一种更适合黄种人群的微生态制剂的制作方法

1.本发明涉及功能性微生物制剂领域，具体涉及一种更适合黄种人群的微生态制剂。


背景技术：

2.正常人体肠道内寄居着数量庞大、种类繁多的微生物，以细菌为主，统称为肠道菌群， 肠道菌群与人体之间的关系错综复杂，贯穿于人体各种生理活动和病理过程，已成为人体不 可或缺的一部分。正常情况下，肠道各菌种与宿主相互依存、相互制约，维持一种动态的生 态平衡一旦受到宿主及外环境变化的影响，平衡状态就会被打破，从而造成肠道菌群失调。 近年来，随着分子生物学技术在肠道菌群检测方面的应用，菌群失调与疾病的相关性研究及 其在发病机制中的作用逐渐引起了人们的广泛重视，因此，研究肠道菌群失调对人体健康的 重要作用无论是对于基础研究还是临床应用，均具有重要的意义。调节肠道菌群的益生保健 食品也具有非常好的社会和经济效益。
3.但肠道菌群跟人种有关，不同种的人的生活环境不同，饮食风俗习惯等都有差别，这种 差别会直接影响肠道内的菌群分布。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种更适合黄种人群的微生态制剂。
5.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
6.一种更适合黄种人群的微生态制剂，由益生菌活菌、复合培养基、载体以及中药提取物 组成，所述益生菌活菌包括乳杆菌发酵液、双歧杆菌发酵液、链球菌发酵液、芽孢杆菌发酵 液和酵母菌发酵液，其中，所述乳杆菌、双歧杆菌、链球菌、芽孢杆菌和酵母菌的活菌数量 比为100：(60
‑
100)：(10
‑
30)：(5
‑
10)：(1
‑
5)；
7.所述双歧杆菌包括两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧 杆菌；
8.所述微生态制剂制备方法为：
9.以第一培养基分别对乳杆菌、双歧杆菌、链球菌、芽孢杆菌和酵母菌进行活化并扩大培 养，再将培养后的菌种分别接种到第二培养基中，分别发酵培养12
‑
24h，以各菌种发酵液按 活菌数量比例混合得到混合发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加入所述载体，所述载 体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得负载的载体，再与所述中药提取物混合后制得所述微生态制 剂；其中，所述第一培养基的组成为大豆蛋白胨、牛肉蛋白粉、酵母膏、醋酸钠、葡萄糖、 吐温80、柠檬酸铵、硫酸镁和水；所述第二培养基包括所述第一培养基和大豆多肽粉。
10.优选的，所述中药提取物包括山药30份、苍术15份、砂仁10份、人参8份、当归8份、 甘草4份、党参5份、茯苓8份、黄精4份、山楂10份，其制备方法是：
11.依次称取各组分，加入重量/体积比10倍的蒸馏水，浸泡4h后，并于100℃提取1h，
过 滤，再向滤渣中加入重量/体积比8倍的蒸馏水，100℃提取1h后，过滤后合并滤液，离心， 浓缩干燥制得所述中药提取物；
12.所述中药提取物与所述负载的载体的混合比例为(1
‑
100)：10。
13.优选的，所述乳杆菌为卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳 杆菌、唾液乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的至少一种。
14.优选的，所述链球菌包括嗜热链球菌、消化链球菌、粪链球菌中的至少一种。
15.优选的，所述芽孢杆菌包括凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的至少一种。
16.优选的，所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述混合发酵液质量的0.1
‑
1％。
17.优选的，所述大豆多肽粉的制备方法为：
18.s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80
‑
90℃保温 5
‑
30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；
19.s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/l、ph为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆 蛋白粉的含水率提高到50
‑
60％，再在120℃下加热10
‑
