水稻稻瘟病抗性基因Pid3-A4的KASP分子标记开发及其应用的制作方法

水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4的kasp分子标记开发及其应用
技术领域
1.本发明涉及电感器水稻育种技术领域，特别涉及一种水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4的kasp分子标记开发及其应用。


背景技术：

2.水稻是世界上栽培面积和总产量仅次于小麦的重要作物。我国的水稻的耕作面积仅次于印度，但是稻谷总产量居于世界产稻国家之首。水稻所结果实为大米，可作为粮食食用，还可以酿酒、制糖作为工业原料，还可以酿酒、制糖作工业原料，其稻壳可以作为牲畜饲料，其稻草可以做成粗麻绳、草席、草纸等，其稻杆还可以制作板材、生产肥料等。
3.瘟病又名稻热病、火烧瘟、叩头瘟等，是水稻最为严重的病害之一，每年因稻瘟病损失的水稻为其年产量的10％～30％(skamnioti p,gurr s j.against the grain:safeguarding rice from rice blast disease[j].trends in biotechnology,2009,27(3):141
‑
150.)。因此，培育抗稻瘟病品种是保障水稻稳产、增产的重要方向。分子标记辅助选择技术(marker
‑
assisted selection，mas)可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，无需漫长的表型观察，提升育种效率(tanksley等，rflp mapping in plant breeding:new tools for an old science.1989,biotechnology,7:257
‑
263)。
[0004]
目前，已克隆的抗稻瘟病基因有30多个，包括pi37、pit、pish、pi21、pi2、pi9、piz
‑
t、pigm、pid2等基因(杨庆,yang,qing,等.水稻抗稻瘟病基因与育种研究进展[j].北方水稻,2017.)。大部分基因都开发了相应的indel、ssr或caps分子标记(刘洋,徐培洲,张红宇,等.水稻抗稻瘟病pib基因的分子标记辅助选择与应用[j].中国农业科学,2008；陈学伟,李仕贵,马玉清,等.水稻抗稻瘟病基因pi
‑
d(t)1,pi
‑
b,pi
‑
ta2的聚合及分子标记选择[j].生物工程学报,2004,20(5):68
‑
74)。其中，ssr标记、indel标记或酶切标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台。


