一种捕获cfDNA5hmC片段的检测方法与流程

一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法
技术领域
1.本发明涉及捕获cfdna5hmc片段技术领域，具体为一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法。


背景技术：

[0002]5‑
羟甲基胞嘧啶(5
‑
hydroxymethylcytosine,5hmc)最早于1952年在噬菌体dna中被发现。它能被糖基转移酶介导发生糖基化修饰，从而使噬菌体dna在进入宿主后能抵抗宿主限制酶的降解。但当时5hmc的功能并没有引起更多的重视。直到2009年，heintz和rao研究组分别在同期science杂志上报道了在人和小鼠的脑、胚胎干细胞dna中含有丰富的5hmc，这才让更多的研究人员重新着手认识这个修饰碱基，随着研究的深入,5hmc参与的重要生物学作用逐渐被人们发现,同时也促使着5hmc的检测和定量方法不断发展.为了区分5hmc与其他胞嘧啶衍生物,很多利用化学或者酶学修饰实现靶向检测或非靶向富集5hmc的方法应运而生.但目前效果并不理想。因此我们对此做出改进，提出一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法。


技术实现要素：

[0003]
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0004]
本发明一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法，包括以下步骤：
[0005]
步骤一：预先准备需要使用的试剂，置于冰上，建立体系，温度时间为37℃、2h；
[0006]
步骤二：加入2.5μldbco
‑
peg4
‑
biotin,37℃，孵育2h；
[0007]
步骤三：再使用microbio
‑
spin30column(bio
‑
rad)纯化；
[0008]
步骤四：取5μlci磁珠，吹打均匀后置于磁力架上，待澄清后吸走上清液，加50μl的2*buffer1在旋转架上孵育3min后，置于磁力架上待澄清后吸走上清液，再加50μl的2*buffer1吹打均匀重悬磁珠；
[0009]
步骤五：将均匀的重悬磁珠加到已定容至50μl的1.5ml管中，在旋转架上孵育30min；
[0010]
步骤六：分别用100μl的buffer1(1x)，buffer2(1x),buffer3，andbuffer4洗脱，每种buffer洗两次，每次洗时置于旋转架上5min。
[0011]
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤一中，建立体系选择试剂10*buffer、60μmudp
‑6‑
n3
‑
gle、12.5ubgt、dna和水的混合物，所述试剂的质量分别为2.5μl、0.5μl、1.25μl和21μl。
[0012]
3、根据权利要求1所述的一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法，所述步骤一中，试剂准备包括以下步骤：
[0013]
s1：ampurexpbead应提前在室温放置30min，充分混匀成磁珠悬浮液；
[0014]
s2：取出新的1.5m低吸附离心管中，连接接头后的样本依次转入已标记的管，并加入80μl(0.8倍样本体积)ampurexpbead，吹打混匀，室温放置5min后；
[0015]
s3：将珠子放在磁石座上(放置于磁力架时不要将管子放的太低)，待液体完全澄清之后，用量程大于溶液总体积的大小枪尖组合吸走上清液；
[0016]
s4：加200μl的80％乙醇到每个管中，等待30秒后，用量程大于溶液总体积的大小枪尖组合吸走上清液；
[0017]
s5：重复第13步，用乙醇共洗两次，吸出多余的80％乙醇；
[0018]
s6：室温放置5min，使管中残留的乙醇完全挥发(磁珠表面不反光，表面无裂纹或微有裂纹)；
[0019]
s7：加入11μlnuclease
‑
freewater(以dna输入10ng为例，洗脱后浓度约为1ng/ul)，吹打混匀，室温放置1min；
[0020]
s8：瞬时离心后，将ep管放在磁力架上，至溶液变澄清；吸取上清到一个新的1.5ml低吸附管中进行后续操作；
[0021]
s9：取其中一半进行5hmc，剩余产物保存在
‑
80℃。
[0022]
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中，使用microbio
‑
spin30column(bio
‑
rad)纯化的方法包括以下步骤：
[0023]
步骤一：摇匀试剂后除气泡，打开下部封口，放入专用的2ml收集管中，放置2min，让液体流穿，将2ml管中的液体倒掉；
[0024]
步骤二：1000g，离心2min；
[0025]
步骤三：将柱子移到专用的1.5mlep收集管中，1000g离心4min，定容至50μl。
[0026]
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中，磁珠(ampurexp磁珠、t1磁珠)瞬时离心操作时为避免磁珠沉降，选用型号scilogex的d1008的掌式离心机。
[0027]
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤六中，旋转之后先瞬离一下避免损失盖上液体。
[0028]
本发明的有益效果是：该种捕获cfdna5hmc片段的检测方法，利用链霉亲和素涂层磁珠扩增生物素化的dna片段。该磁珠可以进行“下拉”分析，将具有5hmc的dna分子与没有生物标记的dna分子分离，通过对目标片段进行测序和生物信息学分析，最终获得表观遗传标记，很大程度上提高了5hmc捕捉的效率；
[0029]
特异的dna片段捕捉共价连接的biotin保证了捕捉过程中不受到传统的抗原
‑