20min灭菌，得到培养基；将活化好的 黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于106cfu/ml，接种量为4
‑
8％， 接种完成后在35
‑
37℃下发酵3
‑
4d，待发酵结束后，加入蒸馏水，搅拌并浸泡后分离滤液， 将滤液浓缩干燥，制得多肽粉；
20.s3、称取3
‑
(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在dmso或dmf中，配制为质量分 数10％的溶液，制得溶液a；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在dmso或dmf中， 得到悬液a，在室温和搅拌条件下，将所述悬液a缓慢滴加到等体积的所述溶液a中，添加 完毕后继续搅拌反应24
‑
28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以dmf、二氯甲烷和冷的乙醚 洗涤后冻干制得。
21.优选的，所述载体为改性蒙脱石。
22.优选的，所述改性蒙脱石的制备方法为：
23.将蒙脱石粉碎并筛分，得到粒径在500
‑
1000筛目之间的微粉，将蒙脱石微粉按料液比 1g/100ml悬浮分散在蒸馏水中，得到悬液b，加入所述悬液b体积1
‑
2％的3
‑
(三乙氧基硅基) 丙基琥珀酸酐或3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷，在60
‑
70℃下搅拌回流12
‑
24h，回流完成后滤出 沉淀，沉淀依次以乙醇和蒸馏水洗涤制得。
24.优选的，所述改性蒙脱石的制备方法还包括以下步骤：
25.(1)烯丙基改性6
‑
氨基嘌呤制备
26.称取溴乙醇，在冰水浴条件下溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺和甲基丙烯酰氯，在室温 条件下搅拌反应12
‑
14h，反应完成后分离滤液，所述滤液依次经冰水洗涤、无水硫酸镁干燥 后蒸去二氯甲烷，得到酯化产物；称取6
‑
氨基嘌呤和氢化钠并溶解在无水dmf中，充分搅 拌均匀后，加入所述酯化产物，在室温条件下搅拌反应12
‑
14h，反应完成后分离滤液，并用 丙酮沉淀数次，真空干燥；其中，
27.所述溴乙醇与所述二氯甲烷、所述三乙胺、所述甲基丙烯酰氯的质量比例为1：(6
‑
7)： (0.1
‑
0.15)：(0.9
‑
0.95)；所述6
‑
氨基嘌呤与所述氢化钠、所述无水dmf、所述酯化产物
的 质量比例为1：(0.2
‑
0.22)：(10
‑
12)：(2.4
‑
2.5)；
28.(2)共聚产物制备
29.称取所述烯丙基改性6
‑
氨基嘌呤和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯并溶解在无水dmso中，充 分溶解后加入引发剂，经氮吹除氧后封闭反应体系，将反应体系置于70
‑
75℃下恒温反应3
‑
4d， 反应完成后冷却，分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥制得共聚产物；其中，
30.所述烯丙基改性6
‑
氨基嘌呤与所述磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、所述无水dmso、所述引 发剂的质量比例为1：(1.0
‑
1.1)：(50
‑
100)：(0.07
‑
0.09)；
31.(3)包覆产物制备
32.称取所述共聚产物并溶解在热的蒸馏水中，加入经乙醇和蒸馏水洗涤后制得的沉淀，充 分分散后边搅拌边滴加与所述蒸馏水等体积的丙酮，过滤，滤饼真空干燥后制得，其中，
33.所述共聚产物与所述沉淀、所述蒸馏水的质量比例为1：1：1000。
34.本发明的有益效果为：
35.(1)本发明通过外源性的补充具有优势地位的双歧杆菌等益生菌，形成优势菌群，可以 同时通过竞争粘附机制阻止致病微生物粘附，抑制多种病原微生物的生长，并刺激免疫系统 维持肠道微生态平衡；双歧杆菌可定植在肠粘膜表面形成生物屏障，抵御大肠杆菌、痢疾杆 菌等致病菌和条件致病菌的入侵，双歧杆菌全菌及表面分子能增强机体的非特异性和特异性 免疫反应，提高k细胞和巨噬细胞的活性，提高局部或全身的抗感染和防御功能，其产生的 抗菌性物质可抑制外源致病菌和肠道内固有腐败细菌的生长繁殖，同时调节和协调其它肠道 菌群，促进肠道蠕动，减少致病菌粘附到肠粘膜的机会，降低肠道ph值和氧化还原电势， 对有害菌起到抑制作用；本发明所述微生态制剂一方面改善肠道菌群，维持微生态平衡，另 一方面其分泌的β半乳糖苷酶填补了黄种人小肠分泌的不足，改善肠胃对乳糖的吸收和吸收， 其还能醇解寡糖产生醋酸和乳酸，减少碱性物质对大肠粘膜的刺激，促进蠕动；
