一种用于共同培养云杉花墨天牛和松材线虫的培养基及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物培养技术领域，尤其涉及一种用于共同培养云杉花墨天牛和松材线虫的培养基及其制备方法和应用。


背景技术：

2.松材线虫病是由松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)引起的，一种林业上最具危险性、毁灭性的病害。树木一旦受到松材线虫侵害，短期内就会死亡且防治困难，因此被称为松树的“癌症”。松材线虫病的蔓延主要通过墨天牛属(monochamus)昆虫携带并传播病原松材线虫得以实现。松墨天牛(monochamus alternatus)是松材线虫的主要传播媒介，2018年云杉花墨天牛(monochamus saltuarius)才被确认为松材线虫的新传播媒介，因此，其生物学特性和与松材线虫之间的发生规律及机理亟待研究和明确。
3.媒介天牛和松材线虫在长期的生物进化过程中，逐渐形成了一种紧密的“互惠共生”的关系。天牛羽化时，蛹室周围的扩散型三龄松材线虫转变为扩散型四龄线虫进入天牛的气管，随天牛羽化飞出，并沿天牛在寄主上取食和产卵产生的伤口侵入松树体内，繁殖危害。由于云杉花墨天牛1年1代，翌年4月在蛹室内化蛹，5月底
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6月初为羽化高峰期，8月末逐渐绝迹，这使得对松材线虫及其媒介昆虫传播生物学的相关研究受到了时间和季节限制。因此，实现人工培养携带松材线虫的媒介昆虫将大大加快传播生物学的分析。
4.目前有关携带松材线虫的天牛的培养方法报道较少，携带松材线虫的云杉花墨天牛的培养方法尚未报道，已有的媒介天牛培养研究中，takuya aikawa(1997)利用人工蛹室培养松墨天牛，将botrytis cinerea或ophiostoma minus真菌接入长7.5cm，直径4cm的松木块用以培养松材线虫，待线虫长满后接入松墨天牛幼虫，但该方法的培养基易污染，需要多次灭菌，操作繁琐；katsumi togashi(2004)采用大麦
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木屑培养基培养b.cinerea或o.minus真菌，进而接种松材线虫和松墨天牛幼虫，但可能由于所接入的天牛为越冬后的天牛，该实验中天牛存活率较低。因此，在不受季节的限制下，通过室内饲养获得携带松材线虫的云杉花墨天牛，已成为研究松材线虫传播生物学中亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于共同培养云杉花墨天牛和松材线虫的培养基及其制备方法和应用。
6.第一方面，本发明提供一种用于共同培养云杉花墨天牛和松材线虫的培养基，包括带壳大麦粒和红松木屑；
7.所述带壳大麦粒和红松木屑的质量比为1:(0.4～0.6)。
8.进一步地，还包括蒸馏水，所述带壳大麦粒、红松木屑和所述蒸馏水的比例为10g:4g:30ml～20g:12g:60ml。
9.进一步地，所述培养基中所述红松木屑位于所述带壳大麦粒上层。
10.第二方面，本发明进一步提供所述培养基的制备方法，包括：
11.混合带壳大麦粒、红松木屑和蒸馏水，高压灭菌。
12.进一步地，所述制备方法包括：
13.取红松木屑加入蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20～30min，静置24h后使用；
14.取带壳大麦粒加入蒸馏水，上层放入经过灭菌，且静置24h后的红松木屑，在240ml组培瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
15.本发明进一步提供所述培养基在培养云杉花墨天牛幼虫、云杉花墨天牛蛹或云杉花墨天牛成虫中的应用。
16.本发明进一步提供所述培养基在培养携带松材线虫的云杉花墨天牛中的应用。
17.进一步地，所述应用为在所述培养基中接种灰葡萄孢真菌，在25～28℃条件下黑暗培养8～12天后接种松材线虫；在25～28℃条件下黑暗培养21～28天后放入云杉花墨天牛五龄幼虫；继续培养至云杉花墨天牛五龄幼虫化蛹、羽化。
18.进一步地，所述云杉花墨天牛五龄幼虫为越冬期的老熟幼虫或完成越冬后的老熟幼虫。
19.本发明具备如下有益效果：
20.本发明提供了一种用于共同培养云杉花墨天牛和松材线虫的培养基配方及其制备方法，该培养基可以快速大量繁殖松材线虫，提高松材线虫产量和质量；选择240ml组培瓶，可以为松材线虫和云杉花墨天牛培养提供充足的空间和氧气，相比于培养皿，更有利于存活；培养基中上层覆盖的木屑成分为天牛提供了寄主植物环境及食物，且避免天牛直接与真菌和大麦接触，减少了大麦和真菌对天牛的影响，提高天牛存活率；选择接入越冬期的云杉花墨天牛幼虫，一方面其经历了低温驯化，可以快速化蛹，另一方面该时期的幼虫处于休眠状态，易存活。该培养基成本低廉、制作简便，可以应用于松材线虫实验室的人工培养。
附图说明
21.图1为本发明实施例3提供的接种初始量不同的培养基内松材线虫生长情况示意图；
