一种酵母菌重组表达载体及其构建方法与应用与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种酵母菌重组表达载体及其构建方法与应用。


背景技术：

2.毕赤酵母由于生长周期较短，遗传操作简单，易于高密度发酵，能够对蛋白质进行真核修饰等诸多优点，被广泛应用于各种外源蛋白质的表达，并获得了较高的蛋白表达水平。目前使用最广泛的用于外源蛋白表达的酵母为巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因his4，可通过整合含有his4基因的载体，赋予宿主his 的表型便于初步筛选转化子。目前适合毕赤酵母的分泌表达载体有ppic9k，ppiczα，pgap等，都可以选择巴斯德毕赤酵母的his4基因作为重组位点构建外源蛋白表达重组菌。载体中ppic9k是最为广泛使用的一种分泌性毕赤酵母表达载体，包含5'aoxl强启动子、3'aoxl基因，多克隆位点(mcs)，氨基酸缺陷性筛选标记(his4)，g418抗性基因选择标记等。此外，ppic9k还包含信号肽，能够引导外源表达的蛋白穿过内质网和高尔基体，分泌到细胞外进入培养基中。影响酵母分泌表达蛋白的水平的因素很多，如外源基因的特性、启动子、外源基因的拷贝数、培养条件及发酵过程控制等。
3.目前，提高目标基因在酵母中整合的拷贝数是增加目的蛋白表达量最有效的方法。其原理是通过提高外源基因在宿主菌中整合的拷贝数，以期望含有多拷贝目的基因的酵母具有高表达目的蛋白能力。目前用来获得高拷贝菌株方法主要有两种：
4.1)通过体外构建含有多个目的基因的串联在一起的表达盒来获得含有串联重复目的基因的重组酵母菌。利用此种方法，在一定程度上能有效的提高目的蛋白的分泌表达水平。但在构建含有多个拷贝目的基因的串联表达载体时，常无有效数值进行参考。此外，多个拷贝的基因串联在一起形成表达盒，在增加载体构建复杂性的同时，过多的串联重复基因也会由于基因剂量效应，遗传重组不稳定性等原因，导致表达水平的降低；
5.2)通过提高抗生素浓度来筛选含有单基因多拷贝整合的重组酵母菌。利用高浓度抗生素g418对含有单基因多拷贝的重组酵母菌进行初筛(能在高浓度抗生素条件下生长的重组菌意味着整合了更多拷贝的载体，单拷贝整合或者少量整合则在高浓度抗生素条件下生长缓慢或者被杀死)，在一定程度上能筛选到单基因多拷贝的重组酵母菌，然而由于ppic9k载体结构的原因，ppic9k载体上抗性基因与目的蛋白处于不同的顺反子，无法直接利用抗生素基因蛋白的底物浓度(即抗生素浓度)来衡量目的蛋白的多寡，实验中易造成假阳性的现象。在实际工作中，利用高浓度g418抗生素筛选得到的含有单基因多拷贝的重组酵母菌往往并非是高表达的酵母重组菌。
6.因此，不管利用何种方法获得的含有多个基因拷贝的重组菌，都无法确定所获得的重组菌为高表达目的蛋白的酵母菌，后续仍需要进行大量的酶学测定工作来对高表达的重组酵母菌进行鉴定。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种酵母菌重组表达载体及其构建方法与应用，利用该载体可以快速、高通量地筛选得到高表达目的蛋白的重组酵母菌，与现有技术相比，显著减少了复筛时间，降低了假阳性率，提高了筛选效率。
8.为此，本发明的第一方面提供一种酵母菌重组载体，其含有表达框，所述表达框依次包括多克隆位点、蛋白酶酶切位点的编码序列和抗生素抗性基因；所述蛋白酶酶切位点能够被酵母菌中的蛋白酶特异性识别并切割；通过向所述多克隆位点克隆待表达目的蛋白的基因，能够使所述待表达目的蛋白的基因、蛋白酶酶切位点的编码序列和所述抗生素抗性基因位于同一顺反子。
9.进一步，所述抗生素抗性基因选自g418抗性基因(如neor/kanr基因)或博莱霉素抗性基因(如zeocin抗性基因：sh/ble基因)。
10.进一步，所述蛋白酶酶切位点可被酵母菌自身表达的蛋白酶特异性识别并切割；所述蛋白酶酶切位点选自kex2蛋白酶酶切位点或ste13蛋白酶酶切位点。
11.根据本发明的酵母菌重组载体，所述表达框还包含启动子，在某些实施方式中，所述启动子为甲醇启动子(aox)。
