑
36小时、20
‑
36小时、22
‑
36小时或24
‑
36小时)约1次分裂的平均速率维持约连续2天和约7天之间或约连续2天和约5天之间。
[0173]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的扩增，所述γδt细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10
‑
12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10
‑
13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10
‑
14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10
‑
15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10
‑
16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10
‑
17小时或12
‑
17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10
‑
18小时或12
‑
18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10
‑
19小时或12
‑
19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12
‑
20小时、16
‑
20小时或18
‑
20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12
‑
21小时、16
‑
21小时或18
‑
21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12
‑
22小时、16
‑
22小时或18
‑
22小时)约1次分裂的速率、每约23小时或更少(例如，12
‑
23小时、16
‑
23小时或18
‑
23小时)约1次分裂的速率、每约24小时(例如，12
‑
24小时、16
‑
24小时或18
‑
24小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续14天。
[0174]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的扩增，所述γδt细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12
‑
25小时、
16
‑
25小时、18
‑
25小时或20
‑
25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12
‑
26小时、16
‑
26小时、18
‑
26小时或20
‑
26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12
‑
27小时、16
‑
27小时、18
‑
27小时或20
‑
27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12
‑
28小时、16
‑
28小时、18
‑
28小时、20
‑
28小时或22
‑
28小时)约1次分裂的速率、每约29小时(例如，16
‑
29小时、18
‑
29小时、20
‑
29小时或22
‑
29小时)约1次分裂的速率、每约30小时(例如，16
‑
30小时、18
‑
30小时、20
‑
30小时或22
‑
30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16
‑
31小时、18
‑
31小时、20
‑
31小时、22
‑
31小时或24
‑
31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18
‑
32小时、20
‑
32小时、22
‑
32小时或24
‑
32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18
‑
33小时、20
‑
33小时、22
‑
33小时或24
‑
33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18
‑
34小时、20
‑
34小时、22
‑
34小时或24
‑
34小时)约1次分裂的速率、每约35小时(例如，18
‑
35小时、20
‑
35小时、22
‑
35小时或24
‑
35小时)约1次分裂的速率、每约36小时(例如，18
‑
36小时、20
‑
36小时、22
‑
36小时或24
‑
36小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续14天。
[0175]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的扩增，所述γδt细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10
‑
12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10
‑
13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10
‑
14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10
‑
15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10
‑
16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10
‑
17小时或12
‑
17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10
‑
18小时或12
‑
18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10
‑
19小时或12
‑
19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12
‑
20小时、16
‑
20小时或18
‑
20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12
‑
21小时、16
‑
21小时或18
‑
21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12
‑
22小时、16
‑
22小时或18
‑
22小时)约1次分裂的速率、每约23小时或更少(例如，12
‑
23小时、16
‑
23小时或18
‑
23小时)约1次分裂的速率、每约24小时(例如，12
‑
24小时、16
‑
24小时或18
‑
24小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续19天。
[0176]
在一些情况下，活化剂可以刺激γδt细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδt细胞的扩增，所述γδt细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12
‑
25小时、16
‑
25小时、18
‑
25小时或20
‑
25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12
‑
26小时、16
‑
26小时、18
‑
26小时或20
‑
26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12
‑
27小时、16
‑
27小时、18
‑
27小时或20
‑
27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12
‑
28小时、16
‑
28小时、18
‑
28小时、20
‑
28小时或22
‑
28小时)约1次分裂的速率、每约29小时(例如，16
‑
29小时、18
‑
29小时、20
‑
29小时或22
‑
29小时)约1次分裂的速率、每约30小时(例如，16
‑
30小时、18
‑
30小时、20
‑
30小时或22
‑
30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16
‑
31小时、18
‑
31小时、20
‑
31小时、22
‑
31小时或24
‑
31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18
‑
32小时、20
‑
32小时、22
‑
32小时或24
‑
32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18
‑
33小时、20
‑
33小时、22
‑
33小时或24
‑
33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18
‑
34小时、20
‑
34小时、22
‑
34小时或24
‑
34小时)约1次分裂的速率、每约35小时(例如，18
‑
35小时、20
‑
35小时、22
‑
35小时或24
‑
35小时)约1次分裂的速率、每约36小时(例如，18
‑
36小时、20
‑
36小时、22
‑
36小时或24
‑
36小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续19天。
[0177]
活化剂可以刺激工程改造的或非工程改造的γδt细胞的子群以不同的生长速率
扩增。例如，药剂可以刺激δ1细胞群以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比另一个γδt细胞群，诸如δ2或δ3群体；比扩增前γδt细胞的起始数量；比扩增前γδ1t细胞的起始数量；或比培养物中的αβt细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
[0178]
在其它情况下，药剂可以刺激δ1和δ4群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ2t细胞群；比另一个γδt细胞子群；比扩增前γδt细胞的起始数量；比扩增前γδ1t细胞的起始数量；比扩增前γδ1和γδ3t细胞的起始数量；或比培养物中的αβt细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
[0179]
在其它情况下，药剂可以刺激δ1和δ4群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ2t细胞群；比另一个γδt细胞子群；比扩增前γδt细胞的起始数量；比扩增前γδ1t细胞的起始数量；比扩增前γδ1和γδ4t细胞的起始数量；或比培养物中的αβt细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
[0180]
在其它情况下，药剂可以刺激δ1、δ3、δ4和δ5群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ2t细胞群；比另一个γδt细胞子群；比扩增前γδt细胞的起始数量；比扩增前γδ1t细胞的起始数量；比扩增前γδ1和γδ3t细胞的起始数量；比扩增前γδ1、γδ3、γδ4和γδ5t细胞的起始数量；或比培养物中的αβt细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
[0181]
在其它情况下，药剂可以刺激δ2群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ1t细胞群；比δ3t细胞群；比另一个γδt细胞子群；比扩增前γδt细胞的起始数量，比扩增前γδ2t细胞的起始数量，或比αβt细胞大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
[0182]
在一些方面，本公开提供与药剂接触的工程改造的或非工程改造的γδt细胞群，所述药剂刺激γδt细胞群快速，诸如以每30小时约1次细胞分裂或更快的速率扩增。在一些情况下，药剂选择性刺激δ1；δ2；δ1和δ4；或δ1、δ3、δ4和δ5t细胞的增殖。γδt细胞群可包含一定量的非工程改造的γδt细胞和一定量的工程改造的γδt细胞。在一些情况下，γδt细胞群包含不同百分比的δ1、δ2、δ3和δ4t细胞。工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含例如小于90％的δ1t细胞、小于80％的δ1t细胞、小于70％的δ1t细胞、小于60％的δ1t细胞、小于50％的δ1t细胞、小于40％的δ1t细胞、小于30％的δ1t细胞、小于20％的δ1t细胞、小于10％的δ1t细胞或小于5％的δ1t细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含大于5％的δ1t细胞、大于10％的δ1t细胞、大于20％的δ1t细胞、大于30％的δ1t细胞、大于40％的δ1t细胞、大于50％的δ1t细胞、大于60％的δ1t细胞、大于70％的δ1t细胞、大于80％
