桑叶多糖在制备减肥药物或减肥保健品中的应用的制作方法

1.本发明属于桑叶多糖的技术领域，具体涉及桑叶多糖在制备减肥药物或减肥保健品中的应用。


背景技术：

2.在几乎所有年龄段和社会经济群体中肥胖率都在急剧上升，肥胖已逐渐成为全球性的健康问题。根据最新统计数据，到2025年，全球男性肥胖症的患病率将达到18％，女性将达到21％以上。大量的流行病学和临床研究表明，血脂过多积累被认为是代谢综合征的因果因素，与血脂异常、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和高血压相关，它们也是心血管疾病、2型糖尿病和癌症等的危险因素。因此，预防或减少肥胖以获得与健康相关的更好的生活质量非常重要。
3.胰脂肪酶是脂质吸收过程中的关键脂肪酶。在脂肪酶中，胰脂肪酶可水解50％
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70％的总膳食脂肪，因此，通过抑制胰脂肪酶的表达/活性来抑制饮食脂肪的消化和吸收是预防和治疗肥胖的有效方法。目前，奥利司他(orlistat)是唯一获得fda批准的非作用于中枢神经系统的肥胖症治疗药，然而奥利司他具有某些令人不愉快的胃肠道副作用，限制了其患者的依从性，因此迫切需要探寻安全、有效的预防和治疗肥胖的策略。
4.桑叶，在古代亚洲和现代世界中具有丰富的资源，是药食同源的天然产品之一。桑叶通常用于治疗糖尿病，高血压和动脉粥样硬化，中药本草籍著中还记录了其抗衰老，预防肝肾损害和改善视力等的作用。这主要是由于其具有黄酮、生物碱、多糖、多酚等多种生物活性成分。目前国内外对桑叶治疗糖尿病方面有较全面的研究，但尚未发现有关从桑叶中提取截留30
‑
80kda桑叶多糖抑制胰脂肪酶，从而防治肥胖的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种桑叶多糖在制备减肥药物或减肥保健品中的应用。
6.本发明的技术方案概述如下：
7.桑叶多糖在制备减肥药物或减肥保健品中的应用，所述桑叶多糖用下述方法制成：
8.1)将冻干桑叶粉碎；
9.2)按照料液比1:5～10的比例，加入体积浓度为60％～90％的乙醇水溶液，浸泡24～30h，抽滤；
10.3)重复步骤2)2～3次；固体干燥得到脱脂桑叶粉末；
11.4)按照料液比1:5～10的比例，将所述脱脂桑叶粉末分散于蒸馏水中，70℃～100℃冷凝回流2～3h，抽滤得到桑叶水提液；
12.5)将桑叶水提液浓缩至10％～15％，加入3～5倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，于4℃静置18～24h，离心，弃上清，冻干得到桑叶粗多糖；
13.6)将桑叶粗多糖通过sevage法脱蛋白3～5次，冻干；
14.7)将步骤6)获得的冻干粉溶于水，超滤，得到截留30～80kda的桑叶多糖。
15.本发明的优点：
16.实验证明，本发明提取获得截留30
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80kda的桑叶多糖具有强胰脂肪酶抑制活性。
17.实验证明，本发明制备的桑叶多糖可抑制体内胰腺相关消化酶表达水平，从而减少高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脂质吸收，具有良好的减肥功效。
附图说明
18.图1为不同分子量桑叶多糖(浓度为1～10mg/ml)对胰脂肪酶抑制率。
19.图2为30～80kda桑叶多糖对胰脂肪酶(pl)、胰脂肪酶相关蛋白2(plrp2)和胰腺磷脂酶a2(pla2)的mrna和蛋白表达水平影响。
20.图3为30
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80kda桑叶多糖对脂质代谢的影响。
具体实施方式
21.下面结合具体实施方式，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不限于此。
22.实施例1
23.桑叶多糖的制备，包括如下步骤：
24.1)将冻干桑叶粉碎；
25.2)按照料液比1:8的比例，加入体积浓度为75％的乙醇水溶液，浸泡28h，抽滤；
26.3)重复步骤2)2次；固体干燥得到脱脂桑叶粉末；
27.4)按照料液比1:8的比例，将脱脂桑叶粉末分散于蒸馏水中，90℃冷凝回流2.5h，抽滤得到桑叶水提液；
28.5)将桑叶水提液浓缩至13％，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，于4℃静置20h，离心，弃上清，冻干得到桑叶粗多糖；
29.6)将桑叶粗多糖通过sevage法脱蛋白4次，冻干；
30.7)将步骤6)获得的冻干粉溶于水，超滤，截留不同分子量多糖，使成<30kda，30～80kda和>80kda三个不同分子量的桑叶多糖。
31.实施例2
32.桑叶多糖的制备，包括如下步骤：
33.1)将冻干桑叶粉碎；
34.2)按照料液比1:5的比例，加入体积浓度为90％的乙醇水溶液，浸泡24h，抽滤；
35.3)重复步骤2)2次；固体干燥得到脱脂桑叶粉末；
36.4)按照料液比1:5的比例，将所述脱脂桑叶粉末分散于蒸馏水中，70℃冷凝回流3h，抽滤得到桑叶水提液；
37.5)将桑叶水提液浓缩至10％，加入3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，于4℃静置18h，离心，弃上清，冻干得到桑叶粗多糖；