36.本发明所述中药提取物可以有效地促进肠道益生菌的生长，提高活菌进入肠道中的存活 率及定植能力，调节肠道微生物群的组成以恢复其体内平衡，从而更好的改善人体健康状况。
37.(2)本发明通过先对益生菌进行高密度的前期培养，直接冻干后可以最大程度保留菌种 的活力，同时可以与培养基、益生菌代谢产物以及细菌细胞素或类细胞素等活性物质一同负 载于载体之上，使得冻干后的益生菌在使用环境中可以很快活化并继续生长，快速刺激免疫 系统维持微生态平衡，减少用药时间，提高用药效率；所述冻干保护剂不仅保护益生菌菌体 的冻干活力，本发明所述冻干保护剂还添加有低聚木糖，可通过释放而增加有益的乳杆菌的 丰度，促进生长。
38.(3)本发明以大豆为底物，以黑曲霉为发酵菌发酵制备了大豆多肽粉，一方面，大豆多 肽粉作为培养基组分，为益生菌活菌提供氨基酸源，另一方面可以作为益生菌活菌的发酵促 进剂，提高活化速度，通过氨基n末端偶联硫代异氰酸酯提高多肽粉的疏水性，提高与菌体 的亲和性及其利用度，同时提高稳定性。
39.(4)蒙脱石不仅作为菌种载体，其还对乳杆菌形成的生物膜具有支持作用，可以促进包 括乳杆菌在内的益生菌在粘膜上的定植，促进益生菌种群的快速生长，同时抑制致病
数10％的溶液，制得溶液a；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在dmso或dmf中， 得到悬液a，在室温和搅拌条件下，将所述悬液a缓慢滴加到等体积的所述溶液a中，添加 完毕后继续搅拌反应24
‑
28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以dmf、二氯甲烷和冷的乙醚 洗涤后冻干制得。
55.实施例2
56.一种更适合黄种人群的微生态制剂，其制备方法为：
57.以第一培养基分别对乳杆菌、双歧杆菌、链球菌、芽孢杆菌和酵母菌进行活化并扩大培 养，再将培养后的菌种分别接种到第二培养基中，分别发酵培养12
‑
24h，以各菌种发酵液按 活菌数量比例100：70：20：10：1混合得到混合发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加 入所述载体，所述载体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得负载的载体，所述载体为改性蒙脱石， 再与所述中药提取物混合后制得所述微生态制剂；其中，按质量份数计，所述第一培养基的 组成为：大豆蛋白胨10份、牛肉蛋白粉10份、酵母膏5份、醋酸钠5份、葡萄糖20份、吐 温800.1份、柠檬酸铵2份、硫酸镁0.58份、水1000份；所述第二培养基在所述第一培养 基的组成基础上还包括大豆多肽粉12份；
58.所述双歧杆菌包括两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧 杆菌，其接种量为1:1:1:1:1；
59.所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述混合发酵液质量的1％；
60.所述中药提取物包括山药30份、苍术15份、砂仁10份、人参8份、当归8份、甘草4 份、党参5份、茯苓8份、黄精4份、山楂10份，其制备方法是：
61.依次称取各组分，加入重量/体积比10倍的蒸馏水，浸泡4h后，并于100℃提取1h，过 滤，再向滤渣中加入重量/体积比8倍的蒸馏水，100℃提取1h后，过滤后合并滤液，离心， 浓缩干燥制得所述中药提取物；
62.所述中药提取物与所述负载的载体的混合质量比例为1：10；
63.所述乳杆菌为卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，其接种量为 1:1:1:1:1；
64.所述链球菌为嗜热链球菌；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其接种量为 1:1；
65.所述大豆多肽粉的制备方法为：
66.s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80
‑
90℃保温 5
‑
30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；
67.s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/l、ph为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆 蛋白粉的含水率提高到50
‑