的δ1t细胞或大于90％的δ1t细胞。在一些情况下，药剂是本文所述的选择性扩增剂中的一者。在一些情况下，药剂固定在表面，诸如细胞培养物表面，或apc的表面上(例如，在apc的表面上表达或结合至在apc的表面上表达的fc受体)。
[0183]
工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含例如小于90％的δ2t细胞、小于80％的δ2t细胞、小于70％的δ2t细胞、小于60％的δ2t细胞、小于50％的δ2t细胞、小于40％的δ2t细胞、小于30％的δ2t细胞、小于20％的δ2t细胞、小于10％的δ2t细胞或小于5％的δ2t细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含大于5％的δ2t细胞、大于10％的δ2t细胞、大于20％的δ2t细胞、大于30％的δ2t细胞、大于40％的δ2t细胞、大于50％的δ2t细胞、大于60％的δ2t细胞、大于70％的δ2t细胞、大于80％的δ2t细胞或大于90％的δ2t细胞。
[0184]
工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含例如小于90％的δ1和δ4t细胞、小于80％的δ1和δ4t细胞、小于70％的δ1和δ4t细胞、小于60％的δ1和δ4t细胞、小于50％的δ1和δ4t细胞、小于40％的δ1和δ4t细胞、小于30％的δ1和δ4t细胞、小于20％的δ1和δ4t细胞、小于10％的δ1和δ4t细胞或小于5％的δ1和δ4t细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含大于5％的δ1和δ4t细胞、大于10％的δ1和δ4t细胞、大于20％的δ1和δ4t细胞、大于30％的δ1和δ4t细胞、大于40％的δ1和δ4t细胞、大于50％的δ1和δ4t细胞、大于60％的δ1和δ4t细胞、大于70％的δ1和δ4t细胞、大于80％的δ1和δ4t细胞或大于90％的δ1和δ4t细胞。
[0185]
工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含例如小于90％的δ4t细胞、小于80％的δ4t细胞、小于70％的δ4t细胞、小于60％的δ4t细胞、小于50％的δ4t细胞、小于40％的δ4t细胞、小于30％的δ4t细胞、小于20％的δ4t细胞、小于10％的δ4t细胞或小于5％的δ4t细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含大于5％的δ1和δ4t细胞、大于10％的δ1和δ4t细胞、大于20％的δ1和δ4t细胞、大于30％的δ1和δ4t细胞、大于40％的δ1和δ4t细胞、大于50％的δ1和δ4t细胞、大于60％的δ1和δ4t细胞、大于70％的δ1和δ4t细胞、大于80％的δ1和δ4t细胞或大于90％的δ1和δ4t细胞。工程改造的或非工程改造的γδt细胞群可包含例如小于90％的δ1和δ4t细胞、小于80％的δ1和δ4t细胞、小于70％的δ1和δ4t细胞、小于60％的δ1和δ4t细胞、小于50％的δ1和δ4t细胞、小于40％的δ1和δ4t细胞、小于30％的δ1和δ4t细胞、小于20％的δ1和δ4t细胞、小于10％的δ1和δ4t细胞或小于5％的δ1和δ4t细胞。
[0186]
在某些实施方案中，本发明提供包含10
‑
90％的δ1t细胞和90
‑
10％的δ2t细胞的扩增的γδt细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供包含10
‑
90％的δ1和δ3t细胞以及90
‑
10％的δ2t细胞的扩增的γδt细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供包含10
‑
90％的δ1和δ4t细胞以及90
‑
10％的δ2t细胞的扩增的γδt细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供包含10
‑
90％的δ1、δ3、δ4和δ5t细胞以及90
‑
10％的δ2t细胞的扩增的γδt细胞群的掺和物。
[0187]
一种或多种活化剂可接触γδt细胞(例如活化剂γδt细胞先天受体)，其后共刺激分子可接触γδt细胞，以便提供另外的刺激和扩增γδt细胞。在一些实施方案中，活化剂和/或共刺激剂可以是植物和非植物来源的凝集素、活化γδt细胞的单克隆抗体以及其它非凝集素/非抗体药剂。在其它情况下，植物凝集素可以是刀豆蛋白a(cona)，但可以使用诸如其它植物凝集素。凝集素的其它实例包括蛋白质花生凝集素(pna)、大豆凝集素(sba)、小扁豆凝集素(lca)、豌豆凝集素(psa)、罗马蜗牛凝集素(hpa)、禾本蚕豆凝集素(vga)、菜豆
红细胞凝集素(pha
‑
e)、菜豆白细胞凝集素(pha
‑
l)、西洋接骨木凝集素(sna、ebl)、朝鲜槐凝集素ii(mal ii)、龙爪槐凝集素(sja)、二花扁豆凝集素(dba)、小扁豆凝集素(lca)、多花紫藤凝集素(wfa、wfl)。
[0188]
活化剂和共刺激分子的非限制性实例包括对本文所述的δ链或γ链或其亚型具有选择性的任何一种或多种抗体，诸如5a6.e9、b1、ts8.2、15d、b6、b3、ts
‑
1、γ3.20、7a5、immu510、r9.12、11f2或它们的组合的抗体。活化剂和共刺激分子的其它实例包括唑来膦酸盐、12
‑
十四烷酰
‑
13
‑
乙酸佛波醇酯(tpa)、密执毒素(mezerein)、葡萄球菌肠毒素a(sea)、链球菌蛋白a或它们的组合。
[0189]
在其它情况下，活化剂和/或共刺激剂可以是αtcr、βtcr、γtcr、δtcr、cd277、cd28、cd46、cd81、ctla4、icos、pd
‑
1、cd30、nkg2d、nkg2a、hvem、4
‑
1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd70、cd80、cd86、dap、cd122、gitr、fcεriγ、cd1、cd16、cd161、dnax、辅助分子
‑
1(dnam
‑
1)、一种或多种ncr(例如，nkp30、nkp44、nkp46)、slam的抗体或配体、柯萨奇(coxsackie)病毒和腺病毒受体或它们的组合。
[0190]
工程改造的γδt细胞
[0191]
可以用本领域已知的各种方法产生工程改造的γδt细胞。工程改造的γδt细胞可以设计为稳定表达特定肿瘤识别部分。编码包含肿瘤识别部分或另一种类型的识别部分的表达盒的多核苷酸可以通过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统(诸如慢病毒或逆转录病毒系统)，或其它合适的方法(诸如转染、电穿孔、转导、脂质转染、磷酸钙(capo4))、纳米工程改造物质(诸如有机改性的二氧化硅(ormosil))、病毒递送方法(包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒)或其它合适的方法稳定地引入γδt细胞。可以通过将包含抗原特异性tcr的遗传密码的多核苷酸稳定插入γδt细胞的基因组来将αβ或γδ抗原特异性tcr引入工程改造的γδt细胞。可以通过将多核苷酸稳定插入γδt细胞的基因组来将编码具有肿瘤识别部分的car的多核苷酸引入工程改造的γδt细胞。在一些情况下，工程改造的肿瘤识别部分是工程改造的t细胞受体，并且整合进工程改造的γδt细胞的基因组的表达盒包含编码工程改造的tcrα(tcr alpha)基因、工程改造的tcrβ(tcr beta)基因、tcrδ(tcr delta)基因，或工程改造的tcrγ(tcr gamma)基因的多核苷酸。在一些情况下，整合进工程改造的γδt细胞的基因组的表达盒包含编码抗体片段或其抗原结合部分的多核苷酸。在一些情况下，抗体片段或其抗原结合片段是编码完全抗体、抗体片段、单链可变片段(scfv)、单结构域抗体(sdab)、fab、f(ab)2、fc、抗体上的轻链或重链、抗体的可变区或恒定区或它们的任何组合的多核苷酸，它们作为嵌合抗原受体(car)构建体，或包含car和t细胞受体(tcr)或抗体涉及不同抗原的car的双特异性构建体的一部分结合至细胞表面肿瘤抗原。在一些情况下，多核苷酸来源于人或来源于另外的物种。可以修饰来源于非人物种的抗体片段或抗原结合片段多核苷酸，以提高其与人体中天然产生的抗体变体的相似性，并且抗体片段或抗原结合片段可以是部分或完全人源化的。抗体片段或抗原结合片段多核苷酸也可以是嵌合的，例如小鼠
‑
人抗体嵌合体。表达car的工程改造的γδt细胞也可以被工程改造为表达由肿瘤识别部分识别的抗原的配体。
[0192]
本领域已知的各种技术可用于将包含肿瘤识别部分的遗传密码的克隆的或合成工程改造的核酸引入工程改造的γδt细胞的基因组内的特定位置。分别如wo201409370、wo2003087341、wo2014134412和wo2011090804(这些专利中的每个以引用的方式整体并入
本文)所述的来自微生物成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)系统的rna引导的cas9核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录活化因子样效应核酸酶(talen)和大范围核酸酶技术可用于在γδt细胞中提供有效的基因组工程改造。本文所述的技术也可用于将表达盒插入同时提供敲除一个基因并敲入另一个基因的基因组位置。例如，包含本公开的表达盒的多核苷酸可以插入编码mhc基因的基因组区域。这种工程改造可以同时提供一个或多个基因(例如表达盒中包含的基因)的敲入和另一个基因(例如mhc基因座)的敲除。
[0193]
在一种情况下，将包含编码肿瘤识别部分的核酸的睡美人(sleeping beauty)转座子引入细胞，即工程改造的γδt细胞。与野生型睡美人转座酶相比提供增强整合的突变型睡美人转座酶，诸如us 7,985,739描述的转座酶，可用于将多核苷酸引入工程改造的γδt细胞，该专利以引用的方式整体并入本文。
[0194]
在一些情况下，使用病毒方法将包含肿瘤识别部分的多核苷酸引入工程改造的γδt细胞的基因组。许多病毒方法已用于人基因疗法，诸如wo 1993020221中描述的方法，该专利整体并入本文。可用于工程改造γδt细胞的病毒方法的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒或腺病毒相关的病毒方法。
[0195]
含有肿瘤识别部分的遗传密码的多核苷酸可包含影响工程改造的γδt细胞的生长、增殖、活化状态的突变或其它转基因，或对肿瘤细胞具有特异性的抗原(诸如睾丸特异性癌症抗原)。本公开的γδt细胞可以被工程改造为表达包含连接至抗原识别部分(诸如tcr
‑
cd3复合物中的分子或共刺激因子)的活化结构域的多核苷酸。工程改造的γδt细胞可表达作为t淋巴细胞活化结构域的胞内信号传导结构域。γδt细胞可以被工程改造为表达胞内活化结构域基因或胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域基因可以是例如cd3ζ、cd28、cd2、icos、jaml、cd27、cd30、ox40、nkg2d、cd4、ox40/cd134、4
‑
1bb/cd137、fcεriγ、il
‑
2rb/cd 122、il
‑
2rg/cd132、dap分子、cd70、细胞因子受体、cd40或它们的任何组合。在一些情况下，工程改造的γδt细胞也被工程改造为表达细胞因子、抗原、细胞受体或其它免疫调节分子。
[0196]
可根据待治疗的疾病选择由工程改造的γδt细胞表达的适当肿瘤识别部分。例如，在一些情况下，肿瘤识别部分是tcr。在一些情况下，肿瘤识别部分是在癌细胞上表达的配体的受体。合适的受体的非限制性实例包括nkg2d、nkg2a、nkg2c、nkg2f、llt1、aicl、cd26、nkrp1、cd244(2b4)、dnam
‑
1、nkp30、nkp44、nkp46和nkp80。在一些情况下，肿瘤识别部分可包括配体，例如il
‑
13配体，或肿瘤抗原的模拟物配体，诸如il13r的模拟物il
‑
13。
[0197]
γδt细胞可以被工程改造为表达包含来源于nkg2d、nkg2a、nkg2c、nkg2f、llt1、aicl、cd26、nkrp1、cd244(2b4)、dnam
‑
1的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体(诸如抗her2neu或抗egfr)以及得自cd3