抗体作用亲和能力的限制，进而特异的捕捉了含有5hmc的dna片段，本方案高效/特异的捕获效率和最低程度的dna降解，可被有效应用于微量dna起始的临床场景，包括各类珍贵的临床样品，比如游离核酸及流式筛选细胞。
附图说明
[0030]
图1是本发明一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法的流程图；
[0031]
图2是本发明一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法的试剂准备流程图；
[0032]
图3是本发明一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法的纯化流程图。
具体实施方式
[0033]
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]
实施例一：如图1
‑
2所示，本发明一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法，包括以下步骤：
[0035]
步骤一：预先准备需要使用的试剂，置于冰上，建立体系，温度时间为37℃、2h；
[0036]
步骤二：加入2.5μldbco
‑
peg4
‑
biotin,37℃，孵育2h；
[0037]
步骤三：再使用microbio
‑
spin30column(bio
‑
rad)纯化；
[0038]
步骤四：取5μlci磁珠，吹打均匀后置于磁力架上，待澄清后吸走上清液，加50μl的2*buffer1在旋转架上孵育3min后，置于磁力架上待澄清后吸走上清液，再加50μl的2*buffer1吹打均匀重悬磁珠；
[0039]
步骤五：将均匀的重悬磁珠加到已定容至50μl的1.5ml管中，在旋转架上孵育30min；
[0040]
步骤六：分别用100μl的buffer1(1x)，buffer2(1x),buffer3，andbuffer4洗脱，每种buffer洗两次，每次洗时置于旋转架上5min。
[0041]
其中，步骤一中，建立体系选择试剂10*buffer、60μmudp
‑6‑
n3
‑
gle、12.5ubgt、dna和水的混合物，试剂的质量分别为2.5μl、0.5μl、1.25μl和21μl。
[0042]
其中，步骤一中，试剂准备包括以下步骤：
[0043]
s1：ampurexpbead应提前在室温放置30min，充分混匀成磁珠悬浮液；
[0044]
s2：取出新的1.5m低吸附离心管中，连接接头后的样本依次转入已标记的管，并加入80μl(0.8倍样本体积)ampurexpbead，吹打混匀，室温放置5min后；
[0045]
s3：将珠子放在磁石座上(放置于磁力架时不要将管子放的太低)，待液体完全澄清之后，用量程大于溶液总体积的大小枪尖组合吸走上清液；
[0046]
s4：加200μl的80％乙醇到每个管中，等待30秒后，用量程大于溶液总体积的大小枪尖组合吸走上清液；
[0047]
s5：重复第13步，用乙醇共洗两次，吸出多余的80％乙醇；
[0048]
s6：室温放置5min，使管中残留的乙醇完全挥发(磁珠表面不反光，表面无裂纹或微有裂纹)；
[0049]
s7：加入11μlnuclease
‑
freewater(以dna输入10ng为例，洗脱后浓度约为1ng/ul)，吹打混匀，室温放置1min；
[0050]
s8：瞬时离心后，将ep管放在磁力架上，至溶液变澄清；吸取上清到一个新的1.5ml低吸附管中进行后续操作；
[0051]
s9：取其中一半进行5hmc，剩余产物保存在
‑
80℃。
[0052]
实施例二：如图3所示，本发明一种捕获cfdna5hmc片段的检测方法，包括以下步骤：
[0053]
步骤一：预先准备需要使用的试剂，置于冰上，建立体系，温度时间为37℃、2h；
[0054]
步骤二：加入2.5μldbco
‑
peg4
‑
biotin,37℃，孵育2h；
[0055]
步骤三：再使用microbio
‑
spin30column(bio
‑
rad)纯化；
[0056]
步骤四：取5μlci磁珠，吹打均匀后置于磁力架上，待澄清后吸走上清液，加50μl的2*buffer1在旋转架上孵育3min后，置于磁力架上待澄清后吸走上清液，再加50μl的2*buffer1吹打均匀重悬磁珠；
[0057]
步骤五：将均匀的重悬磁珠加到已定容至50μl的1.5ml管中，在旋转架上孵育
30min；
[0058]
步骤六：分别用100μl的buffer1(1x)，buffer2(1x),buffer3，andbuffer4洗脱，每种buffer洗两次，每次洗时置于旋转架上5min。
[0059]
特异的dna片段捕捉共价连接的biotin保证了捕捉过程中不受到传统的抗原
‑
抗体作用亲和能力的限制，进而特异的捕捉了含有5hmc的dna片段，本方案高效/特异的捕获效率和最低程度的dna降解，可被有效应用于微量dna起始的临床场景，包括各类珍贵的临床样品，比如游离核酸及流式筛选细胞。
[0060]
其中，步骤三中，使用microbio
‑
spin30column(bio
‑
rad)纯化的方法包括以下步骤：
[0061]
步骤一：摇匀试剂后除气泡，打开下部封口，放入专用的2ml收集管中，放置2min，让液体流穿，将2ml管中的液体倒掉；
[0062]
步骤二：1000g，离心2min；
[0063]
步骤三：将柱子移到专用的1.5mlep收集管中，1000g离心4min，定容至50μl。
[0064]
其中，步骤四中，磁珠(ampurexp磁珠、t1磁珠)瞬时离心操作时为避免磁珠沉降，选用型号scilogex的d1008的掌式离心机。
[0065]
其中，步骤六中，旋转之后先瞬离一下避免损失盖上液体。
[0066]
利用链霉亲和素涂层磁珠扩增生物素化的dna片段。该磁珠可以进行“下拉”分析，将具有5hmc的dna分子与没有生物标记的dna分子分离，通过对目标片段进行测序和生物信息学分析，最终获得表观遗传标记，很大程度上提高了5hmc捕捉的效率。
[0067]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。