含有HDAC1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建与应用的制作方法

含有hdac1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域中的抑制肿瘤药物筛选领域，尤其涉及一种含有hdac1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法与应用。


背景技术：

2.目前癌症已经成为危害人类生命健康的首要疾病，癌症早期检出率低，导致治疗效果并不理想，预后较差，发病人群具有普遍性，在世界各地广泛存在[1]。随着放疗、化疗、手术等治疗方法的不断发展，癌症患者的生存期得到了延长。然而，癌症极易复发和转移，仍然严重危害着人类的生命和健康[2,3]。寻找到一种能够有效抑制癌症发生或转移的方法，无疑是人类的福音，因此，尽快创建一种高通量的抗肿瘤药物筛选方法极为重要。
[0003]
组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，hdac1)，存在于哺乳动物体内，是一种转录调节因子，该基因编码的蛋白作为组蛋白去乙酰化酶家族中的一员，是组蛋白去乙酰化酶复合物的组成部分
[4]
。它与抑癌蛋白相互作用，这种复合物是控制细胞增殖和分化的关键因素。与转移相关蛋白
‑
2(mta2)一起，去乙酰化p53并调节其对细胞生长和凋亡的影响
[5]
。hdac1能够改变核小体的结构，维持非组蛋白和组蛋白去乙酰化平衡等，并且在线粒体转位介导的癌基因合成中具有促进作用
[6]
,在膀胱癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中发现高度表达
[7,8,9]
，抑制其表达后可以降低癌细胞的侵袭和迁移能力
[10]
。这些研究提示hdac1可能作为肿瘤药物筛选的指标
[11]
。
[0004]
参考文献：
[0005]
[1]global cancer statistics[j].ca:a cancer journal for clinicians,2011,61(2).
[0006]
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–
30.
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[0008]
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‑
489,517.
[0009]
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[0010]
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‑
82.
[0011]
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‑
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‑
36.
[0012]
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‑
2466.
[0013]
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‑
1839.
[0014]
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‑
728.
[0015]
[11]lin yc，lin yc，shih jy，et al.dusp1 expression inducedby hdac1 inhibition mediates gefitinib sensitivity in non－small cell lung cancers[j].clin cancer res，2015，21(2)：428－438.。


