一种小麦增加穗长基因HL1及其应用的制作方法

一种小麦增加穗长基因hl1及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，涉及一种小麦增加穗长基因hl1及其应用。


背景技术：

2.小麦是我国主要的粮食作物之一，其产量的高低关系到国家粮食安全，提高产量一直是小麦育种家的最主要目标。穗是小麦籽粒着生的地方，与产量构成要素中的粒重和穗粒数密切相关，直接影响产量，在品种选育过程中历来受到育种家的关注和重视。理想的穗部形态对提高小麦单产具有重要作用。小穗密度是穗的一个重要性状，是决定穗型的重要因素(donmez et al.2001；kumar et al.2007)。此外，较小的小穗密度可以降低赤霉病的严重度(suzuki et al.2012；jones et al.2018；孙阳阳等，2017)。因此了解小穗密度的遗传基础及形成的分子机制对小麦遗传改良、促进产量提高具有重要意义。
3.小穗密度是多基因控制的数量性状，其遗传机制复杂，主要受加性效应基因控制，广义遗传率高达69.7
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97.9％(heidari et al.2011；xu et al.2014；zhai et al.2016)。目前小麦小穗密度的研究多集中在qtl定位阶段，在21条染色体上都检测到控制小穗密度的qtl(sourdille et al.2000,2003；marza et al.2006；ma et al.2007；heidari et al.2011；mazen et al.2014；xu et al.2014；zhai et al.2016；liu et al.2018)。控制小穗密度的qtl既有微效qtl也有主效qtl，其解释的表型变异从2.0％到29.9％不等。
4.qcpt.nau
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2d是本实验室前期利用南大2419
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望水白重组自交系群体在2ds染色体上检测到的一个控制小穗密度的主效qtl，被定位于0.9cm的xcfd53
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dg371之间(wu et al.2013)。该位点在多个种质中都被检测到与小穗密度相关，可以解释高达29.9％的表型变异(sourdille et al.2003；heidari et al.2011；zhai et al.2016；chai et al.2018)。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦控制穗长的基因hl1。
6.本发明的又一目的是提供hl1基因的应用。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
8.确定hl1基因是控制穗长的基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.含有小麦控制穗长基因hl1的重组表达载体。
10.所述的重组表达载体,优选出发载体为hl1基因在自身启动子驱动下的载体。
11.本发明所述的小麦控制穗长基因hl1在小麦品种改良中的应用；优选所述的基因在增加小麦穗长中的应用。
12.本发明所述的重组表达载体在小麦品种改良中的应用；优选所述的重组表达载体在增加小麦穗长中的应用。
13.有益效果：
14.我们进一步通过次级分离群体将该qtl定位于xwgrc1257
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xwgrc1366区间，与
xmag9642和xwgrc1808共分离，该区间的物理距离约为100kb。通过亲本间序列比较，确定hl1是qcpt.nau
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2d的候选基因。本发明提供了一种新的小麦增加穗长的基因hl1。通过转基因将本发明提供的增加穗长基因hl1转入小麦中,可以增加小麦的穗长。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此该基因的存在不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。
附图说明
15.图1转基因小麦的pcr检测。
16.其中a为阳性对照携带有hl1基因的质粒；b为转hl1基因的绵阳99
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323；c为转基因实验受体材料绵阳99
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323，图2转基因小麦的穗
17.其中左为转基因实验受体材料绵阳99
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323，右为转hl1基因的绵阳99
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323
具体实施方式
18.根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
19.实施例1：hl1基因的确定。
20.将绵阳99
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323与携带qcpt.nau
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2d的绵阳99
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323近等基因系(wu et al.2014)进行杂交，构建次级f2群体，利用cfd53(seq id no.2/seq id no.3)和dg371(seq id no.4/seq id no.5)标记进行筛选，获得在这两个标记之间发生重组的个体。根据重组体的基因型和穗长表型，将qcpt.nau
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2d限定在xwgrc1257(seq id no.6/seq id no.7)和xwgrc1366(seq id no.8/seq id no.9)之间的100kb的区间内。携带qcpt.nau
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2d的绵阳99
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323近等基因系的该区间仅存在一个有完整转录本的编码基因，长2427bp，即hl1。对应于绵阳99
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323相同的位置，基因长度为2426bp。与近等基因系中的hl1相比，绵阳99
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323基因序列有一个snp和一个indel变异，两个变异位于相邻位置，该变异导致绵阳99
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323中翻译提前终止。由此推断hl1是qcpt.nau
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2d的候选基因。
21.实施例2：编码ta fhb1蛋白的cdna序列的获得。
22.以分蘖期南大2419的小穗cdna作为模板，用英俊公司的trizol试剂盒提取小麦穗部的总rna，采用promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cdna。用引物p1(seq id no.10/seq id no.11)进行pcr扩增，扩增体系为25μl,包括5ng模板,f和r引物各5pmol,datp,dttp,dctp和dgtp各5nmol,37.3nmol mgcl2,0.5单位的dna聚合酶,1x pcr缓冲液。扩增的程序是:94℃变性3分钟；30个循环,94℃变性20秒,60℃退火30秒,72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。通过pcr扩增,获得了包含开放读码框的2427bp的核苷酸序列,将该核苷酸与t
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载体在16℃连接30min,连接体系为10μl，包括t
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载体1μl，pcr产物4μl，连接酶1μl，连接酶缓冲液1μl，ddh2o 3μl。连接产物通过42℃热击40秒，转化到大肠杆菌细胞中，送至华大基因公司测序，所得序列如seq id no.1所示。
23.实施例3：转hl1基因小麦的穗长增加
24.以南大2419基因组dna作为模板，利用引物p2(seq id no.12/seq id no.13)进行pcr扩增，将扩增得到的pcr产物用限制性内切酶hindiii进行酶切后，与经过同样限制性内
切酶进行酶切的pucbs表达载体连接，构成hl1基因枪稳定转化的表达载体。构建好的载体通过热击法转化到dh5α大肠杆菌菌株中，通过含有50μg/ml的卡那霉素的lb培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1993年weeks发表在plantphysiol第102期1077
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1084页上的文章中的材料与方法，以幼胚短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体，采用基因枪法将自身启动子控制下的hl1基因导入到短穗小麦绵阳99
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323中，将基因枪转化后的愈伤放置于含有20mg/lg418的ms培养基上进行筛选，待分化出幼苗后一次在30mg/l、40mg/l的ms培养基上筛选，最后获得的再生苗移入含有1mg/lnaa的ms培养基生根，待根长出后剪取叶片，提取dna进行pcr检测(图1)，获得携带hl1的转基因小麦。转基因小麦的穗长明显增加(图2)。