12.进一步，所述表达框中还包括信号肽的编码基因。
13.在某实施方式中，所述信号肽的编码基因位于所述待表达目的蛋白的基因的上游。
14.在某实施方式中，所述信号肽为α因子信号肽。
15.进一步，所述酵母菌重组载体还包括氨基酸缺陷性筛选标记，例如组氨酸脱氢酶基因(his4)。
16.进一步，所述抗生素抗性基因经过了酵母菌密码子偏好性优化。
17.本发明的第二方面提供一种酵母菌重组表达载体，其含有表达框，所述表达框依次包括待表达目的蛋白的基因、蛋白酶酶切位点的编码序列与抗生素抗性基因，所述待表达目的蛋白的基因、蛋白酶酶切位点的编码序列与抗生素抗性基因位于同一顺反子；所述蛋白酶酶切位点能够被酵母菌中的蛋白酶特异性识别并切割。
18.根据本发明所述的酵母菌重组表达载体，其编码表达依次包含待表达目的蛋白、蛋白酶酶切位点和抗生素抗性蛋白的融合蛋白；所述蛋白酶酶切位点能够被酵母菌中的蛋白酶特异性识别并切割。在某实施方式中，所述融合蛋白还包括信号肽，例如α因子信号肽。
19.根据本发明所述的酵母菌重组表达载体，当其在酵母菌中进行表达时，表达得到含有目的蛋白和抗生素抗性蛋白的融合蛋白，且在该融合蛋白中，目的蛋白与抗生素抗性蛋白之间具有蛋白酶酶切位点；该蛋白酶酶切位点被酵母菌自身表达的蛋白酶特异性识别并切割，即可将该融合蛋白切割为独立的目的蛋白、与独立的抗生素抗性蛋白。
20.进一步，所述抗生素抗性基因选自g418抗性基因(如neor/kanr基因)或博莱霉素抗性基因(如zeocin抗性基因：sh/ble基因)。
21.进一步，所述蛋白酶酶切位点可被酵母菌自身表达的蛋白酶特异性识别并切割；所述蛋白酶酶切位点选自kex2蛋白酶酶切位点或ste13蛋白酶酶切位点。
22.进一步，所述顺反子中还包括信号肽的编码基因。
23.在某实施方式中，所述信号肽的编码基因位于所述待表达目的蛋白的基因的上
游。
24.在某实施方式中，所述信号肽为α因子信号肽。
25.根据本发明所述的技术方案，所述表达框包含启动子，在某实施方式中，所述启动子为甲醇启动子(aox)。
26.进一步，所述酵母菌重组表达载体还包括氨基酸缺陷性筛选标记，例如组氨酸脱氢酶基因(his4)。
27.进一步，所述待表达目的蛋白的基因经过了酵母菌密码子偏好性优化。
28.进一步，所述抗生素抗性基因经过了酵母菌密码子偏好性优化。
29.本发明的第三方面，提供一种酵母菌重组载体的构建方法，其包括：提供ppic9k载体，删除ppic9k载体中的卡那霉素抗性基因，得到ppic9k
‑
δkan载体；将g418抗性基因插入ppic9k
‑
δkan多克隆位点的下游，同时在g418抗性基因的5’端连接蛋白酶kex2酶切位点的编码序列，即得到所述酵母菌重组载体(命名为pp9kan载体)。
30.本发明的第四方面，提供一种酵母菌重组表达载体的构建方法，其包括：将待表达目的蛋白的基因克隆至所述酵母菌重组载体的多克隆位点处，使所述待表达目的蛋白的基因、蛋白酶酶切位点的编码序列和所述抗性筛选基因位于同一顺反子。
31.进一步，所述待表达目的蛋白的基因经过了酵母菌密码子偏好性优化。
32.在某实施方式中，所述酵母菌重组表达载体的构建方法包括：提供pp9kan载体，将待表达目的蛋白的基因克隆至pp9kan载体的多克隆酶切位点处，使所述待表达目的蛋白的基因、蛋白酶kex2酶切位点的编码序列和g418抗性基因位于同一顺反子。
33.本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，其包含本发明第一方面所述的酵母菌重组载体或本发明第二方面所述的酵母菌重组表达载体。
34.进一步，所述宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母菌。
35.进一步，所述酵母菌为gs115菌株或km71菌株。