技术实现要素：

[0016]
本发明的首要目的在于提供一种含有hdac1基因启动子和报告基因的重组质粒。
[0017]
本发明的另一目的在于提供上述重组质粒的构建方法。
[0018]
本发明的再一目的在于提供上述重组质粒在靶向筛选肿瘤抑制剂中的用途。
[0019]
本发明是这样实现的，一种含有hdac1基因启动子和报告基因的重组质粒，该重组质粒为在pgl3
‑
basic质粒的多克隆位点插入hdac1基因启动子序列。
[0020]
优选地，所述hdac1基因启动子序列如seq id no：1所示。
[0021]
优选地，所述hdac1基因启动子序列插入在kpn i和mlu i限制性酶切位点之间。
[0022]
本发明进一步公开了一种含有hdac1基因启动子和报告基因的重组质粒的制备方法，该方法包括以下步骤：在pgl3
‑
basic质粒的多克隆位点插入hdac1基因启动子序列。
[0023]
优选地，所述hdac1基因启动子序列如seq id no：1所示。
[0024]
优选地，所述hdac1基因启动子序列插入在kpn i和mlu i限制性酶切位点之间。
[0025]
本发明进一步公开了上述重组质粒在靶向筛选肿瘤抑制剂中的用途。
[0026]
本发明进一步公开了一种靶向筛选肿瘤抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：
[0027]
(1)将上述重组质粒与另一种荧光素酶报告基因载体共转染肿瘤细胞；
[0028]
(2)检测双荧光素酶活性来反映候选物质对hdac1基因启动子转录活性的影响。
[0029]
优选地，所述荧光素酶报告基因载体为海肾荧光素酶报告基因载体。
[0030]
优选地，所述肿瘤细胞为人前列腺癌细胞pc3。
[0031]
本发明克服现有技术的不足，提供一种含有hdac1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法与应用，本发明通过克隆组蛋白去乙酰化酶1(hdac1)基因的启动子特异性序列并重组到萤火虫荧光素酶报告基因载体上，从而构建hdac1报告基因的重组质粒载体；将构建的载体与海肾荧光素酶报告基因载体共转染到人前列腺癌细胞pc3中，通过同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性反应hdac1基因启动子的转录活性，从而建立靶向筛选抑制肿瘤药物的方法，该方法在筛选抑制肿瘤药物、评价待测药物对肿瘤可能产生的影响以及研究该类药物作用机理等方面有着极佳的应用前景。
[0032]
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
[0033]
(1)本发明靶向筛选抑制肿瘤药物的方法具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等特点；
[0034]
(2)本发明靶向筛选抑制肿瘤药物的方法同时具有靶向性的特点，能够特异性检测启动子中特定序列的启动活性；
[0035]
(3)本发明靶向筛选抑制肿瘤药物的方法克服了转染效率对结果的影响，经体外
细胞实验的结果显示，在抗癌药物(阿霉素)处理下，前列腺癌pc3细胞中hdac1基因启动子活性显著降低；
[0036]
(4)本发明的重组质粒可用于检测抗癌药物对hdac1基因表达的影响。
附图说明
[0037]
图1是pgl3
‑
basic质粒图谱；
[0038]
图2是重组质粒的电泳结果；其中，泳道1为pgl3
‑
basic载体，泳道2为marker dl2000；
[0039]
图3是重组质粒和目的片段回收后的电泳结果；其中，泳道1为pgl3
‑
basic载体，泳道2为目的片段，泳道3为marker dl2000；
[0040]
图4是重组质粒的双酶切片段回收后的电泳结果；其中，泳道1为pgl3
‑
basic载体，泳道2为pgl3
‑
basic载体酶切结果，泳道3为pgl3
‑
hdac1载体，泳道4和泳道5为pgl3
‑
hdac1载体酶切结果，泳道6为markerdl2000；
[0041]
图5是酶切样品的基因测序结果；
[0042]
图6是cck
‑
8实验检测不同浓度阿霉素处理条件下pc3细胞的增殖活性(n＝6，*阿霉素处理组，**p<0.01)；
[0043]
图7是cck
‑
8实验检测不同浓度顺铂处理条件下pc3细胞的增殖活性(n＝6，*顺铂处理组，**p<0.01)；
[0044]
图8是实时定量荧光pcr检测不同浓度阿霉素处理条件下pc3细胞hdac1启动子报告基因mrna表达水平(n＝3，*阿霉素处理组，**p<0.01)；
[0045]
图9是实时定量荧光pcr检测不同浓度顺铂处理条件下pc3细胞hdac1启动子报告基因mrna表达水平(n＝3，*顺铂处理组，**p<0.01)；
[0046]
图10是pgl3
‑
vector和pgl3
‑
hdac1
‑
luc不同质粒转染pc3细胞后的相对荧光素酶活性(n＝3，*对照组，**p<0.01；#对照组2g hdac1
‑
luc组，##p<0.01)。
具体实施方式
[0047]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048]
1、重组质粒的构建
[0049]
1)pgl3
‑
basic质粒的大量扩增、抽提：
[0050]
pgl3
‑
basic质粒的图谱如图1所示，用pgl3
‑
basic质粒转化常规制备的dh5α感受态细胞，进行大量的扩增，将扩增后质粒进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示；通过碱裂解法大量制备pgl3
‑
basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量；用knp i和mlu i对质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。
[0051]
2)hdac1基因启动子序列的克隆、酶切及纯化
[0052]
根据大鼠的hdac1基因启动子序列设计两端引物：
[0053]
引物1为上游5'端引物:5
’‑
cagccagggtaccagtaatag
‑3’
[0054]
引物2为上游3'端引物:5
’‑
cgacgcgtcacctatagccacaca
‑3’
[0055]
以基因组dna为模板，利用常规pcr反应进行扩增；反应条件为94℃变性5min；循环为94℃30s,52℃30s,72℃30s，共进行35个循环，72℃延伸8min。反应结束后，取反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，图3结果显示，克隆得到单一的特异性条带。