‑
ζ、dap 10、dap 12、cd28、41bb和cd40l的信号传导结构域的嵌合肿瘤识别部分。在一些实例中，嵌合受体结合mica、micb、her2neu、egfr、egfrviii、间皮素、cd38、cd20、cd19、bcma、psa、ron、cd30、cd22、cd37、cd38、cd56、cd33、cd138、cd123、cd79b、cd70、cd75、ca6、gd2、甲胎蛋白(afp)、cs1、癌胚抗原(cea)、ceacam5、ca
‑
125、muc
‑
16、5t4、napi2b、ror1、ror2、plif、her2/neu、egfrviii、gpmnb、liv
‑
1、糖脂f77、成纤维细胞活化蛋白(fap)、psma、steap
‑
1、steap
‑
2、c
‑
met、cspg4、cd44v6、pvrl
‑
4、vegfr2、c4.4a、psca、叶酸结合蛋白/受体、slc44a4、cripto、ctag1b、axl、il
‑
13rα2、il
‑
3r、epha3、sltrk6、gp100、mart1、酪氨酸酶、ssx2、ssx4、nyeso
‑
1、上皮肿瘤抗原(eta)、magea家族基因(诸如magea3、
magea4)、kklc1、突变ras(h、n、k)、braf、p53、β
‑
连环蛋白、egfrt790、mhc i类链相关分子a(mica)或mhc i类链相关分子b(micb)或者hpv、cmv或ebv中的一种或多种抗原。
[0198]
在一些情况下，肿瘤识别部分靶向与肿瘤相关肽复合的mhc i类分子(hla
‑
a、hla
‑
b或hla
‑
c)。用于产生和使用靶向与mhc i类分子复合的肿瘤相关肽的肿瘤识别部分的方法和组合物包括weidanz等人,int.rev.immunol.30:328
‑
40,2011；scheinberg等人,oncotarget.4(5):647
‑
8,2013；cheever等人,clin.cancer res.15(17):5323
‑
37,2009；dohan&reiter expert rev mol med.14:e6,2012；dao等人,sci transl med.2013年3月13日；5(176):176ra33；u.s.9,540,448；以及wo 2017/011804所述的那些。在一些实施方案中，肽mhc复合物的靶向肿瘤的相关肽是以下肽：威尔姆氏(wilms)肿瘤蛋白1(wt1)、人端粒酶逆转录酶(htert)、生存素、小鼠双微体2同源物(mdm2)、细胞色素p450(cyp1b)、kras或braf。
[0199]
两个或多个肿瘤识别部分可以在γδt细胞中自从工程改造的γδt细胞稳定表达的遗传上不同的、基本上不同的或基本上相同的αβtcr多核苷酸，或从稳定整合进工程改造的γδt细胞的遗传上不同的αβtcr多核苷酸表达。就遗传上不同的αβtcr而言，可以利用识别与相同病症相关的不同抗原的αβtcr。在一个优选的实施方案中，γδt细胞被工程改造为表达来自一个或多个表达盒的人或小鼠来源的不同tcr，所述表达盒在不同的mhc单体型的背景下识别相同的抗原。在另一个优选的实施方案中，γδt细胞被工程改造为表达针对来自与不同的mhc单体型复合的给定抗原的相同或不同肽的一个tcr和两个或多个抗体。在一些情况下，通过工程改造的γδt细胞表达单个tcr促进了适当的tcr配对。表达不同tcr的工程改造的γδt细胞可提供通用的同种异体的工程改造γδt细胞。在第二个优选的实施方案中，γδt细胞被工程改造为表达针对肽
‑
mhc复合物的一种或多种不同的抗体，每种抗体涉及与相同的或不同的mhc单体型复合的相同的或不同的肽。在一些情况下，肿瘤识别部分可以是结合至肽
‑
mhc复合物的抗体。
[0200]
γδt细胞可以被工程改造为表达来自一个或多个表达盒的tcr，所述表达盒在不同的mhc单体型的背景下识别相同的抗原。在一些情况下，工程改造的γδt细胞被设计为表达单个tcr，或与car组合的tcr，以使工程改造的细胞中tcr错配的可能性最小化。由两个或多个表达盒表达的肿瘤识别部分优选地具有不同的多核苷酸序列，并且编码例如在不同的hla单体型的背景下识别相同靶标的不同表位的肿瘤识别部分。表达这种不同tcr或car的工程改造的γδt细胞可提供通用的同种异体的工程改造γδt细胞。
[0201]
在一些情况下，γδt细胞被工程改造为表达一个或多个肿瘤识别部分。两个或多个肿瘤识别部分可以在γδt细胞中从遗传上相同的或基本上相同的工程改造的抗原特异性嵌合(car)多核苷酸表达。两个或多个肿瘤识别部分可以在γδt细胞中从遗传上不同的工程改造的car多核苷酸表达。遗传上不同的car可以被设计为识别与相同病症相关的不同抗原。
[0202]
或者，γδt细胞可以是双特异性的。双特异性的工程改造的γδt细胞可以表达两个或多个肿瘤识别部分。双特异性的工程改造的γδt细胞可以表达tcr和car肿瘤识别部分。双特异性的工程改造的γδt细胞可以被设计为识别与相同病症相关的不同抗原。工程改造的γδt细胞可以表达识别相同的或基本上相同的抗原的两个或多个car/tcr双特异性多核苷酸。工程改造的γδt细胞可以表达识别不同的抗原的两个或多个car/tcr双特异性
的构建体。在一些情况下，本公开的双特异性的构建体结合至靶细胞的活化和失活结构域，据此提供增加的靶标特异性。γδt细胞可以被工程改造为表达至少1个肿瘤识别部分、至少2个肿瘤识别部分、至少3个肿瘤识别部分、至少4个肿瘤识别部分、至少5个肿瘤识别部分、至少6个肿瘤识别部分、至少7个肿瘤识别部分、至少8个肿瘤识别部分、至少9个肿瘤识别部分、至少10个肿瘤识别部分、至少11个肿瘤识别部分、至少12个肿瘤识别部分或其它合适数量的肿瘤识别部分。
[0203]
可以通过包含itam基序的两种功能性ζ(zeta)蛋白来增强适当的tcr功能。还可以通过αβ或γδ活化结构域(诸如cd3ζ、cd28、cd2、ctla4、icos、jaml、pd
‑
1、cd27、cd30、41
‑
bb、ox40、nkg2d、hvem、cd46、cd4、fcεriγ、il
‑
2rb/cd122、il
‑
2rg/cd132、dap分子和cd70)的表达来增强适当的tcr功能。表达的多核苷酸可以包含肿瘤识别部分、接头部分和活化结构域的遗传密码。通过工程改造的γδt细胞来翻译多核苷酸可以提供由蛋白质接头连接的肿瘤识别部分和活化结构域。通常，接头包含不阻碍肿瘤识别部分和活化结构域的折叠的氨基酸。接头分子的长度可以为至少约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸或约20个氨基酸。在一些情况下，接头中至少50％、至少70％或至少90％的氨基酸为丝氨酸或甘氨酸。
[0204]
在一些情况下，活化结构域可包含一个或多个突变。合适的突变可以是例如赋予活化结构域以组成型活性的突变。改变一种或多种核酸的同一性改变了翻译的氨基酸的氨基酸序列。可以进行核酸突变，以使得编码的氨基酸被修饰为极性的、非极性的、碱性或酸性氨基酸。可以进行核酸突变，以使得肿瘤识别部分被优化为识别来自肿瘤的表位。γδt细胞的工程改造的肿瘤识别部分、工程改造的活化结构域或另一工程改造的组分可以包括超过1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变、7个氨基酸突变、8个氨基酸突变、9个氨基酸突变、10个氨基酸突变、11个氨基酸突变、12个氨基酸突变、13个氨基酸突变、14个氨基酸突变、15个氨基酸突变、16个氨基酸突变、17个氨基酸突变、18个氨基酸突变、19个氨基酸突变、20个氨基酸突变、21个氨基酸突变、22个氨基酸突变、23个氨基酸突变、24个氨基酸突变、25个氨基酸突变、26个氨基酸突变、27个氨基酸突变、28个氨基酸突变、29个氨基酸突变、30个氨基酸突变、31个氨基酸突变、32个氨基酸突变、33个氨基酸突变、34个氨基酸突变、35个氨基酸突变、36个氨基酸突变、37个氨基酸突变、38个氨基酸突变、39个氨基酸突变、40个氨基酸突变、41个氨基酸突变、42个氨基酸突变、43个氨基酸突变、44个氨基酸突变、45个氨基酸突变、46个氨基酸突变、47个氨基酸突变、48个氨基酸突变、49个氨基酸突变或50个氨基酸突变。
[0205]
在一些情况下，本公开的γδt细胞不表达一种或多种mhc分子。在工程改造的γδt细胞中一个或多个mhc基因座的缺乏可以降低工程改造的γδt细胞被宿主免疫系统识别的可能性。人主要组织相容性复合物(mhc)基因座(称为人白细胞抗原(hla)系统)包含在抗原呈递细胞(包括γδt细胞)中表达的大基因家族。hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c分子的作用是提供作为抗原呈递细胞的抗原的胞内肽。hla
‑
dp、hla
‑
dm、hla
‑
doa、hla
‑
dob、hla
‑
dq和hla
‑
dr分子的作用是提供作为抗原呈递细胞的抗原的胞外肽。hla基因的一些等位基因与gvhd、自体免疫疾病和癌症相关。本文所述的工程改造的γδt细胞可以进一步工程改造为缺乏或破坏一个或多个hla基因的基因表达。本文所述的工程改造的γδt细胞可以进一步工程改造为缺
乏或破坏mhc复合物的一种或多种组分的基因表达，诸如一个或多个mhc基因的完全缺乏、特定外显子的缺乏或β2微球蛋白(b2m)的缺乏。至少一个hla基因的基因切除或基因断裂可以提供临床治疗性γδt细胞，所述γδt细胞可施用于具有任何hla单体型的受试者，而不导致移植物对抗宿主疾病。本文所述的工程改造的γδt细胞可以是具有任何hla单体型的人受试者的通用供体。
[0206]
γδt细胞可以被工程改造为缺乏一个或多个hla基因座(基因座位)。工程改造的γδt细胞可以被工程改造为缺乏hla
‑
a等位基因、hla
‑
b等位基因、hla
‑
c等位基因、hla
‑
dr等位基因、hla
‑
dq等位基因或hla
‑
dp等位基因。在一些情况下，hla等位基因与人疾病(诸如自体免疫疾病)相关。例如，hla
‑
b27等位基因与关节炎和葡萄膜炎相关，hla
‑
dr2等位基因与全身性红斑狼疮和多发性硬化相关，hla
‑
dr3等位基因与21
‑
羟化酶缺乏相关，hla
‑
dr4与类风湿性关节炎和1型糖尿病相关。缺乏例如hla
‑
b27等位基因的工程改造的γδt细胞可施用于患有关节炎的受试者，而不容易被受试者的免疫系统识别。在一些情况下，一个或多个hla基因座的缺乏提供了工程改造的γδt细胞，它作为具有任何hla单体型的任何受试者的通用供体。
[0207]
在一些情况下，工程改造γδt细胞需要缺乏γδt细胞基因组的一部分。在一些情况下，基因组的缺失部分包含mhc基因座(基因座位)的一部分。在一些情况下，工程改造的γδt细胞来源于野生型人γδt细胞，并且mhc基因座是hla基因座。在一些情况下，基因组的缺失部分包含mhc复合物中的蛋白质对应的基因的一部分。在一些情况下，基因组的缺失部分包含β2微球蛋白基因。在一些情况下，基因组的缺失部分包含免疫检查点基因，诸如pd
‑
1、ctla
‑
4、lag3、icos、btla、kir、tim3、a2ar、b7
‑
h3、b7
‑
h4和cecam
‑
1。在一些情况下，工程改造的γδt细胞可以设计为表达增强t细胞活化和细胞毒性的活化结构域。可由工程改造的γδt细胞表达的活化结构域的非限制性实例包括：cd2、icos、4
‑
1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd27、cd70、cd80、cd86、dap分子、cd122、gitr、fcεriγ。
[0208]
工程改造的γδt细胞的基因组的任何部分可以被缺失，以破坏内源性γδt细胞基因的表达。γδt细胞的基因组中可以缺乏或破坏的基因组区域的非限制性实例包括启动子、活化子、增强子、外显子、内含子、非编码rna、微rna、小核rna、可变数量串联重复序列(vntr)、短串联重复序列(str)、snp图谱、高变区、小卫星序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列或简单重复序列。在一些情况下，基因组的缺失部分的范围在1个核酸至约10个核酸、1个核酸至约100个核酸、1个核酸至约1,000个核酸、1个核酸至约10,000个核酸、1个核酸至约100,000个核酸、1个核酸至约1,000,000个核酸之间或其它合适的范围。
[0209]
工程改造的γδt细胞中的hla基因表达也可以通过本领域已知的各种技术破坏。在一些情况下，大基因座基因编辑技术用于从工程改造的γδt细胞基因组切除基因，或破坏工程改造的γδt细胞中至少一个hla基因座的基因表达。可用于编辑工程改造的γδt细胞的基因组上的所需基因座的基因编辑技术的非限制性实例包括分别如wo201409370、wo2003087341、wo2014134412和wo 2011090804(这些专利中的每个以引用的方式整体并入本文)所述的成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)