38.6)将桑叶粗多糖通过sevage法脱蛋白3次，冻干；
39.7)将步骤6)获得的冻干粉溶于水，超滤，得到截留30～80kda的桑叶多糖。
40.实施例3
41.桑叶多糖的制备，包括如下步骤：
42.1)将冻干桑叶粉碎；
43.2)按照料液比1:10的比例，加入体积浓度为60％的乙醇水溶液，浸泡30h，抽滤；
44.3)重复步骤2)3次；固体干燥得到脱脂桑叶粉末；
45.4)按照料液比1:10的比例，将所述脱脂桑叶粉末分散于蒸馏水中，100℃冷凝回流2h，抽滤得到桑叶水提液；
46.5)将桑叶水提液浓缩至15％，加入5倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，于4℃静置24h，离心，弃上清，冻干得到桑叶粗多糖；
47.6)将桑叶粗多糖通过sevage法脱蛋白5次，冻干；
48.7)将步骤6)获得的冻干粉溶于水，超滤，得到截留30～80kda的桑叶多糖。
49.体外试验：
50.将实施例1获得的三个不同分子量的桑叶多糖配成不同浓度的水溶液，见图1，各取5ml，加入0.75mg/ml的胰脂肪酶水溶液1ml和花生油1ml；以不加桑叶多糖水溶液的反应体系为空白。在37℃反应1h，然后在沸水中放置10min终止反应。以质量浓度0.5％酚酞为指示剂(酚酞指示剂的溶剂为体积浓度95％的乙醇水溶液)，用0.05m naoh水溶液滴定至红色为滴定终点。以胰脂肪酶抑制率(％)作为桑叶多糖活性的评价标准。测试结果如图1所示。实验证明，实施例2、实施例3制备的桑叶多糖对胰脂肪酶的抑制率与实施例1相似。
51.体内试验方法如下：
52.以60只雄性c57小鼠为研究对象(4周龄，18～20g)，每10只为一组，分别为：
53.空白对照组(简称nd组)
54.模型组(简称hfd组)
55.阳性药奥利司他组(orlistat)
56.实施例1制备的截留30～80kda的桑叶多糖的低剂量组(200mg/kg/day，简称mlp
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200)
57.实施例1制备的截留30～80kda的桑叶多糖的中剂量组(400mg/kg/day，简称mlp
‑
400)
58.实施例1制备的截留30～80kda的桑叶多糖的高剂量组(800mg/kg/day，简称mlp
‑
800)
59.空白对照组用含10％脂质的普通饲料(斯贝福)喂养；
60.模型组和各给药组均用含60％脂质的高脂饲料(华阜康，h10060)喂养。
61.将实施例1制备的截留30
‑
80kda的桑叶多糖溶于生理盐水配制样品溶液，分别按200、400和800mg/kg/day的剂量灌胃给药；
62.空白对照组给予相同体积的生理盐水；
63.阳性对照组，奥利司他加入相同体积的生理盐水，按25mg/kg/day的剂量灌胃给药。
64.8周后，收集小鼠的胰腺组织，通过检测胰脂肪酶(pl)、胰脂肪酶相关蛋白2(plrp2)和胰腺磷脂酶a2(pla2)的mrna和蛋白表达水平，研究探索桑叶多糖对胰脂肪酶的影响，测试结果如图2所示。收集新鲜肝脏和粪便样品，检测肝脏样品总胆固醇(tc)、甘油三
酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl
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c)和高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)的含量，检测粪便样品tc、tg的含量，进而评估桑叶多糖对脂质吸收的影响，测试结果如图3所示。
65.由图1可以看出，在10mg/ml的浓度下，分子量为30
‑
80kda的桑叶多糖对胰脂肪酶活性的抑制率可高达72.50％。
66.由图2可以看出，与普通饲料组相比，高脂饲料喂养显著上调了包括pl，plrp2和pla2在内的关键基因的mrna表达水平(图2a
‑
c)，以及pl和plrp2的蛋白质表达水平(图2d
‑
g)。用桑叶多糖处理可降低pl，plrp2和pla2的表达水平。β
‑
actin作为内参。
67.注：与nd组比较，*p＜0.05；与hfd组，
#
p＜0.05。
68.由图3可以看出，高脂饲料喂养的小鼠，肝脏中tc、tg、ldl
‑
c的含量明显上升，hdl
‑
c水平明显下降。给予桑叶多糖后，尤其是高剂量治疗，小鼠肝脏中tc、tg、ldl
‑
c的含量出现显著下降趋势，hdl
‑
c水平上调(图3a
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d)。同时，高脂饲料喂养的小鼠，桑叶多糖治疗组小鼠粪便中tc、tg含量明显升高(图3e
‑
f)，表明桑叶多糖干扰了饮食脂质的吸收，促进了脂质的排出。
69.注：与nd组比较，*p＜0.05；与hfd组，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01。
70.综上，本发明制备的桑叶多糖具有较强的胰脂肪酶抑制活性，并可降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠的胰消化酶表达水平，调节脂质代谢，抑制脂质吸收。为桑叶多糖的应用提供了新的方向，也为开发防治肥胖症的药物方案/饮食疗法提供了新的来源。