60％，再在120℃下加热10
‑
20min灭菌，得到培养基；将活化好的 黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于106cfu/ml，接种量为4
‑
8％， 接种完成后在35
‑
37℃下发酵3
‑
4d，待发酵结束后，加入蒸馏水，搅拌并浸泡后分离滤液， 将滤液浓缩干燥，制得多肽粉；
68.s3、称取3
‑
(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在dmso或dmf中，配制为质量分 数10％的溶液，制得溶液a；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在dmso或dmf中， 得到悬液a，在室温和搅拌条件下，将所述悬液a缓慢滴加到等体积的所述溶液a中，添加 完毕后继续搅拌反应24
‑
28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以dmf、二氯甲烷和冷的乙醚 洗涤
后冻干制得；
69.所述改性蒙脱石的制备方法为：
70.将蒙脱石粉碎并筛分，得到粒径在500
‑
1000筛目之间的微粉，将蒙脱石微粉按料液比 1g/100ml悬浮分散在蒸馏水中，得到悬液b，加入所述悬液b体积1
‑
2％的3
‑
(三乙氧基硅基) 丙基琥珀酸酐或3
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氨基丙基三乙氧基硅烷，在60
‑
70℃下搅拌回流12
‑
24h，回流完成后滤出 沉淀，沉淀依次以乙醇和蒸馏水洗涤制得。
71.实施例3
72.一种更适合黄种人群的微生态制剂，其制备方法为：
73.以第一培养基分别对乳杆菌、双歧杆菌、链球菌、芽孢杆菌和酵母菌进行活化并扩大培 养，再将培养后的菌种分别接种到第二培养基中，分别发酵培养12
‑
24h，以各菌种发酵液按 活菌数量比例100：70：20：10：1混合得到混合发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加 入所述载体，所述载体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得负载的载体，所述载体为蒙脱石，再与 所述中药提取物混合后制得所述微生态制剂；其中，按质量份数计，所述第一培养基的组成 为：大豆蛋白胨10份、牛肉蛋白粉10份、酵母膏5份、醋酸钠5份、葡萄糖20份、吐温 800.1份、柠檬酸铵2份、硫酸镁0.58份、水1000份；所述第二培养基在所述第一培养基的 组成基础上还包括大豆多肽粉12份；
74.所述双歧杆菌包括两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧 杆菌，其接种量为1:1:1:1:1；
75.所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述混合发酵液质量的1％；
76.所述中药提取物包括山药30份、苍术15份、砂仁10份、人参8份、当归8份、甘草4 份、党参5份、茯苓8份、黄精4份、山楂10份，其制备方法是：
77.依次称取各组分，加入重量/体积比10倍的蒸馏水，浸泡4h后，并于100℃提取1h，过 滤，再向滤渣中加入重量/体积比8倍的蒸馏水，100℃提取1h后，过滤后合并滤液，离心， 浓缩干燥制得所述中药提取物；
78.所述中药提取物与所述负载的载体的混合质量比例为1：10；
79.所述乳杆菌为卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，其接种量为 1:1:1:1:1；
80.所述链球菌为嗜热链球菌；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其接种量为 1:1；
81.所述大豆多肽粉的制备方法为：
82.s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80
‑
90℃保温 5
‑
30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；
83.s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/l、ph为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆 蛋白粉的含水率提高到50
‑
60％，再在120℃下加热10
‑