‑
cas、锌指核酸酶(zfn)、转录活化因子样效应核酸酶(talens)以及大范围核酸酶技术。
[0210]
γδt细胞可以从已表达肿瘤识别部分的分离的非工程改造的γδt细胞工程改造。
工程改造的γδt细胞可以保持由分离的野生型γδt细胞(例如，从肿瘤样品的肿瘤侵润性淋巴细胞分离)内源性表达的肿瘤细胞识别部分。在一些情况下，工程改造的γδt细胞肿瘤细胞识别部分替代野生型γδtcr。
[0211]
γδt细胞可以被工程改造为表达一种或多种归巢分子，诸如淋巴细胞归巢分子。归巢分子可以是例如淋巴细胞归巢受体或细胞粘附分子。归巢分子可以在工程改造的γδt细胞施用于受试者时帮助工程改造的γδt细胞迁移和侵润实体瘤(包括靶向实体瘤)。归巢受体的非限制性实例包括ccr家族成员，例如：ccr2、ccr4、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cla、cd44、cd103、cd62l、e
‑
选择素、p
‑
选择素、l
‑
选择素、整联蛋白(诸如vla
‑
4和lfa
‑
1)。细胞粘附分子的非限制性实例包括icam、n
‑
cam、vcam、pe
‑
cam、l1
‑
cam、粘连蛋白(pvrl1、pvrl2、pvrl3)、lfa
‑
1、整联蛋白αxβ2、αvβ7、巨噬细胞
‑
1抗原、cla
‑
4、糖蛋白iib/iiia。细胞粘附分子的其它实例包括钙依赖性分子(诸如t
‑
钙粘蛋白)，以及基质金属蛋白酶(mmp)(诸如mmp9或mmp2)的抗体。
[0212]
涉及t细胞成熟、活化、增殖和功能的步骤可以通过共刺激和抑制信号经由免疫检查点蛋白调控。免疫检查点是免疫系统固有的共刺激和抑制元件。免疫检查点有助于维持自身耐受性和调节生理免疫应答的持续时间和幅度，以在免疫系统对疾病状况(诸如细胞转化或感染)作出响应时防止组织损伤。用于控制来自γδ和αβt细胞的免疫应答的共刺激和抑制信号之间的平衡可由免疫检查点蛋白调控。免疫检查点蛋白(诸如pd1和ctla4)存在于t细胞的表面上，并且可用于“开启”或“关闭”免疫应答。肿瘤可以使作为免疫耐受机制的检查点蛋白功能失调，特是对肿瘤抗原具有特异性的t细胞。本公开的工程改造的γδt细胞可以进一步工程改造为缺乏一个或多个免疫检查点基因座(基因座位)，诸如pd
‑
1、ctla
‑
4、lag3、icos、btla、kir、tim3、a2ar、ceacam1、b7
‑
h3和b7
‑
h4。或者，可以通过基因编辑技术破坏内源性免疫检查点基因在本公开的工程改造的γδt细胞中的表达。
[0213]
免疫检查点可以是本公开的工程改造的γδt细胞中调节抑制信号传导通路的分子(例如ctla4、pd1和lag3)或调节刺激信号传导通路的分子(例如icos)。扩展免疫球蛋白超家族中的几种蛋白质可以是免疫检查点的配体。免疫检查点配体蛋白的非限制性实例包括b7
‑
h4、icosl、pd
‑
l1、pd
‑
l2、megacd40l、megaox40l和cd137l。在一些情况下，免疫检查点配体蛋白是由肿瘤表达的抗原。在一些情况下，免疫检查点基因是ctla
‑
4基因。在一些情况下，免疫检查点基因是pd
‑
1基因。
[0214]
pd1是属于cd28/ctla4家族的抑制性受体，并在活化的t淋巴细胞、b细胞、单核细胞、dc和调节t细胞上表达。已知的pd1配体有两种，即pd
‑
l1和pd
‑
l2，它们在t细胞、apc和恶性细胞上表达，其作用是抑制自体反应性淋巴细胞和抑制taa特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的效应功能。因此，缺乏pd1的工程改造的γδt细胞可以保持其细胞毒性活性，无论肿瘤细胞是否表达pd
‑
l1和pd
‑
l2。在一些情况下，本公开的工程改造的γδt细胞缺乏pd
‑
1基因的基因座。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏pd
‑
1基因在工程改造的γδt细胞中的表达。
[0215]
ctla4(细胞毒性t淋巴细胞抗原4)也称为cd152(分化簇152)。ctla4与共刺激分子cd28共有序列同源性和配体(cd80/b7
‑
1和cd86/b7
‑
2)，但不同之处在于将抑制信号递送至表达作为受体的ctla4的t细胞。ctla4对两种配体的总亲和力更高，并且当配体密度有限时，可在与cd28的结合竞争中胜出。ctla4通常在cd8
效应t细胞的表面上表达，并且在初始
和记忆t细胞的初始活化阶段发挥功能作用。ctla4在t细胞活化的早期通过增加对cd80和cd86的亲和力来抵消cd28的活性。ctla4的主要功能包括下调辅助t细胞和增强调节t细胞的免疫抑制活性。在一些情况下，本公开的工程改造的γδt细胞缺乏ctla4基因。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏ctla4基因在工程改造的γδt细胞中的表达。
[0216]
lag3(淋巴细胞活化基因3)在活化的抗原特异性细胞毒性t细胞上表达，并且可增强调节t细胞的功能和独立地抑制cd8
效应t细胞活性。lag3是对mhc ii类蛋白的结合具有高亲和力的cd
‑
4样负调控蛋白，它们在一些上皮癌症中上调，引起t细胞增殖和稳态的耐受性。使用lag
‑3‑
ig融合蛋白减少lag
‑
3/ii类相互作用可以增强抗肿瘤免疫应答。在一些情况下，本公开的工程改造的γδt细胞缺乏lag3基因的基因座。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏lag3基因在工程改造的γδt细胞中的表达。
[0217]
非工程改造的和工程改造的γδ t细胞的表型
[0218]
工程改造的γδt细胞可以归巢至受试者身体内的特定物理位置。工程改造的γδt细胞的迁移和归巢可取决于特定趋化因子和/或粘附分子的组合表达和作用。工程改造的γδt细胞的归巢可以由趋化因子与其受体之间的相互作用控制。例如，细胞因子(包括但不限于cxcr3(其配体以ip
‑
10/cxcl10和6ckine/slc/ccl21表示)、ccr4 、cxcr5 (rantes、mip
‑
1α、mip
‑
1β的受体)、ccr6 和ccr7)可影响工程改造的γδt细胞的归巢。在一些情况下，工程改造的γδt细胞可以归巢至炎症和损伤部位和疾病细胞以执行修复功能。在一些情况下，工程改造的γδt细胞可归巢至癌症。在一些情况下，工程改造的γδt细胞可归巢至胸腺、骨髓、皮肤、喉、气管、胸膜、肺、食道、腹部、胃、小肠、大肠、肝、胰腺、肾、尿道、膀胱、睾丸、前列腺、输精管、卵巢、子宫、乳腺、甲状旁腺、脾或受试者身体的其它部位。工程改造的γδt细胞可表达一个或多个归巢部分，诸如特定的tcr等位基因和/或淋巴细胞归巢分子。
[0219]
工程改造的γδt细胞可具有特定表型，并且表型可以根据细胞表面标志物表达来描述。各种类型的γδt细胞可以如本文所述工程改造。在优选的实施方案中，工程改造的γδt细胞来源于人，但工程改造的γδt细胞也可以来源于不同的来源，诸如哺乳动物或合成细胞。
[0220]
可以使用标志物(包括但不限于cd137、cd27、cd45ra、cd45ro、ccr7和cd62l)来确定活化和/或扩增细胞群的免疫表型(klebanoff等人,immunol rev.211:214 2006)。cd137或4
‑
1bb是一种活化诱导的共刺激分子，也是免疫反应的重要调节剂。pollok等人,j.immunol.150,771
‑
81(1993)。cd45ra在初始t淋巴细胞上表达，当抗原遇到时被cd45ro替换，但在晚期效应细胞中重新表达(michie等人,nature 360,264
‑
265(1992)；cd62l是充当归巢分子进入次级淋巴组织的细胞粘附分子，并且在t细胞活化后丢失，此时t细胞获得效应功能(sallusto等人,nature.401:708(1999)；cd27是在t细胞分化期间丢失的共刺激标志物(appay等人,nat med.8:379(2002)；klebanoff等人,immunol rev.211:214 2006)。另外或另选的活化标志物包括但不限于cd25、pd
‑
1和cd69中的一种或多种。
[0221]
抗原
[0222]
本文公开的发明提供表达抗原识别部分的工程改造的γδt细胞，其中抗原识别部分识别疾病特异性表位。抗原可以是引发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生、特定免疫活性细胞的活化或它们二者。抗原可以是例如肽、蛋白质、半抗原、脂质、糖、细菌、病原体或病毒。抗原可以是肿瘤抗原。肿瘤表位可以由肿瘤细胞表面上的mhc i或mhc ii复合
物呈递。表位可以是在细胞表面上表达并且由肿瘤识别部分识别的抗原的一部分。
[0223]
工程改造的γδt细胞识别的抗原的非限制性实例包括cd19、cd20、cd30、cd22、cd37、cd38、cd56、cd33、cd138、cd123、cd79b、cd70、cd75、ca6、gd2、甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、ron、ceacam5、ca
‑
125、muc
‑
16、5t4、napi2b、ror1、ror2、plif、her2/neu、egfrviii、gpmnb、liv
‑
1、糖脂f77、成纤维细胞活化蛋白(fap)、psma、steap
‑
1、steap
‑
2、间皮素、c
‑
met、cspg4、pvrl
‑
4、vegfr2、psca、clec12a、l1cam、gpc2、gpc3、叶酸结合蛋白/受体、slc44a4、cripto、ctag1b、axl、il
‑
13r、il
‑
3rα2、sltrk6、gp100、mart1、酪氨酸酶、ssx2、ssx4、nyeso
‑
1、wt
‑
1、prame、上皮肿瘤抗原(eta)、magea家族基因(诸如magea3、magea4)、kklc1、突变ras、vraf、p53、mhc i类链相关分子a(mica)或mhc i类链相关分子b(micb)或者hpv、cmv或ebv中的一种或多种抗原。
[0224]
抗原可以在细胞的胞内或胞外区室中表达，并且工程改造的γδt细胞可以识别胞内或胞外肿瘤抗原。在一些情况下，工程改造的γδt细胞中的αβtcr识别来源于胞内或胞外肿瘤抗原的肽。例如，抗原可以是由病毒感染的细胞胞内或胞外产生的蛋白质(诸如hiv、ebv、cmv或hpv蛋白)。抗原也可以是由癌细胞胞内或胞外表达的蛋白质。
[0225]
抗原识别部分可以识别来自窘迫期细胞(诸如癌细胞或被病毒感染的细胞)的抗原。例如，人mhc i类链相关基因(mica和micb)位于染色体6的hla i类区内。mica和micb蛋白被视为人上皮细胞中的“应激”标志物，并且充当表达常见自然杀伤细胞受体(nkg2d)的细胞的配体。作为应激标志物，mica和micb可以从癌细胞高表达。工程改造的γδt细胞可以识别mica或micb肿瘤表位。
[0226]
肿瘤识别部分可以被工程改造为以某些亲和力识别抗原。例如，由tcr或car构建体编码的肿瘤识别部分可以以解离常数为至少10fm、至少100fm、至少1皮摩尔/升(pm)、至少10pm、至少20pm、至少30pm、至少40pm、至少50pm、至少60pm、至少7pm、至少80pm、至少90pm、至少100pm、至少200pm、至少300pm、至少400pm、至少500pm、至少600pm、至少700pm、至少800pm、至少900pm、至少1纳摩尔/升(nm)、至少2nm、至少3nm、至少4nm、至少5nm、至少6nm、至少7nm、至少8nm、至少9nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少200nm、至少300nm、至少400nm、至少500nm、至少600nm、至少700nm、至少800nm、至少900nm、至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少6μm、至少7μm、至少8μm、至少9μm、至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm或至少100μm识别抗原。
[0227]
在一些情况下，肿瘤识别部分可以被工程改造为以解离常数为至多10fm、至多100fm、至多1皮摩尔/升(pm)、至多10pm、至多20pm、至多30pm、至多40pm、至多50pm、至多60pm、至多7pm、至多80pm、至多90pm、至多100pm、至多200pm、至多300pm、至多400pm、至多500pm、至多600pm、至多700pm、至多800pm、至多900pm、至多1纳摩尔(nm)、至多2nm、至多3nm、至多4nm、至多5nm、至多6nm、至多7nm、至多8nm、至多9nm、至多10nm、至多20nm、至多30nm、至多40nm、至多50nm、至多60nm、至多70nm、至多80nm、至多90nm、至多100nm、至多200nm、至多300nm、至多400nm、至多500nm、至多600nm、至多700nm、至多800nm、至多900nm、至多1μm、至多2μm、至多3μm、至多4μm、至多5μm、至多6μm、至多7μm、至多8μm、至多9μm、至多10μm、至多20μm、至多30μm、至多40μm、至多50μm、至多60μm、至多70μm、至多80μm、至多90μm或至多100μm识别抗原。