36.本发明的第六方面，提供一种筛选高表达目的蛋白的重组酵母菌的方法，包括将本发明第二方面所述的酵母菌重组表达载体转化至酵母菌中，获得重组酵母菌；在适于表达所述目的蛋白的培养条件下，对所述重组酵母菌进行培养，在所述培养过程中，培养基含有梯度浓度的所述抗生素抗性基因所对应的抗生素；选取能够在较高抗生素浓度下生长的重组酵母菌进行鉴定，即筛选得到高表达目的蛋白的重组酵母菌。
37.进一步，所述酵母菌为毕赤酵母菌。
38.进一步，所述酵母菌为gs115菌株或km71菌株。
39.本发明的第七方面，提供一种表达目的蛋白的方法，包括在适于表达所述目的蛋白的培养条件下，培养本发明第六方面所述的高表达目的蛋白的重组酵母菌。
40.进一步，所述酵母菌为毕赤酵母菌。
41.进一步，所述酵母菌为gs115菌株或km71菌株。
42.在现有技术中，为了提高重组蛋白在酵母菌中的表达水平，其原理均是通过提高外源基因在宿主菌中整合的拷贝数，以期望含有多拷贝目的基因的酵母菌具有高表达目的蛋白能力。
43.本发明的发明思路绕开了现有技术中的第一步，即先获得含有多拷贝目的基因的酵母，直接以结果为导向。本发明将目的蛋白的基因与抗生素抗性基因置于同一顺反子，并
由蛋白酶酶切位点连接，表达时为目的蛋白与抗生素抗性蛋白融合表达，在随后在分泌的过程中，融合蛋白由酵母中的蛋白酶进行切割，形成目的蛋白与抗生素抗性蛋白，其数量比为1：1。通过提高抗生素抗性蛋白底物浓度(抗生素浓度)的方法，即可筛选到高表达抗生素抗性蛋白的重组酵母菌(能在高浓度抗生素条件下生长的重组菌意味着整合了更多拷贝的目的蛋白基因和抗生素抗性基因，单拷贝整合或者少量整合则在高浓度抗生素条件下生长缓慢或者被杀死)，也就意味着该重组酵母菌能表达更多的目的蛋白。因此能够直接对高表达目的蛋白的重组酵母菌进行高通量筛选，减少复筛时间与假阳性率，提高筛选效率。
44.与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：本发明提供了一种酵母菌重组表达载体，利用该载体可以快速、高通量地筛选得到高表达目的蛋白的重组酵母菌，与现有技术相比，显著减少了复筛时间、降低了假阳性率、提高了筛选效率。
附图说明
45.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
46.图1为本发明酵母菌重组表达载体的构建方法的流程示意图；
47.其中，a)为起始载体ppic9k；b)为删除kan基因的载体ppic9k
‑
δkan；c)酵母表达载体pp9kan；d)淀粉酶重组表达质粒pp9kan
‑
amy；
48.图2为利用淀粉曲利苯蓝平板对不同浓度的g418条件下筛选的酵母重组菌进行蛋白活性鉴定；
49.其中，a)1mg/ml g418；b)2mg/ml g418；c)4mg/ml g418；
50.图3为从含有淀粉曲利苯蓝和不同浓度g418平板上选取的酵母重组菌的发酵液浓缩sds
‑
page图；
51.其中，泳道m为蛋白质marker，泳道1为1mg/ml g418平板上的重组菌的浓缩发酵液；泳道2为2mg/ml g418平板上的重组菌的浓缩发酵液；泳道3为4mg/ml g418平板上的重组菌的浓缩发酵液。
具体实施方式
52.下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
53.除非另有定义，本文所用的所有术语，注释和其它科学术语或术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。这里所描述或引用的许多技术和过程是本领域技术人员所熟知的，并且通常使用传统的方法。适当地，除非另有说明，通常根据制造商定义的规程和/或参数来进行涉及使用市售试剂盒和试剂的过程。
54.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获
得表达。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
55.如本文中所使用的，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括可操作性连接的启动子和基因编码序列。