22.图2为本发明实施例3提供的接种初始量为5000条松材线虫的扩散型线虫生长情况示意图。
具体实施方式
23.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
24.实施例1共同培养松材线虫和云杉花墨天牛的培养基筛选和主要成分的确定
25.将5000条松材线虫分别接种至长满灰葡萄孢菌的木块
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pda培养基、木块
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大麦培养基、木屑
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pda培养基、木屑
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大麦培养基内，放置在25℃培养箱内培养21天，观察记录每个培养基内松材线虫的生长情况。
26.木块的制备：将健康红松锯成2cm*2cm*7cm的小木块，中间挖一个直径1cm，深5cm的洞，作为人工蛹室。将人工蛹室放入蒸馏水中浸泡24小时，移入240ml组培瓶，121℃高压蒸汽灭菌30min，室温下放置24h，备用。
27.木屑的制备：在240ml组培瓶中加入6g健康去皮红松的木屑，10ml蒸馏水，121℃高
压蒸汽灭菌20min，室温下放置24h，备用。
28.木块
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pda培养基：46g马铃薯葡萄糖琼脂培养基粉，加蒸馏水1000ml，煮沸至澄清，倒入锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。在制备好的木块表面均匀的淋一层pda，待其凝固后，接种灰葡萄孢菌，25℃培养箱内黑暗培养7
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10天。
29.木块
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大麦培养基：240ml组培瓶中加入10g带壳大麦粒，20ml蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，将制备好的木块放入大麦中，接种灰葡萄孢菌，25℃培养箱内黑暗培养7
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10天。
30.木屑
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pda培养基：46g马铃薯葡萄糖琼脂培养基粉，加蒸馏水1000ml，煮沸至澄清，倒入锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。将灭好菌的pda倒入木屑中10ml，
31.凝固后，接种灰葡萄孢菌，25℃培养箱内黑暗培养7
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10天。
32.木屑
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大麦培养基：在240ml组培瓶中加入10g带壳大麦粒，20ml蒸馏水，将制备好的的6g松木屑倒入上层，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，将灰葡萄孢真菌接种于培养基的大麦层上，25℃恒温培养箱内黑暗培养10天。
33.不同培养基对线虫生长的影响结果如表1所示，用木块制作的培养基由于木块灭菌难以彻底，污染情况严重。木屑
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pda培养基、木屑
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大麦培养基培养至第14天，利用贝曼漏斗法对松材线虫繁殖量进行统计。木屑
‑
pda培养基的营养成分不如大麦充足，因此木屑
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pda培养基培养的线虫数量明显低于木屑
‑
大麦培养基。由此认为对于培养基成分的选择，木屑优于木块，大麦优于pda。
34.表1不同培养基对松材线虫生长的影响
[0035][0036]
实施例2确定培养基内接种的云杉花墨天牛的最佳接种期
[0037]
本实施例研究接种不同时期的天牛幼虫对天牛化蛹率和存活率的影响，具体步骤如下：
[0038]
分别于2020年10月、11月、12月，次年1月、4月，在辽宁省抚顺市大伙房林场采集云杉花墨天牛老熟幼虫，用75％乙醇对幼虫体表进行消毒，放入已经接种5000条松材线虫且培养25天的培养基中，设置不同条件培养，记录接种的云杉花墨天牛幼虫的发育历期，统计死亡数、化蛹率和羽化率。
[0039]