[0228]
治疗方法
[0229]
可以施用含有本文所述的非工程改造的富集γδt细胞群、工程改造的富集γδt细胞群和/或它们的掺和物的药物组合物进行预防性和/或治疗性治疗。另外或另选地，可以施用如本文所述的含有一种或多种选择性扩增γδt细胞群的药剂的药物组合物进行预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，可将组合物以足以治愈或至少部分地阻止疾病或病症的症状的量施用给已患有疾病或病症的受试者。还可施用组合物以减少病症发展、感染或恶化的可能性。用于治疗用途的非工程改造的富集γδt细胞群、工程改造的富集γδt细胞群、它们的掺和物和/或一种或多种选择性扩增γδt细胞群药剂的有效量可基于疾病或病症的严重程度和病程、既往治疗、受试者的健康状况、体重和/或对药物的反应和/或治疗医生的判断而有所不同。
[0230]
本公开的组合物可用于治疗需要治疗病症的受试者。病症的实例包括癌症、感染性疾病、自体免疫疾病和败血症。受试者可以是人、非人灵长类动物，诸如黑猩猩以及其它猿类和猴类物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等等。受试者可以是任何年龄的。受试者可以是例如老年人、成人、青少年、青春前期少年、儿童、幼儿、婴儿。
[0231]
本公开的组合物以及它们的组合可以以各种方案(例如，时间安排、浓度、剂量、治疗之间的间隔和/或制剂)施用。在接受本公开的体内扩增剂和/或富集的γδt细胞群或它们的掺和之前，还可用例如化学疗法、放射疗法或两者的组合对受试者进行预处理。作为治疗的一部分，可以将组合物以第一方案施用给受试者，并且可以监测受试者以确定第一方案的治疗是否满足给定水平的治疗功效。在一些情况下，可将工程改造的γδt细胞或另一种工程改造的γδt细胞以第二方案施用给受试者。
[0232]
在一些实施方案中，在第一操作中，将本文所述的至少一种组合物施用给患有或怀疑患有给定病症(例如癌症)的受试者。可以以第一方案施用该组合物。在第二操作中，可以例如由保健提供者(例如治疗医生或护士)监测受试者。在一些实例中，监测受试者以确定或衡量组合物在治疗受试者病症中的功效。在一些情况下，还可以监测受试者以确定受试者体内γδt细胞群的体内活化、扩增或细胞数。接下来，在第三操作中，将本文所述的至少一种组合物以第二方案施用给受试者。第二方案可以与第一方案相同或与第一方案不同。在一些情况下，不进行第三操作，例如如果发现第一操作中组合物的施用是有效的(例如，单轮施用足以治疗病症)。由于工程改造的γδt细胞群的同种异体和通用供体特征，可以将其施用给具有不同的mhc单体型的多名受试者。可以将工程改造的γδt细胞在施用给受试者之前冷冻或超低温保存。
[0233]
也可以将富集的γδt细胞群(即工程改造或非工程改造的)和/或它们的掺和物在施用给受试者之前冷冻或超低温保存，并且任选地通过施用一种或多种选择性扩增施用的γδt细胞的药剂来进一步体内活化和扩增和/或维持。在某些实施方案中，工程改造的富集的γδt细胞群可以包含两种或多种表达相同的肿瘤识别部分、不同的肿瘤识别部分或相同的肿瘤识别部分和不同的肿瘤识别部分的组合的细胞。
[0234]
例如，工程改造的富集的γδt细胞群可以包含设计为识别不同的抗原或相同抗原的不同表位的几种不同的工程改造的γδt细胞。例如，人黑素瘤细胞可表达ny
‑
eso
‑
1癌基因。人体内的感染细胞可以将ny
‑
eso
‑
1癌蛋白加工为小片段，并提供用于抗原识别的ny
‑
eso
‑
1蛋白的多个部分。工程改造的富集的γδt细胞群可以包含多种表达不同的肿瘤识别部分的工程改造的γδt细胞，所述肿瘤识别部分设计为识别ny
‑
eso
‑
1蛋白的不同部分。
[0235]
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于用识别黑素瘤抗原ny
‑
eso
‑
1的不同表位的工程改造的γδt细胞群来治疗受试者的方法。在第一操作中，选择识别相同抗原的不同表位的工程改造的γδt细胞群。例如，工程改造的γδt细胞群可以包含两种或多种表达不同的肿瘤识别部分的细胞，这些肿瘤识别部分识别ny
‑
eso
‑
1蛋白的不同部分。在第二操作中，可以将工程改造的γδt细胞群以第一方案施用。在第二操作中，可以例如由保健提供者(例如治疗医生或护士)监测受试者。在第三操作中，可以向受试者施用一种或多种体内选择性扩增施用的γδt细胞的药剂，从体内扩增和/或维持施用的γδt细胞群。在第四操作中，可以监测受试者以确定体内扩增和/或维持的功效。在一些实施方案中，不执行第二操作。在一些实施方案中，不执行第四操作。
[0236]
本公开的一种或多种组合物可以用于治疗各种病症。在一些情况下，本公开的组合物可以用于治疗癌症，包括实体瘤和恶性血液病。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、aids相关癌症、aids相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(诸如小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤)、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特(burkitt)淋巴瘤、原发部位不明癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏(ewing)肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质肿瘤、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金(hodgkin)淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏(kaposi)肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(诸如非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨/骨肉瘤的恶性纤维性组织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发不明颈部鳞状细胞癌、口腔癌、多发性内分泌腺肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、上皮性卵巢癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、口咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、皮肤癌默克(merkel)细胞、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、t细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养叶肿瘤(妊娠)、原发灶不明的癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和威廉姆氏(wilms)肿瘤。
[0237]
在一些情况下，本公开的组合物可以用于治疗传染病。感染性疾病可以例如由病原性细菌或由病毒引起。多种病原性蛋白质、核酸、脂质或其片段可由病变细胞表达。抗原呈递细胞可以例如通过吞噬作用或通过受体介导的胞吞作用内化此类病原性分子，并且展示出结合至适当的mhc分子的抗原片段。例如，apc可以显示出病原性蛋白的多种9聚物片段。本公开的工程改造的富集的γδt细胞群可设计为识别病原性细菌或病毒的多种抗原和
抗原片段。病原性细菌的非限制性实例可见于：a)博德特氏菌属(bordetella)，诸如百日咳博德特氏菌(bordetella pertussis)种；b)疏螺旋体属(borrelia)，诸如伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)种；c)布鲁氏菌属(brucelia)，诸如流产布鲁氏菌(brucella abortus)、犬布鲁氏菌(brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(brucela meliterisis)和/或猪布鲁氏菌(brucella suis)种；d)弯曲杆菌属(campylobacter)，诸如空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)种；e)衣原体属(chlamydia)和亲衣原体属(chlamydophila)，诸如肺炎衣原体(chlamydia pneumonia)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)和/或鹦鹉热衣原体(chlamydophila psittaci)种；f)梭菌属(clostridium)，诸如肉毒梭菌(clostridium botulinum)、艰难梭菌(clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、破伤风梭菌(clostridium tetani)种；g)棒状杆菌属(corynebacterium)，诸如白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheria)种；h)肠球菌属(enterococcus)，诸如粪肠球菌(enterococcus faecalis)和/或屎肠球菌(enterococcus faecium)种；i)埃希氏菌属(escherichia)，诸如大肠杆菌(escherichia coli)种；j)弗朗西斯氏菌属(francisella)，诸如土拉热弗朗西斯氏菌(francisella tularensis)种；k)嗜血杆菌属(haemophilus)，诸如流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)种；l)螺杆菌属(helicobacter)，诸如幽门螺杆菌(helicobacter pylori)种；m)军团菌属(legionella)，诸如嗜肺军团菌(legionella pneumophila)种；n)钩端螺旋体属(leptospira)，诸如问号钩端螺旋体(leptospira interrogans)种；o)李斯特菌属(listeria)，诸如单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes)种；p)分枝杆菌属(mycobacterium)，诸如麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)和/或溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans)种；q)支原体属(mycoplasma)，诸如肺炎支原体(mycoplasma pneumonia)种；r)奈瑟氏菌属(neisseria)，诸如淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)和/或脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidia)种；s)假单胞菌属(pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)种；t)立克次氏体属(rickettsia)，诸如立氏立克次氏体(rickettsia rickettsii)种；u)沙门氏菌属(salmonella)，诸如伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)和/或鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)种；v)志贺氏菌属(shigella)，诸如宋内志贺氏菌(shigella sonnei)种；w)葡萄球菌属(staphylococcus)，诸如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)和/或腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)种；x)链球菌属(streptpcoccus)，诸如无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(streptococcus pneumonia)和/或酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)种；y)密螺旋体属(treponema)，诸如梅毒密螺旋体(treponema pallidum)种；z)弧菌属(vibrio)，诸如霍乱弧菌(vibrio cholera)；和/或aa)耶尔森氏菌属(yersinia)，诸如鼠疫耶尔森氏菌(yersinia pestis)种。