56.如本文中所使用的，术语“编码序列”指核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。
57.如本文中所使用的，术语“可操作性连接的”或“可操作性连接”指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如，在核酸构建物中，启动子被置于感兴趣基因的核酸序列的特定位置，例如启动子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该基因的核酸序列上。“可操作性连接”可以通过基因重组的手段实现。
58.如本文中所使用的，术语“多克隆位点(mcs)”指包含用于将核酸片段克隆到克隆载体质粒中的限制性位点的核苷酸序列。mcs，也称作多接头或多克隆位点，是允许许多限制性内切酶在该位点内操作的克隆位点簇。
59.如本文中所使用的，术语“抗生素抗性基因”指编码对特定抗生素具有抗性的蛋白质的基因，并且携带它们的细胞在被一定浓度范围的该特定抗生素处理的环境中能够存活，因此抗生素抗性基因通常可用作选择标记。例如，“g418抗性基因”指编码对g418具有抗性的蛋白质的基因。g418是一种氨基糖苷类抗生素，可抑制原核和真核蛋白质的合成，广泛用于选择携带neor/kanr基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶)的表达载体。例如，“博来霉素抗性基因”指编码对博来霉素具有抗性的蛋白质的基因，在一些实施方式中，用zeocin进行抗性筛选，zeocin试剂是博来霉素抗生素中的一员，由sh/ble基因编码的蛋白质可赋予细胞对zeocin的抗性。
60.如本文中所使用的，术语“顺反子(cistron)”即结构基因，为决定一条多肽链合成的功能单位，即一个顺反子编码得到一条多肽。
61.如本文中所使用的，术语“融合蛋白”表示该蛋白包括两种或更多中蛋白质或其片段。通常，融合蛋白是从融合基因表达的，其中编码来自一种蛋白的多肽序列的核苷酸序列与编码来自其他种蛋白的多肽序列的核苷酸序列在框架中附加，并且任选地通过接头将编码来自不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列分离。然后，融合基因可以作为单一蛋白由宿主细胞表达。通常，构建融合蛋白的基本方法是将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白的基因，以实现两个基因的共同表达，其中两个蛋白之间可任选地通过接头连接。
62.如本文中所使用的，术语“转化”是指将外源核酸导入生物体中，使得该核酸可作为染色体外元件或通过染色体整合而复制。
63.实施例1构建酵母表达载体pp9kan
64.(1)构建载体ppic9k
‑
δkan：以ppic9k为模板，引物为f：5'
‑
attctgaaacaccccttgtattactgtttatgtaagcagaca
‑
3'(seq id no：1)；r：5'
‑
ggggtgtttcagaattggttaattggttgtaacactggc
‑
3'(seq id no：2)，进行反向pcr扩增，删除ppic9k载体上的kan基因，pcr产物片段经过dpn i处理消化处理，胶回收试剂盒回收纯化后，infusion克隆，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，过夜培养，待平板上长出明显菌落时，挑选转化菌落，小量提取质粒，进行测
序鉴定，确定kan基因是否删除，选取测序正确的重组子并命名为载体ppic9k
‑
δkan。
65.(2)构建重组载体pp9kan：以ppic9k
‑
δkan为模板，引物为：f：5'
‑
gaattaattcgccttagacatgactgttcctc
‑
3'(seq id no：3)；r：5'
‑
gcggccgccctagggaattctac
‑