将10月份采集的越冬前的五龄幼虫，11月、12月采集的越冬期的五龄幼虫，4月份采集的越冬后的五龄幼虫，进行25℃黑暗条件培养，1月采集的越冬期幼虫放置于室外，模拟野外环境，零下15℃至零上22℃变温培养，经观察和记录，接种不同发育时期的云杉花墨天牛平均发育历期见表2，10月份越冬前的幼虫死亡率较高，化蛹率低且化蛹时间长；11月、12月、1月越冬期的幼虫化蛹率和羽化率高；4月越冬后的幼虫死亡率高，化蛹率低；不同越冬期的化蛹率经方差检验差异显著(p<0.05)；不同越冬期的羽化时间经方差检验相近，无差异。12月采集的幼虫作为接种对象化蛹率和羽化率最高，化蛹天数平均为7天，羽化天数平均为11天；且室内培养与野外变温培养相比，发育时间明显缩短。4月份采集的越冬后幼
虫作为接种对象死亡率较高，化蛹率最低，仅6.74％。因此，为保证天牛的高存活率，运用此培养方法的天牛最佳接种时期为越冬期幼虫。
[0040]
表2接种不同时期的天牛幼虫的发育历期表
[0041][0042]
注：表中
a
数值为平均值
±
标准误；不同字母代表在0.05水平上具有显著差异。
[0043]
实施例3优化接种培养方法
[0044]
1、接种初始量不同的培养基内松材线虫生长情况
[0045]
将500条和5000条松材线虫分别接种至已经长满灰葡萄孢真菌的培养基中，放置在25℃培养箱内黑暗培养，分别在培养第21天、28天、31天、35天、39天、45天和50天后，计算每个培养基内的线虫数量。
[0046]
由图1可知，接入培养基的松材线虫数量多少对线虫增长量存在明显的影响。当接种数量在5000条时，培养至第三周达到最高值，达203566.67条，与接入500条的培养基最高量呈显著性差异(p＜0.05)。由于培养基内空间和资源有限，线虫在达到最高值后开始死亡，数量开始减少，当培养至45天后，最初接入500条和接入5000条松材线虫的培养基数量接近。但接入500条松材线虫的培养基总数量偏小，且始终呈现缓慢递减趋势，接入5000条松材线虫的培养基在28天后出现稳定和平缓的趋势，且数量较大，因此选择接入5000条松材线虫效果较好。
[0047]
2、接种初始量为5000条松材线虫的扩散型线虫生长情况
[0048]
将5000条松材线虫接种在长满灰葡萄孢真菌的培养基上，放入培养箱25℃黑暗培养，在第14、21、28、31、35、39、42、49天分离松材线虫，观察松材线虫在培养基内，时间对线虫增长量的影响。
[0049]
结果如图2所示，第14、21、28、31、35、39、42天时，松材线虫总数量分别为77616.67条、203566.67条、34525.00条、56512.50条、57500.00条、13666.67条、10718.67条、10016.67条，繁殖倍数分别为15.52倍、40.71倍、6.91倍、11.30倍、11.50倍、2.73倍、2.14倍、2.00倍。由此看出，培养前两周，松材线虫数量始终处于增加的状态，第三周数量急剧减少，第四周保持在稳定状态，此后缓慢减少。扩散型三龄线虫的生长趋势相似，第21天达到峰值33033.33条，此后数量开始减少，第28天之后下降趋势缓慢，第35天之后数量少于5000条。因此，为保证松材线虫的高密度且稳定的状态，天牛最佳接种时间应在培养第21
‑
28天内。
[0050]
3、云杉花墨天牛体内携带松材线虫情况
[0051]
本实施例研究不同羽化天数下，天牛体内携带的松材线虫情况，具体步骤如下：
[0052]
优化的共同培养松材线虫和云杉花墨天牛的培养基，包括以下组分：6g健康红松木屑、10g带壳大麦粒、30ml蒸馏水；接种的松材线虫量为5000条；接种的天牛为越冬期内12
月份采集的天牛。
[0053]
制作步骤具体如下：6g红松木屑，10ml蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20min，室温下放置24h，备用；在240ml组培瓶中加入10g带壳大麦粒，20ml蒸馏水，将灭好菌的松木屑倒入上层，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，4℃保存备用；将灰葡萄孢真菌接种于培养基的大麦层上，25℃恒温培养箱中黑暗培养10天，待菌丝长满大麦粒，接种10000头/ml的消过毒的松材线虫悬浮液0.5ml；将接种好松材线虫悬浮液的培养基放置在25℃恒温培养箱中黑暗培养25天，将12月份采集的越冬期的云杉花墨天牛幼虫用75％乙醇对幼虫体表进行消毒，放入培养基中，25℃黑暗培养，直至羽化为成虫。将羽化不同天数的天牛用蒸馏水冲洗表面，再用纱布擦拭干净，重复三次，洗去体表的线虫；将天牛剪碎，放入75mm玻璃培养皿中，用蒸馏水浸泡12
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24个小时，吸取浸泡液滴到载玻片上，利用光学显微镜观察计数，以确定天牛体内松材线虫的携带量。
[0054]
结果如表3所示，天牛在培养基内羽化成虫后，体内均携带扩散型四龄松材线虫，平均体内携带量可达1585头，最多可达6690头。
[0055]
表3羽化的天牛成虫体内携带松材线虫情况
[0056][0057][0058]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。