[0238]
在一些情况下，本公开的组合物可以用于治疗传染病，传染病可以由病毒引起。病毒的非限制性实例可见于以下病毒科，并用示例性种说明：a)腺病毒科(adenoviridae)，诸如腺病毒种；b)疱疹病毒科(herpesviridae)，诸如单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘
‑
带状疱疹病毒、爱泼斯坦
‑
巴尔(epstein
‑
barr)病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型种；c)乳头瘤病毒科(papillomaviridae)，诸如人乳头瘤病毒种；d)多瘤病毒科(polyomaviridae)，诸
如bk病毒、jc病毒种；e)痘病毒科(poxviridae)，诸如天花种；f)肝病毒科(hepadnaviridae)，诸如乙肝病毒种；g)细小病毒科(parvoviridae)，诸如人博卡病毒、细小病毒b19种；h)星状病毒科(astroviridae)，诸如人星状病毒种；i)杯状病毒科(caliciviridae)，诸如诺沃克病毒种；j)黄病毒科(flaviviridae)，诸如丙肝病毒(hcv)、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒种；k)披膜病毒科(togaviridae)，诸如风疹病毒种；l)肝炎病毒科(hepeviridae)，诸如戊肝病毒种；m)逆转录病毒科(retroviridae)，诸如人免疫缺陷病毒(hiv)种；n)正黏液病毒科(orthomyxoviridaw)，诸如流感病毒种；o)沙状病毒科(arenaviridae)，诸如瓜纳瑞托(guanarito)病毒、胡宁(junin)病毒、拉沙(lassa)病毒、马秋波(machupo)病毒和/或萨比亚(sabi
á
)病毒种；p)本雅病毒科(bunyaviridae)，诸如克里米亚
‑
刚果(crimean
‑
congo)出血热病毒种；q)丝状病毒科(filoviridae)，诸如埃博拉(ebola)病毒和/或马尔堡(marburg)病毒种；副黏液病毒科(paramyxoviridae)，诸如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、亨德拉(hendra)病毒和/或尼帕(nipah)病毒种；r)弹状病毒属(rhabdoviridae)，诸如狂犬病毒种；s)呼肠孤病毒科(reoviridae)，诸如轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁虱热病毒和/或版纳(banna)病毒种。在一些实例中，病毒未分配至病毒科，诸如丁型肝炎。
[0239]
在一些情况下，本公开的组合物可以用于治疗免疫疾病，诸如自身免疫疾病。炎性疾病(包括自体免疫疾病)也是b细胞疾病相关的疾病类别。免疫疾病或病症(包括自体免疫病症)的实例包括：类风湿性关节炎、风湿热、多发性硬化、实验性自体免疫脑脊髓炎、牛皮癣、葡萄膜炎、糖尿病、全身性红斑狼疮(sle)、狼疮性肾炎、湿疹、硬皮病、多发性肌炎/硬皮病、多发性肌炎/皮肌炎、溃疡性直肠炎、溃疡性结肠炎、严重联合免疫缺陷症(scid)、迪乔治(digeorge)综合征、共济失调性毛细血管扩张症、季节性过敏、常年性过敏、食物过敏、过敏反应、肥大细胞增生症、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、帕金森氏症(parkinson)、阿尔茨海默氏症(alzheimer)、脾功能亢进、白细胞粘附缺陷、x
‑
连锁淋巴细胞增生性疾病、x
‑
连锁无丙种球蛋白血症、选择性免疫球蛋白a缺乏、高igm综合征、hiv、自体免疫淋巴细胞增生性综合征、维斯科特
‑
奥尔德里(wiskott
‑
aldrich)综合征、慢性肉芽肿病、常见变异型免疫缺陷病(cvid)、高免疫球蛋白e综合征、桥本氏(hashimoto)甲状腺炎、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、辛登南氏(sydenham)舞蹈症、重症肌无力、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、多形性红斑、ga肾病、高安氏(takayasu)动脉炎、爱迪生氏(addison)病、结节病、溃疡性结肠炎、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古巴斯捷氏(goodpasture)综合征、闭塞性血栓血管炎、修格连氏(sjogren)综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、慢性活动性肝炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳(wegener)肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、骨髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病、纤维化肺泡炎和癌症。
[0240]
用本公开的组合物进行治疗可以在病症临床发作之前、期间和之后提供给受试者。治疗可以在疾病的临床发作之后1天、1周、6个月、12个月或2年后提供给受试者。治疗可以在疾病的临床发作之后提供给受试者持续超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。治疗可以在疾病的临床发作之后提供给受试者持续少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年。治疗还可以包括在临床试验中治疗人。治
疗可包括向受试者施用包含一种或多种选择性扩增γδt细胞群的药剂的药物组合物。治疗可以包括将包含本公开的非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物的药物组合物施用于受试者。在一些情况下，药物组合物包含本公开的一种或多种选择性扩增γδt细胞群以及本公开的非工程改造的富集γδt细胞群、工程改造的富集γδt细胞群和/或它们的掺和物的药剂。
[0241]
在一些情况下，向受试者施用本公开的组合物调节受试者体内内源性淋巴细胞的活性。在一些情况下，向受试者施用本公开的组合物向内源性t细胞提供抗原并且可以增强免疫应答。在一些情况下，记忆t细胞是cd4
t细胞。在一些情况下，记忆t细胞是cd8
t细胞。在一些情况下，向受试者施用本公开内容的组合物活化另一种免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，另一种免疫细胞是cd8 t细胞。在一些情况下，另一种免疫细胞是自然杀伤t细胞。在一些情况下，向受试者施用组合物抑制调节t细胞。在一些情况下，调节t细胞是fox3 treg细胞。在一些情况下，调节t细胞是fox3
‑
treg细胞。活性可由γδt细胞群调节的细胞的非限制性实例包括：造血干细胞；b细胞；cd4；cd8；红细胞；白细胞；树突状细胞，包括树突状抗原呈递细胞；白血球；巨噬细胞；记忆b细胞；记忆t细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；嗜中性粒细胞；辅助t细胞；和杀伤t细胞。
[0242]
在大多数骨髓移植期间，环磷酰胺与全身辐射的组合通常用于防止受试者的免疫系统对移植物中的造血干细胞(hsc)产生排斥反应。在一些情况下，进行供体骨髓与白介素
‑
2(il
‑
2)的离体孵育，以增强供体骨髓中杀伤淋巴细胞的产生。白介素
‑
2(il
‑
2)是野生型淋巴细胞的生长、增殖和分化必需的细胞因子。目前关于γδt细胞过继性转移到人体中的研究需要γδt细胞和白介素
‑
2的共施用。然而，低剂量和高剂量的il
‑
2均可具有剧毒副作用。il
‑
2毒性可在多个器官/系统中表现出来，最显著的是心脏、肺、肾和中枢神经系统。在一些情况下，本公开提供了在不与细胞因子(诸如il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12或il
‑
21)共施用的情况下，将非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物施用于受试者的方法。在一些情况下，非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物可以在不与il
‑
2共施用的情况下施用于受试者。在一些情况下，非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物在手术(诸如在不与il
‑
2共施用的情况下的骨髓移植)期间施用于受试者。
[0243]
在一些情况下，本公开提供了一种用于向受试者施用非工程改造的富集γδt细胞群、工程改造的富集γδt细胞群和/或它们的掺和物的方法，同时或依次共同施用细胞因子或其它刺激剂，诸如il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
19、il
‑
21、il23、il
‑
33、ifnγ、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)或粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)。在一些情况下，细胞因子是il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12或il
‑
21。在一些情况下，细胞因子是il
‑
2。在一些情况下，细胞因子是il
‑
15。在一些情况下，细胞因子是il
‑
4。在一些情况下，细胞因子是选自由il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15和il
‑
21或它们的组合组成的组的常见γ链细胞因子。
[0244]
施用方法
[0245]
可将本发明的包括选择性扩增剂、非工程改造的富集γδt细胞群、工程改造的富集γδt细胞群和/或它们的掺和物的一种或多种组合物以任何顺序或同时施用给受试者。如果同时，则可将组合物以单种统一形式(诸如静脉注射)或以多种形式(例如多次静脉输注、皮下注射或丸剂)提供。可将组合物一起或单独包装在单个包装中或多个包装中。本发
明的一种或所有组合物可以多次剂量给药。如果不是同时，则多个剂量之间的时间安排可以变化至大约一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或约一年。在一些情况下，施用的γδt细胞群、工程改造的富集γδt细胞群和/或它们的掺和物可在施用给受试者之后在受试者体内体内扩增。可将包含γδt细胞和/或活化剂的药物组合物包装成试剂盒。除了本文所述的一种或多种组合物之外，试剂盒还可以包括关于组合物使用的说明(例如，书面说明)。
[0246]
在一些情况下，一种治疗癌症的方法包括施用本文所述的组合物，其中施用治疗癌症。在一些实施方案中，施用治疗有效量的组合物持续至少约10秒、30秒、1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。
[0247]
可在疾病或病症发生之前、期间或之后施用本文所述的一种或多种组合物，并且施用药物组合物的时间安排可变化。例如，可将一种或多种组合物用作预防剂的，并且可将其连续施用具有病症或疾病倾向的受试者，以便减少疾病或病症发生的可能性。可在症状发作期间或在症状发作后尽快将一种或多种组合物施用给受试者。一种或多种组合物的施用可在症状发作时立即、症状发作的前3小时内、症状发作的前6小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前48小时内或在症状发作的任何时段开始。初始施用可以通过任何实用途径进行，诸如使用本文所述的任何制剂通过本文所述的任何途径进行。在一些实例中，本公开的一种或多种组合物的施用是静脉内施用。可将一个或多个剂量的一种或多种组合物在癌症、传染病、免疫疾病、败血症发作或骨髓移植之后尽快施用，持续治疗免疫疾病所需的时间长度，例如约24小时至约48小时、约48小时至约1周、约1周至约2周、约2周至约1个月、约1个月至约3个月。为了治疗癌症，可将一个或多个剂量的一种或多种组合物在癌症发作之后数年并且在其它治疗之前或之后施用。在一些实例中，可施用本文所述的一种或多种组合物持续至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。每位受试者的治疗长度可以变化。