20min灭菌，得到培养基；将活化好的 黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于106cfu/ml，接种量为4
‑
8％， 接种完成后在35
‑
37℃下发酵3
‑
4d，待发酵结束后，加入蒸馏水，搅拌并浸泡后分离滤液， 将滤液浓缩干燥，制得多肽粉；
84.s3、称取3
‑
(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在dmso或dmf中，配制为质量分 数10％的溶液，制得溶液a；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在dmso或dmf中， 得
到悬液a，在室温和搅拌条件下，将所述悬液a缓慢滴加到等体积的所述溶液a中，添加 完毕后继续搅拌反应24
‑
28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以dmf、二氯甲烷和冷的乙醚 洗涤后冻干制得；
85.所述改性蒙脱石的制备方法为：
86.(1)将蒙脱石粉碎并筛分，得到粒径在500
‑
1000筛目之间的微粉，将蒙脱石微粉按料 液比1g/100ml悬浮分散在蒸馏水中，得到悬液b，加入所述悬液b体积1％的3
‑
(三乙氧基硅 基)丙基琥珀酸酐或加入所述悬液b体积1.6％的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷，在60
‑
70℃下搅拌 回流12
‑
24h，回流完成后滤出沉淀，沉淀依次以乙醇和蒸馏水洗涤制得初产物；
87.(2)烯丙基改性6
‑
氨基嘌呤制备
88.称取溴乙醇4g，在冰水浴条件下溶解在20ml的二氯甲烷中，加入0.4g三乙胺和3.7g甲 基丙烯酰氯，在室温条件下搅拌反应12
‑
14h，反应完成后分离滤液，所述滤液依次经冰水洗 涤、无水硫酸镁干燥后蒸去二氯甲烷，得到酯化产物；称取6
‑
氨基嘌呤2g和氢化钠0.4g，并 溶解在50ml无水dmf中，充分搅拌均匀后，加入5g所述酯化产物，在室温条件下搅拌反 应12
‑
14h，反应完成后分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥制得烯丙基改性6
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氨基嘌呤；
89.(3)共聚产物制备
90.称取0.8g所述烯丙基改性6
‑
氨基嘌呤和0.85g磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯并溶解在40ml 无水dmso中，充分溶解后加入0.06g的偶氮二异丁腈，经氮吹除氧后封闭反应体系，将反 应体系置于75℃下恒温反应3d，反应完成后冷却，分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥 制得共聚产物；
91.(4)包覆产物制备
92.称取所述共聚产物并溶解在热的蒸馏水中，加入所述初产物，充分分散后边搅拌边滴加 与所述蒸馏水等体积的丙酮，过滤，滤饼真空干燥后制得，其中，所述共聚产物与所述沉淀、 所述蒸馏水的质量比例为1：1：1000。
93.实验例
94.1、建立高血脂症大鼠动物模型
95.选用8周龄，体重200
‑
225g的雄性大鼠50只，适应性饲养3天后，随机分为2组(正 常组：10只，高脂模型组：40只)，采用高脂饲料喂养法来建造高脂血症大鼠动物模型，正 常组进食正常基础饲料，高脂模型组进食高脂饲料，饮用经紫外线消毒的自来水，喂养时间 30天，30天后禁食12h，眼眶取血检测大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固 醇的含量，其结果呈现显著差异，具体见表1。
96.表1
97.含量(mmol/l)总胆固醇甘油三酯低密度脂蛋白胆固醇正常组1.420.761.72高脂模型组2.380.821.69
98.随机将高脂模型组分为4组，模型组和3组治疗组，每组10只，治疗组喂养高脂饲料， 每天灌胃2次实施例1
‑
3所述微生态制剂，正常组合模型组每天灌胃2次等量生理盐水，喂 养时间60天，60天后禁食12h，眼眶取血检测大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋 白胆固醇的含量，其结果呈现显著差异，具体见表2。
99.表2
[0100][0101][0102]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围 的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。