技术实现要素：

[0005]
基于此，本发明的目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4的kasp标记开发及其应用，以提高检测效率。
[0006]
第一方面，本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4的kasp分子标记，所述kasp分子标记为kasp
‑
a4，所述kasp
‑
a4为基于水稻基因组中的一个snp位点而开发的kasp引物，且kasp
‑
a4的多态性为t或a。
[0007]
进一步地，所述kasp分子标记的多态性位点位于chr6.13058850。
[0008]
第二方面，本发明还提供了一种用于检测上述kasp分子标记kasp
‑
a4的引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括primer x和primer y，所述反向引物包括primer r，其中，
[0009]
所述primer x的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0010]
所述primer y的核苷酸序列如seq id no.2所示；
[0011]
所述primer r的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0012]
进一步地，上述引物组应用包括：
[0013]
在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
[0014]
或，在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
[0015]
或，在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
[0016]
或，在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。
[0017]
第三方面，本发明还提供了一种根据上述kasp分子标记的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0018]
s10，设计并选择引物primer x、primer y以及primer r；
[0019]
s20，从水稻叶片中提取引物primer x、primer y以及primer r对应的基因组dna；
[0020]
s30，以提取的所述基因组dna为模板，利用snp分子标记kasp
‑
a4的引物primer x、primer y以及primer r，对kasp
‑
a4分子标记进行kasp反应测试；
[0021]
s40，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近x轴，则待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型为t/t纯合型，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近y轴，则待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型为a/a纯合型，水稻为稻瘟病或者候选为稻瘟病；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析位于x轴和y轴中间，则待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型为t/a杂合型，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病。
[0022]
进一步地，上述kasp分子标记的应用包括：
[0023]
在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中的应用；
[0024]
或，在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中的应用；
[0025]
或，在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用。
[0026]
或，在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。
[0027]
进一步地，在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用中，选择kasp
‑
a4引物的基因型为t/a或t/t的水稻进行辅助育种或制备辅助育种产品。
[0028]
进一步地，在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用中，选择kasp
‑
a4引物的基因型为t/a或t/t的水稻进行育种。
[0029]
第四方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如seq id no.1
‑
3所示的引物。
[0030]
第五方面，本发明还提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括核苷酸序列如seq id no.1
‑
3所示的引物。
[0031]
相较于现有技术，本发明所述分子标记是与水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4紧密连锁的kasp标记kasp
‑
a4。该分子标记基于kasp技术开发，可高通量检测水稻基因组第6号染色体的第13058850位碱基。本发明应用kasp技术对水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4进行基因型鉴定，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时分子标记kasp
‑
a4的表型选择效率达到93.33％，可在水稻的不同种质资源中快速、精准的检测水稻稻瘟病抗性基因
pid3
‑
a4；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭eb等有毒物的使用，可在育种早期进行分子标记辅助选择，减小育种群体的田间种植规模，降低育种成本，加快育种进程。
附图说明
[0032]
图1为本发明中水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4的kasp分子标记开发的流程图；
[0033]
图2为利用分子标记kasp
‑
a4检测品种材料的分型图；
[0034]
图3为利用分子标记kasp
‑
a4检测f2群体的分型图。
[0035]
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
[0036]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
[0037]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0038]
需要说明的是，基于snp位点设计的标记即为在分子标记辅助选择技术基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加产量育种准确度与提高育种效率的有效手段。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻抗病kasp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国抗病水稻的育种效率和育种水平具有重要意义。
[0039]
实施例1：与水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4紧密连锁kasp标记开发
[0040]
与水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4紧密连锁kasp标记开发流程如图1所示。据文献报道，获得一个与pid3
‑
a4基因紧密连锁的snp位点[ca/ag](水稻参考基因组物理位置为第6条染色体10389855
‑
10389856bp)。
[0041]
1.引物的确定：
[0042]
将pid3
‑
a4基因的紧密连锁snp位点锚定在水稻6号染色体13058850bp位置上(黄卫衡,黄志远,唐丽,等.抗稻瘟病pid3/pid3
‑
a4基因特异indel分子标记开发与应用[j].杂交水稻,2020(2):68
‑
74.)。从ncbi数据库下载pid3
‑
a4基因的紧密连锁snp位点的侧翼序列，并利用primer5.0软件，共设计3组kasp引物。利用douglas scientific公司arraytape平台检测后，挑选出1套多态性良好的kasp引物用于后续验证，所述用于检测与水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4紧密连锁kasp标记的引物具体如下：
[0043]
primer x：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgcgaactaaacagggttggt
‑3’
(seq id no.1，小写字母部分为特异荧光标签序列vic)；
[0044]
primer y：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctcgaactaaacaggccctgaa
‑3’
(seq id no.2，
小写字母部分为特异荧光标签序列fam)；
[0045]
primer r：5
’‑
tgtaattaggtaggtcacccatc
‑3’
(seq id no.3)。
[0046]
所述引物对应的snp位点为水稻基因组第6号染色体的第13058850位碱基(对应序列表中序列4中第101
‑
102位核苷酸)。
[0047]
序列4：
[0048]
tccgacgtgacacccaaaaatttttatttcgcgaactaaacagg[gttggt/ccctgaa]gagttggttgtctaattaaaactagatgggtgacctacctaattacacg。
[0049]
2.dna提取：
[0050]
采用常规ctab法从水稻叶片中提取基因组dna。
[0051]
3.kasp反应测试
[0052]
snp标记扩增及反应体系：
[0053]
(1)荧光定量pcr仪ab
‑
q6 flex检测：
[0054]
5μl pcr荧光定量仪检测反应体系包括：基因组dna50ng，引物混液0.07μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol/l各12μl，反向引物primer r 100pmol/l 30μl,ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(low rox)2.5μl。按照荧光定量pcr仪ab
‑
q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
[0055]
以上反应体系为ab
‑
q6 flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0056]
(2)选择douglas scientific公司arraytape平台检测
[0057]
1.6μl pcr arraytape平台检测反应体系包括：含基因组dna50ng/μl 0.8μl，引物混液0.03μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol/l各12μl，反向引物primer r 100pmol/l 30μl,ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(std rox)0.8μl。根据arraytape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
[0058]
以上反应体系为douglas scientific公司arraytape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0059]
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
[0060]
其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真taq酶，dntp，mg
2
等组成。荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt
‑3’
，5’末端连接一个vic荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct
‑3’
，其5’端连接一个fam荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc
‑3’
，其3’端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc
‑3’
，其3’端连接一个淬灭基团bhq。
[0061]
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55
‑
62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
[0062]
实验同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照(ntc)，每个板设置1个或多个空白对照。
[0063]
4.扫描数据分析
[0064]
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型(即检测水稻基因组第6号染色体的第13058850位碱基是a还是t)，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近x轴(vic信号)，则待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型为t/t纯合型(即水稻基因组第6号染色体的第13058850位碱基为t纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近y轴(fam信号)，则待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型为a/a纯合型(即水稻基因组第6号染色体的第13058850位碱基为a纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析位于x轴和y轴中间(vic和fam信号)，则待测水稻基因组中kasp
‑
a4引物的基因型为t/a杂合型(即水稻基因组第6号染色体的第13058850位碱基为t/a杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
[0065]
5.标记分型数据分析
[0066]
请参阅图2，为了验证kasp
‑
a4引物的可靠性，首先，利用kasp
‑
a4对16份水稻品种材料进行分子标记检测；然后，对16份水稻品种材料进行稻瘟病接种鉴定，获得材料的抗性数据，稻瘟病接种鉴定方法及评价标准见文献(黄卫衡,黄志远,唐丽,等.抗稻瘟病pid3/pid3
‑
a4基因特异indel分子标记开发与应用[j].杂交水稻,2020(2):68
‑
74.)。材料基因型采用douglas scientific公司arraytape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复。扩增结果表明，kasp
‑
a4引物在16份材料中能够获得稳定的pcr产物，并且能够检测到t
‑
vic和a
‑
fam两个等位位点(如图2所示)。因此，本发明所述的kasp
‑
a4引物可用于水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4的分子标记辅助育种。
[0067]
表1.16份测试品种的信息
[0068]
序号材料名称表型基因型序号材料名称表型基因型01合系2号sa/a09云粳20号sa/a02合系10号sa/a10红优3号sa/a03华占sa/a11靖粳13号sa/a04明恢63sa/a12会粳8号sa/a05丰源asa/a13会粳10号sa/a06深08ssa/a14珍汕97asa/a07311100tt/t15合江19号sa/a08云粳9号sa/a16红优5号sa/a
[0069]
注：表中
‘
t’表示材料的表型为抗病；
‘
s’表示材料的表型为感病；
‘
t/t’表示纯合抗病基因型；
‘
a/a’表示纯合感病基因型；
‘
t/a’表示杂合抗病基因型；
‘
*’表示无检测信号。
[0070]
实施例2：与水稻稻瘟病抗性基因pid3
‑
a4紧密连锁的kasp标记在分子标记辅助选择水稻抗稻瘟病植株中的应用
[0071]
请参阅图3，为检测本发明kasp
‑
a4引物的实用性，利用栽培稻抗稻瘟病材料311100与感稻瘟病材料稻花香2号杂交获得f1群体，通过f1天然自交产生f2自然分离群体90株，对分离群体进行kasp标记检测和抗病表型验证(表2)，标记检测和抗病表型验证实施方法参考实施例1。通过对分离群体进行表型与基因型检测和分析(如图3所示)，在90份分离群体单株中，仅6株基因型与表型结果不一致，标记kasp
‑
a4与田间抗性的一致性结果为p
＝93.33％，表明标记kasp
‑
a4在水稻抗根结线虫病植株筛选中具有较高的实用性。
[0072]
表2.f2群体的表型与基因型数据
[0073]
[0074][0075]
注：表中
‘
t’表示材料的表型为抗病；
‘
s’表示材料的表型为感病；
‘
t/t’表示纯合抗病基因型；
‘
a/a’表示纯合感病基因型；
‘
t/a’表示杂合抗病基因型；
‘
*’表示无检测信号。
[0076]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0077]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0078]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。