[0248]
剂量
[0249]
本文公开的非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物可以配制为适于精确剂量的单次施用的单位剂型。在一些情况下，单位剂型包含另外的淋巴细胞。在单位剂型中，制剂被分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有不连续量的制剂的包装的形式。非限制性实例为包装片剂或胶囊剂以及小瓶或安瓿瓶中的粉剂。水性混悬剂组合物可以包装在单剂量不可重复开启式容器中。多剂量可重复开启式容器可以例如与防腐剂或不与防腐剂组合使用。在一些实例中，药物组合物不包含防腐剂。用于肠胃外注射的制剂可以单位剂型存在于例如安瓿瓶或含防腐剂的多剂量容器中。
[0250]
本文所述的非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物可以以至少5个细胞、至少10个细胞、至少20个细胞、至少30个细胞、至少40个细胞、至少50个细胞、至少60个细胞、至少70个细胞、至少80个细胞、至少90个细胞、至少100个
细胞、至少200个细胞、至少300个细胞、至少400个细胞、至少500个细胞、至少600个细胞、至少700个细胞、至少800个细胞、至少900个细胞、至少1x103个细胞、至少2x103个细胞、至少3x103个细胞、至少4x103个细胞、至少5x103个细胞、至少6x103个细胞、至少7x103个细胞、至少8x103个细胞、至少9x103个细胞、至少1x104个细胞、至少2x104个细胞、至少3x104个细胞、至少4x104个细胞、至少5x104个细胞、至少6x104个细胞、至少7x104个细胞、至少8x104个细胞、至少9x104个细胞、至少1x105个细胞、至少2x105个细胞、至少3x105个细胞、至少4x105个细胞、至少5x105个细胞、至少6x105个细胞、至少7x105个细胞、至少8x105个细胞、至少9x105个细胞、至少1x106个细胞、至少2x106个细胞、至少3x106个细胞、至少4x106个细胞、至少5x106个细胞、至少6x106个细胞、至少7x106个细胞、至少8x106个细胞、至少9x106个细胞、至少1x107个细胞、至少2x107个细胞、至少3x107个细胞、至少4x107个细胞、至少5x107个细胞、至少6x107个细胞、至少7x107个细胞、至少8x107个细胞、至少9x107个细胞、至少1x108个细胞、至少2x108个细胞、至少3x108个细胞、至少4x108个细胞、至少5x108个细胞、至少6x108个细胞、至少7x108个细胞、至少8x108个细胞、至少9x108个细胞、至少1x109细胞或更多的量存在于组合物中。
[0251]
本发明的非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1个细胞至约10个细胞、约1个细胞至约100个细胞、约1个细胞至约10个细胞、约1个细胞至约20个细胞、约1个细胞至约30个细胞、约1个细胞至约40个细胞、约1个细胞至约50个细胞、约1个细胞至约60个细胞、约1个细胞至约70个细胞、约1个细胞至约80个细胞、约1个细胞至约90个细胞、约1个细胞至约100个细胞、约1个细胞至约1x103个细胞、约1个细胞至约2x103个细胞、约1个细胞至约3x103个细胞、约1个细胞至约4x103个细胞、约1个细胞至约5x103个细胞、约1个细胞至约6x103个细胞、约1个细胞至约7x103个细胞、约1个细胞至约8x103个细胞、约1个细胞至约9x103个细胞、约1个细胞至约1x104个细胞、约1个细胞至约2x104个细胞、约1个细胞至约3x104个细胞、约1个细胞至约4x104个细胞、约1个细胞至约5x104个细胞、约1个细胞至约6x104个细胞、约1个细胞至约7x104个细胞、约1个细胞至约8x104个细胞、约1个细胞至约9x104个细胞、约1个细胞至约1x105个细胞、约1个细胞至约2x105个细胞、约1个细胞至约3x105个细胞、约1个细胞至约4x105个细胞、约1个细胞至约5x105个细胞、约1个细胞至约6x105个细胞、约1个细胞至约7x105个细胞、约1个细胞至约8x105个细胞、约1个细胞至约9x105个细胞、约1个细胞至约1x106个细胞、约1个细胞至约2x106个细胞、约1个细胞至约3x106个细胞、约1个细胞至约4x106个细胞、约1个细胞至约5x106个细胞、约1个细胞至约6x106个细胞、约1个细胞至约7x106个细胞、约1个细胞至约8x106个细胞、约1个细胞至约9x106个细胞、约1个细胞至约1x107个细胞、约1个细胞至约2x107个细胞、约1个细胞至约3x107个细胞、约1个细胞至约4x107个细胞、约1个细胞至约5x107个细胞、约1个细胞至约6x107个细胞、约1个细胞至约7x107个细胞、约1个细胞至约8x107个细胞、约1个细胞至约9x107个细胞、约1个细胞至约1x108个细胞、约1个细胞至约2x108个细胞、约1个细胞至约3x108个细胞、约1个细胞至约4x108个细胞、约1个细胞至约5x108个细胞、约1个细胞至约6x108个细胞、约1个细胞至约7x108个细胞、约1个细胞至约8x108个细胞、约1个细胞至约9x108个细胞或约1个细胞至约1x109个细胞。
[0252]
在一些情况下，本发明的非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδ
t细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1x103个细胞至约2x103个细胞、约1x103个细胞至约3x103个细胞、约1x103个细胞至约4x103个细胞、约1x103个细胞至约5x103个细胞、约1x103个细胞至约6x103个细胞、约1x103个细胞至约7x103个细胞、约1x103个细胞至约8x103个细胞、约1x103个细胞至约9x103个细胞、约1x103个细胞至约1x104个细胞、约1x103个细胞至约2x104个细胞、约1x103个细胞至约3x104个细胞、约1x103个细胞至约4x104个细胞、约1x103个细胞至约5x104个细胞、约1x103个细胞至约6x104个细胞、约1x103个细胞至约7x104个细胞、约1x103个细胞至约8x104个细胞、约1x103个细胞至约9x104个细胞、约1x103个细胞至约1x105个细胞、约1x103个细胞至约2x105个细胞、约1x103个细胞至约3x105个细胞、约1x103个细胞至约4x105个细胞、约1x103个细胞至约5x105个细胞、约1x103个细胞至约6x105个细胞、约1x103个细胞至约7x105个细胞、约1x103个细胞至约8x105个细胞、约1x103个细胞至约9x105个细胞、约1x103个细胞至约1x106个细胞、约1x103个细胞至约2x106个细胞、约1x103个细胞至约3x106个细胞、约1x103个细胞至约4x106个细胞、约1x103个细胞至约5x106个细胞、约1x103个细胞至约6x106个细胞、约1x103个细胞至约7x106个细胞、约1x103个细胞至约8x106个细胞、约1x103个细胞至约9x106个细胞、约1x103个细胞至约1x107个细胞、约1x103个细胞至约2x107个细胞、约1x103个细胞至约3x107个细胞、约1x103个细胞至约4x107个细胞、约1x103个细胞至约5x107个细胞、约1x103个细胞至约6x107个细胞、约1x103个细胞至约7x107个细胞、约1x103个细胞至约8x107个细胞、约1x103个细胞至约9x107个细胞、约1x103个细胞至约1x108个细胞、约1x103个细胞至约2x108个细胞、约1x103个细胞至约3x108个细胞、约1x103个细胞至约4x108个细胞、约1x103个细胞至约5x108个细胞、约1x103个细胞至约6x108个细胞、约1x103个细胞至约7x108个细胞、约1x103个细胞至约8x108个细胞、约1x103个细胞至约9x108个细胞或约1x103个细胞至约1x109个细胞。
[0253]
在一些情况下，本发明的非工程改造的富集的γδt细胞群、工程改造的富集的γδt细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1x106个细胞至约2x106个细胞、约1x106个细胞至约3x106个细胞、约1x106个细胞至约4x106个细胞、约1x106个细胞至约5x106个细胞、约1x106个细胞至约6x106个细胞、约1x106个细胞至约7x106个细胞、约1x106个细胞至约8x106个细胞、约1x106个细胞至约9x106个细胞、约1x106个细胞至约1x107个细胞、约1x106个细胞至约2x107个细胞、约1x106个细胞至约3x107个细胞、约1x106个细胞至约4x107个细胞、约1x106个细胞至约5x107个细胞、约1x106个细胞至约6x107个细胞、约1x106个细胞至约7x107个细胞、约1x106个细胞至约8x107个细胞、约1x106个细胞至约9x107个细胞、约1x106个细胞至约1x108个细胞、约1x106个细胞至约2x108个细胞、约1x106个细胞至约3x108个细胞、约1x106个细胞至约4x108个细胞、约1x106个细胞至约5x108个细胞、约1x106个细胞至约6x108个细胞、约1x106个细胞至约7x108个细胞、约1x106个细胞至约8x108个细胞、约1x106个细胞至约9x108个细胞、约1x106个细胞至约1x109个细胞、约1x106个细胞至约2x109个细胞、约1x106个细胞至约3x109个细胞、约1x106个细胞至约4x109个细胞、约1x106个细胞至约5x109个细胞、约1x106个细胞至约6x109个细胞、约1x106个细胞至约7x109个细胞、约1x106个细胞至约8x109个细胞、约1x106个细胞至约9x109个细胞、约1x107个细胞至约1x109个细胞、约1x107个细胞至约2x109个细胞、约1x107个细胞至约3x109个细胞、约1x107个细胞至约4x109个细胞、约1x107个细胞至约5x109个细胞、约1x107个细胞至约6x109个细胞、约1x107个细胞至约7x109个细胞、约1x107个细胞至约8x109个细胞、约1x107个细胞至约9x109个细胞、
约1x108个细胞至约1x109个细胞、约1x108个细胞至约2x109个细胞、约1x108个细胞至约3x109个细胞、约1x108个细胞至约4x109个细胞、约1x108个细胞至约5x109个细胞、约1x108个细胞至约6x109个细胞、约1x108个细胞至约7x109个细胞、约1x108个细胞至约8x109个细胞、约1x108个细胞至约9x109个细胞或约1x109个细胞至约1x10
10
个细胞。
[0254]
当施用抗体或其它活化剂(诸如与图1
‑
5中任一项所述的抗体结合相同或基本上相同的表位或与这些抗体竞争的药剂)时，正常剂量可以从每天约10ng/kg哺乳动物体重至高达100mg/kg哺乳动物体重或更大，优选约1μg/kg/天至10μg/kg/天，具体取决于施用途径。关于特定剂量和递送方法的指导在文献中提供；参见例如美国专利号4,657,760、5,206,344或5,225,212。预计不同的制剂将对不同的治疗化合物和不同的病状有效，靶向一个器官或组织的施用例如可能需要以不同于靶向另一器官或组织的方式进行递送。
[0255]
对于免疫相关疾病的治疗或减轻其严重程度，本发明的组合物的适当剂量将取决于如上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、是否施用药剂用于预防或治疗目的、既往治疗、患者的临床病史和对化合物的反应以及主治医生的判断。可将组合物一次或在一系列治疗中适当地施用给受试者。
[0256]
例如，取决于疾病的类型和严重程度，约1mg/kg至15mg/kg(例如，0.1
‑
20mg/kg)的活化剂(例如，多肽或抗体)是施用给受试者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用还是通过连续输注。典型的日剂量可能在约1mg/kg至100mg/kg或更大的范围内，具体取决于上述因素。对于在数天或更长时间内重复施用，取决于病症，治疗持续到期望的疾病症状抑制发生。然而，其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定进行监测。
[0257]
保存
[0258]
在一些实施方案中，可以将通过离体扩增体内活化或扩增的γδt细胞群获得的富集的γδt细胞群和/或它们的掺和物在冷冻介质中配制并放置在低温储存单元(诸如液氮冰箱(
‑
195℃)或超低温冰箱(
‑
65℃、
‑
80℃或
‑