[0056]
取pcr产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收；将回收的pcr产物用knp i和mlu i双酶切，再次回收以备连接使用。
[0057]
3)连接反应：
[0058]
将经过双酶切的pgl3
‑
basic载体和hdac1基因启动子片段在离心管中进行连接反应，16℃过夜反应，形成重组子，用knp i和mlu i对重组质粒进行酶切，结果如图4所示。
[0059]
4)筛选重组子：
[0060]
取10μl连接产物直接转化100μl感受态大肠杆菌。经过含有氨苯青霉素的lb培养基中选择培养。从转化子的平板上随即挑取10个菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用；经过酶切、pcr、测序鉴定。图5结果显示，重组载体中含有插入的hdac1基因启动子片段并且未发现有碱基突变。
[0061]
2.检测抗癌药物处理对hdac1基因的的影响
[0062]
人前列腺癌pc3细胞培养于5％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的dmem高糖培养基(37℃，5％co2、饱和湿度)中，并使之维持单层贴壁生长。
[0063]
2)共转染
[0064]
按5*105个细胞/孔的量在6空板中接种指数生长期的细胞，在37℃、5％co2培养箱中过夜培养，直到细胞到80％密度。转染前1小时吸去培养板中的培养液，在每个ep管中加入100μl无血清无双抗的培养基，以质粒：pei试剂＝4：1比例分别加入质粒和pei试剂，轻柔吹打混匀，孵育20min；将混合物均匀加入细胞板各孔中，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。
[0065]
3)细胞的药物处理
[0066]
将转染后的细胞培养液换成含有血清和双抗的完全培养基，并分别用阿霉素(1、2、4、8、16、32μm)或顺铂(4、8μm)处理。
[0067]
4)细胞增殖活性(cck
‑
8)检测
[0068]
将pc3细胞种植在96孔板中培养(～105/孔)，每组6个复孔，每孔加入100μl相应培养基，24h后进行处理。向各孔加入10μl cck
‑
8试剂。酶标仪检测细胞活力(450nm波长处吸光度)。
[0069]
细胞活力(％)＝[(as
–
ab)/(ac
–
ab)]
×
100％
[0070]
as：实验孔(含有细胞和药物、有cck
‑
8)的吸光度；
[0071]
ac：对照孔(含有细胞而不含药物、有cck
‑
8)的吸光度；
[0072]
ab：空白孔(不含有细胞和药物、有cck
‑
8)的吸光度。
[0073]
图6～7实验结果显示，阿霉素处理后能够显著降低pc3细胞的增殖活性(**p<0.01)，随药物浓度逐步提高，增殖活性先下降，后略有上升，然后下降。顺铂处理后也能够显著降低pc3细胞的增殖活性(**p<0.01)，并随药物浓度逐步提高，增殖活性的降低愈加显著。
[0074]
5)real
‑
time pcr检测
[0075]
本实验中hdac1、内参18srrna等相关基因均使用sybr green i进行检测，采用2
‑△△
ct
法进行结果分析处理，具体的步骤如下：
[0076]
10ul体系包括5μl sybr green mix、3μl无核酶水、1μl primer、1μl template；
[0077]
热循环过程为：94℃4min、40次(94℃30s、50℃30s、72℃40s、72℃5min)、25℃2min。
[0078]
实时定量荧光pcr反应上下游引物序列为：
[0079]
human hdac1 forward：5
’‑
catcgctgtgaattgggctg
‑3’
；
[0080]
human hdac1 reverse：5
’‑
accctctggtgatactttagcag
‑3’
。
[0081]
18srrna forward：5
’‑
cctggataccgcagctagga
‑3’
；
[0082]
18srrna reverse：5
’‑
gcggcgcaatacgaatgcccc
‑3’
。
[0083]
数据处理：folds＝2
‑△△
ct
。
[0084]
图8～9实验结果显示，阿霉素处理后，随药物浓度逐步提高，hdac1启动子基因mrna表达水平先升高，然后降低(**p<0.01)；顺铂处理后，随药物浓度逐步提高，增殖活性的降低愈加显著(**p<0.01)。
[0085]
6)荧光素酶活性检测
[0086]
药物(阿霉素或顺铂)处理后48h，弃去细胞培养液，贴壁加入pbs，轻轻洗涤细胞，吸去洗涤液，将报告基因细胞裂解液充分混匀。每孔加入报告基因细胞裂解液100μl，反复吹打，待充分裂解后，12000转/分钟，离心5min，取上清用于测定。溶解荧光素酶检测试剂和renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。renilla荧光素酶检测底物(100
×
)置于冰浴或冰盒上备用。按照每个样品需100μl的量，取适量renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入ren illa荧光素酶检测底物(100
×
)配制成renilla荧光素酶检测工作液；开启酶标仪，将测定间隔设为2s，测定时间设为10s。每个样品测定时，取样品50μl，加入100μl荧光素酶检测试剂，混匀，synergy2多功能酶标仪测定rlu(rela tive light unit)。以报告基因细胞裂解液做为空白对照。完成上述荧光素酶的测定步骤后，加入100μl renilla荧光素酶检测工作液，用移液器吹打混匀，测定rlu(relative light unit)。在以renilla荧光素酶为内参的情况下，用荧光素酶测定得到的rlu值除以renilla荧光素酶测定得到的rlu值。根据测得的比值，比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
[0087]
图10实验结果显示，阿霉素处理后，随药物浓度逐步提高，hdac1启动子基因荧光素酶活性表达水平先升高，然后降低(**p<0.01)。
[0088]
综上各结果表明，本发明的重组质粒可应用于以hdac1基因启动子为靶点的抗肿瘤药物筛选方法。
[0089]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。