3'(seq id no：4)，进行反向pcr扩增，通过胶回收试剂盒回收并纯化片段并命名为a。根据毕赤酵母密码子偏爱性，人工优化并合成n端含有酵母自身蛋白酶kex2切割位点erkeaea(seq id no：5)的kan基因(ask37968.1，seq id no：6)，并在kan基因序列的的n端和c端分别加入“5
‑
ccctagggcggccgc
‑
3”(seq id no：7)和“5
‑
gaattaattcgcctt
‑
3”(seq id no：8)同源序列，通过胶回收试剂盒回收并纯化片段并命名为b；将片段a和片段b按照1:1混合，infusion克隆，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，过夜培养，待平板上长出明显菌落时，挑选转化菌落，小量提取质粒，进行测序鉴定，将测序正确的重组子命名为载体pp9kan。
66.实施例2重组基因工程酵母菌的获取
67.根据毕赤酵母密码子偏爱性，人工优化并合成淀粉酶amy基因(kf421593，seq id no：9)。取pp9kan质粒，利用ecori/noti位点，将amy基因克隆至pp9kan载体ecori/noti处(克隆过程中去掉amy基因的终止密码子，并且使amy基因与kan基因位于同一开放阅读框)，获得淀粉酶的表达重组载体pp9kan
‑
amy。重组载体pp9kan
‑
amy经酶切线性化后，电转到毕氏酵母gs115菌株(购自invitrogen公司)中。将电转子涂布于组氨酸缺陷培养基md平板，按照每24h加入1.5％甲醇进行诱导(200ul/平板)，28℃培养3
‑
5天获得重组转化子。
68.实施例3高表达淀粉酶重组酵母菌的筛选
69.取实施例2所得md平板上单菌落，利用点平板法，分别转移至含有1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml的g418的bmmy培养基平板，28℃培养3
‑
5天，按照每24h加入1.5％甲醇进行诱导(200ul/平板)；获得能够在不同浓度抗生素条件下生长的酵母重组菌；由于目的蛋白基因与抗生素抗性基因处于同一启动子下游，即同一顺反子，并由酵母自身蛋白酶酶切位点连接，能在高浓度抗生素平板上生长的重组菌即为高表达目的蛋白的重组菌，选取能够在4mg/ml的g418的bmmy培养基平板上生长的重组酵母菌，即为高表达淀粉酶的重组酵母菌。
70.实施例4重组酵母菌的酶活性验证
71.将实施例3所得的bmmy平板上的单菌落，利用点平板法，分别转移至添加有底物淀粉，指示剂曲利苯蓝和对应浓度(1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml)的g418的bmmy培养基平板，28℃培养3
‑
5天，按照每24h加入1.5％甲醇进行诱导(200ul/平板)；结果见图2所示，随着抗生素浓度的升高，淀粉酶水解淀粉出现的水解圈越来越明显，蛋白活性逐渐增强，表明从抗生素浓度高的平板上挑取的重组酵母菌的酶活性最大。
72.实施例5重组酵母菌的蛋白表达验证
73.从实施例4中得到g418的bmmy培养基平板(1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml)上随机挑选单菌落，接入5ml ypd液体培养基中，28℃、200rpm条件下培养12h。按照1：100分别接种上述菌液到25ml bmgy培养基中，于28℃、200rpm条件下培养直至od
600
＝8.0，离心收集菌体，用bmmy培养基重悬。菌液于28℃，200rpm条件下诱导表达96h，每隔12h加入1.5％甲醇进行蛋白的诱导表达。摇瓶发酵结束后，离心去除菌体，发酵液中的蛋白用三氯乙酸浓缩，sds
‑
page检测目的蛋白的分泌表达情况，如图3所示，重组酵母能菌能够正常分泌表达目的蛋白(～46kd)与抗生素抗性蛋白(～30kd)，相对分子量大小与理论分子量相符，从抗生素浓度高(4mg/ml)的平板上挑取的重组酵母菌的目标蛋白表达量最大。
74.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。