120℃))中，用于长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年或至少5年。冷冻培养基可含有二甲亚砜(dmso)和/或氯化钠(nacl)和/或葡萄糖和/或硫酸葡聚糖和/或羟乙基淀粉(hes)，以及将ph维持在约6.0至约6.5之间、约6.5至约7.0之间、约7.0至约7.5之间、约7.5至约8.0之间或约6.5至约7.5之间的生理ph缓冲剂。可以使超低温保存的γδt细胞解冻，并如本文所述通过使用抗体、蛋白质、肽和/或细胞因子刺激来进一步加工。可以使超低温保存的γδt细胞解冻，并如本文所述通过病毒载体(包括逆转录病毒和慢病毒载体)或非病毒工具(包括rna、dna和蛋白质)进行基因修饰。在一些情况下，可通过本文所述的方法扩增非工程改造的γδt细胞，其中该方法包括体内扩增、基因修饰和超低温保存的步骤。
[0259]
因此，基因工程的和/或非工程改造的γδt细胞可以进一步超低温保存，以得到冷冻培养基中浓度为约至少101、102、103、104、105、106、107、108、109或至少约10
10
个细胞/ml，数量为至少约1、5、10、100、150、200、500瓶的细胞库。超低温保存的细胞库可以保持其功能，并且可以解冻，以及进一步刺激和扩增。在一些方面，可以刺激解冻的细胞，并在合适的封闭容器(诸如细胞培养物袋和/或生物反应器)中扩增，得到作为同种异体细胞产物的大量细胞。超低温保存的γδt细胞可以在低温储存条件下维持其生物学功能持续至少约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、15个月、18个月、20个月、24个月、30
个月、36个月、40个月、50个月或至少约60个月。在一些方面，制剂中不使用防腐剂。可将超低温保存的γδt细胞解冻，并作为同种异体的现成细胞产品施用给(输注给)多名患者。可通过施用本文所述的一种或多种选择性扩增γδt细胞的药剂在施用的受试者中扩增和/或维持输注的细胞。
[0260]
本文提及的所有出版物和专利均以引用的方式整体并入本文用于描述和公开目的，例如这些出版物中描述的构建体和方法可以结合本文所述的发明使用。本文讨论的出版物单独提供，因为它们在本专利申请的提交日期之前公开。本文不应理解为根据前述发明或出于任何其它原因，允许本文所述的发明人提前了解此类公开内容。
[0261]
实施例
[0262]
实施例1.通过用一种或多种选择性结合δ1tcr、δ2tcr和/或δ3tcr的药剂体内扩增γδt细胞来治疗肿瘤
[0263]
在异种移植小鼠模型中测试了施用γδt细胞活化剂对人γδt细胞的扩增和活化以及肿瘤治疗的影响。将不同的血液肿瘤细胞系(诸如raji、daudi、mino、nalm6、jvm
‑
2、hl
‑
60、molm
‑
13、k562、kg
‑
1a、mv4
‑
11、molt
‑
4或其它)和实体瘤细胞系(诸如hct116、结肠癌colo205、黑素瘤sk
‑
mel5、胰腺bcpc3或aspc
‑
1、乳腺癌诸如mda
‑
mb
‑
231、前列腺癌诸如pc3或lncap、肝癌hepg2和huh7等)皮下、腹膜内、原位或静脉内注射(例如，1x105‑
1x107个细胞)到scid/scid、nod
‑
scid、nsg、(taconic)、(charles river laboratories)或cd34(jackson labs)小鼠体内。每周两次通过卡尺或成像测量皮下、原位或播散性肿瘤生长。在肿瘤细胞施用当天，或当肿瘤形成(50
‑
200mm3)时，或如通过生物标志物δ1、δ2或δ3γδt细胞(1
‑
100x106)的出现所见，在不存在或存在细胞因子诸如il
‑
2、il
‑
15或il
‑
7的情况下，通过尾静脉或腹膜内注射将如本文所述的未工程改造或工程改造的细胞在pbs中过继转移到荷瘤小鼠中。将每组中的动物分成处理组(用不同的活化剂处理)或载体对照组。在γδt细胞过继转移之前或之后的预定时间点(例如在第
‑
1、0、1、2、3天或之后)，向动物施用载体对照或δ1、或δ2或δ3特异性活化剂。还测试了活化剂与氨基二膦酸盐(以相同或不同的剂量和/或给药方案)组合的效果。基于活性剂在小鼠中的半衰期和效力，在1个或多个周期内每周施用一次或两次活化剂，直至研究终止。活化剂可以每只动物0.001
‑
1mg的剂量每周给药1
‑
4次。
[0264]
使用cd34 hu
‑
nsg或通过在出生时移植cd34 祖细胞进行人源化的等效小鼠，说明了在存在或不存在人类异种移植肿瘤的情况下，活化剂对在此类模型动物中发育的内源性γδt细胞群的影响。
[0265]
实施例2.γδt细胞群的体内扩增
[0266]
活化剂用于例如在离体扩增后作为非工程改造或工程改造的细胞活化和扩增受试者的内源性γδt细胞和/或施用给受试者的γδt细胞的不同γδt细胞群。
[0267]
对于体内扩增γδ1t细胞群，受试者接受一种或多种δ1γδt细胞活化剂。对于体内扩增γδ2t细胞群，患者接受一种或多种δ2γδt细胞活化剂，而对于体内扩增γδ3t细胞群，患者接受一种或多种δ3γδ细胞活化剂。活化剂(诸如mab)被配制为通过任何能够将抗体递送至血液、肿瘤组织以及γδt细胞群驻留的其它组织的途径施用。施用途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮内等。治疗通常涉及通过可接受的施用途径重复施用活化mab制剂，通常剂量范围包括但不限于0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、
0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg/kg体重。一般来讲，每周10
‑
1000mg mab的剂量范围是有效的且耐受良好的。优选地，初始负荷剂量以90分钟或更长时间的输注形式施用。如果初始剂量耐受良好，则定期维持剂量以30分钟或更长时间的输注形式施用。如本领域技术人员所理解的，在特定情况下，各种因素可影响理想的剂量方案。此类因素包括例如所用mab的结合亲和力和半衰期、受试者体内循环或靶组织驻留γδt细胞的数量、mab同种型、期望的稳态抗体浓度水平、治疗频率，以及与本发明的体内扩增方法组合使用的化学治疗剂或其它药剂的影响，以及特定患者的健康状况。
[0268]
初始负荷剂量为大约4mg/kg患者体重iv，随后每周剂量为约2mg/kg iv的mab制剂代表了示例性给药方案。基于上面列出的考虑，每周、每两周或每月施用一种或多种活化剂，持续一个或多个治疗周期。非限制性优选的人类单位剂量为例如500μg
‑
1mg、1mg
‑
50mg、50mg
‑
100mg、100mg
‑
200mg、200mg
‑
300mg、400mg
‑
500mg、500mg
‑
600mg、600mg
‑
700mg、700mg
‑
800mg、800mg
‑
900mg、900mg
‑
1g或1mg
‑
700mg。在某些实施方案中，该剂量在2
‑
5mg/kg体重的范围内，例如随后每周剂量为1
‑
3mg/kg；0.5mg、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/kg体重，例如随后在两周、三周或四周内每周给药；0.5
‑
10mg/kg体重，例如随后在两周、三周或四周内每周给药；每周225、250、275、300、325、350、375、400mg m2身体面积；每周1
‑
600mg m2身体面积；每周225
‑
400mg m2身体面积；这些剂量之后可每周给药，持续2、3、4、5、6、7、8、9、19、11、12周或更多周。
[0269]
将剂量和施用频率选择成支持相关γδt细胞群的扩增或维持。在施用活化剂后1、2、3、7、14或28天测试对患者循环γδt细胞的频率、表型和活化状态的影响。另外，可测试对αβt细胞、nk细胞和/或树突细胞的频率、表型和活化状态的影响。
[0270]
在一些治疗方案中，将活化剂与il
‑
2或其它细胞因子(包括但不限于il
‑
15)一起施用。当将活化剂与氨基二膦酸盐一起施用时，在施用活化剂之前、与施用活化剂共同或在施用活化剂之后施用氨基二膦酸盐(诸如帕米膦酸或唑来膦酸)。
[0271]
基于临床反应评估活化剂的治疗效果。例如，对于实体瘤的治疗，可使用recist标准。在治疗开始后1、3、6、9和12个月测量反应。使用生命体征、心电图、临床实验室测试结果和不良事件来评估安全性。当对受试者进行研究时，在基线和每8周进行肿瘤评估，诸如计算机断层摄影术(ct)扫描。从每个受试者收集连续血液样品，以确定是否存在输注的细胞。用于功效和安全性数据分析的所有统计检验都是双向的，在0.05的显著性水平下进行，并计算90％置信区间。
[0272]
所描述的研究在多中心研究中进行，并且对患有局部晚期和/或转移性血液癌或实体癌的受试者进行，这些受试者先前已接受治疗或对其没有有效的标准治疗可用。非工程改造或工程改造的γδt细胞(1x108、2x108、5x108和1x109—每个剂量水平的一个队列)在4小时内静脉内施用一次，或每四周在每个周期的第1天施用。
[0273]
实施例3.γδt细胞群的体内扩增
[0274]
将从taconic(nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1sug tg(cmv
‑
il2/il15)1
‑
1jic/jictac)获得的表达hil
‑
15转基因的nog非荷瘤小鼠用如wo 2017/197347或wo 2019/099744中所述扩增的vδ1、vδ2或vδ3γδcar
‑
t细胞接种。扩增后将细胞超低温保存，并在施用到含有il
‑
2的细胞培养基中前一天解冻。在施用当天，按照制造商说明用celltr ace violate将细胞标记30分钟，并以20x106个细胞/动物静脉内给药。一部分动物还在施用细胞前4
‑
5小时接
受了非特异性鼠igg节分的腹膜内注射。
[0275]
第2天，细胞施用后，如所示向动物施用vδ
‑
亚型特异性活化剂。对照动物未施用活化剂。第4天或第5天，对动物进行放血，并对循环人类γδt细胞进行鉴定、活化标志物和增殖表征。在细胞施用后第7天，处死动物并收获各种器官。使用gentlemax(miltenyi)装置分解脾和骨髓，并通过流式细胞术分析单细胞悬液。
[0276]
如图6所示，在两种剂量的活化剂(每只动物3μg和10μg)下，与对照未处理动物相比，在循环和肺中检测到的总人类cd45
细胞均减少。在测试的其它组织(骨髓、脾)中发现的细胞数量没有显著减少。
[0277]
如图7所示，在用活化剂处理后第5天，血液、骨髓和脾中的细胞已经增殖，如通过由于在两种剂量水平下细胞后代中染料稀释导致的celltrace violet图谱向左移向降低的荧光强度所证明的。还检测到用d1
‑
35 mab活化剂处理的循环细胞中的cd137上调，从而提供了进一步的活化指示。
[0278]
如图8所示，与同时施用igg级分和d1
‑
35的动物(第2行)相比，施用d1
‑
35活化mab但未施用igg级分的动物(第3行)表现出增加的活化。类似地，活化剂d1
‑
08mab(第5行)(一种结合不同于d1
‑
35的表位的vδ1特异性抗体)也具有体内活化特性，并诱导细胞增殖，如通过celltrace violet所检测到的。相比之下，将d1
‑
35抗体的同种型更改为higg4显著削弱了mab诱导细胞增殖的能力(第4行)。higg4表现出对fc受体显著降低的亲和力。因此，诱导细胞增殖的能力削弱可能是由于对fc受体的固定化减少。不希望受理论束缚，本发明人假设表达fc受体的细胞表面上的固定化增加了施用的抗体对施用的γδt细胞提供的活化作用，推测是通过与固定化抗体交联增加tcr聚集实现的。本发明人进一步假设，这种增加的tcr聚集也可使用具有高价(例如高于igg的价)的抗原结合部分来实现。因此，本发明的一个目的是例如单特异性的高度多价γδt细胞活化剂。例如，可通过使γδt细胞与例如三价、四价、五价等活化剂接触来获得稳健的γδt细胞活化、扩增和/或维持。在一些情况下，接触在体内进行(例如，通过向受试者施用活化剂)。
[0279]
如图9a
‑
b所示，在分别用d2
‑
37和d3
‑
23 mab处理的动物的骨髓和脾中检测到了vδ2和vδ3细胞的增殖，如通过cellterace violet染料稀释所检测到的。
[0280]
***
[0281]
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是将对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。本领域的技术人员可以对其做出许多变形、改变和替换而不脱离本发明。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可在本发明的实践中采用。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且从而涵盖在这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
再多了解一些
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