IFITM3蛋白相关物质在制备禽呼肠孤病毒所致疾病药物中的应用的制作方法

ifitm3蛋白相关物质在制备禽呼肠孤病毒所致疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及ifitm3蛋白相关物质在制备禽呼肠孤病毒所致疾病药物中的应用。


背景技术：

2.禽呼肠孤病毒(avian reovirus,arv)属于正呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，是一种不含囊膜的双链rna病毒。arv是一种重要禽类免疫抑制性疾病，其对环境的抵抗力强，既可水平传播又可垂直传播，在我国鸡群中普遍存在，能够引起病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征等，尤为严重的是诱发免疫抑制，造成机体对疫苗免疫应答能力和多种病原体抵抗能力的降低，并发或继发其它疾病，给养禽业者造成了巨大的经济损失。目前还没有有效的治疗措施，主要通过疫苗接种进行有效的防治；市面上已有多种弱毒疫苗和灭活疫苗，其中应用较多的疫苗主要是s1133和vm0207这两个疫苗株。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病或禽呼肠孤病毒感染的药物，和/或如何制备禽呼肠孤病毒抑制剂。
4.为了解决以上技术问题，本发明提供了增强ifitm3蛋白的活性和/或提高ifitm3蛋白的基因的表达量和/或提高ifitm3蛋白的含量的物质的如下应用：
5.u1在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病或禽呼肠孤病毒感染的药物中的应用；
6.u2在制备禽呼肠孤病毒抑制剂中的应用；
7.u3在抑制arvσc表达中的应用；
8.所述ifitm3蛋白是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
9.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
10.a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同活性的蛋白质；
11.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
12.其中，序列表中的序列1由113个氨基酸残基组成。
13.上述应用中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
14.上述应用中，所述蛋白质标签(protein
‑
tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
15.上述应用中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源
性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
16.上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
17.上述应用中，所述禽呼肠孤病毒抑制剂具有抑制禽呼肠孤病毒复制的功能。
18.上述应用中，所述增强ifitm3蛋白的活性和/或提高ifitm3蛋白的基因的表达量和/或提高ifitm3蛋白的含量的物质为与ifitm3蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：
19.b1)编码所述ifitm3的核酸分子；
20.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
21.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
22.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
23.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
24.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
25.上述应用中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
26.b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cdna分子或dna分子；
27.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子。
28.其中，序列表中的序列2由342个核苷酸组成，编码序列表中的序列1所示的蛋白质。
29.上述应用中，b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(ifitm3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ifitm3的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动ifitm3基因转录的启动子，还可包括终止ifitm3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
30.可用现有的真核表达载体构建含有所述ifitm3基因表达盒的重组表达载体。所述真核表达载体可为pef1α
‑
myc、pcdna3.1
‑
ha、pegfp等。
31.上述应用中，所述动物细胞系具体可为鸡胚成纤维细胞(df1)。
32.上述应用中，所述禽呼肠孤病毒所致疾病可为禽类的病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和吸收不良综合征等。
33.本发明还保护禽呼肠孤病毒抑制剂。
34.所述抑制剂可只为增强ifitm3蛋白的活性和/或提高ifitm3蛋白的基因的表达量和/或提高ifitm3蛋白的含量的物质，也可还含有载体或赋形剂。
35.上述禽呼肠孤病毒抑制剂中，所述增强ifitm3蛋白的活性和/或提高ifitm3蛋白
的基因的表达量和/或提高ifitm3蛋白的含量的物质为与ifitm3蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：
36.b1)编码ifitm3的核酸分子；
37.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
38.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
39.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
40.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
41.上述禽呼肠孤病毒抑制剂中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
42.b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cdna分子或dna分子；
43.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子。
44.本发明通过将编码ifitm3蛋白的基因转入鸡胚成纤维细胞(df1)，发现了df1细胞中过表达ifitm3后arvσc的相对表达量极显著降低，抑制禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)病毒复制。本发明对感染禽呼肠孤病毒及类似病毒的治疗具有应用价值。
附图说明
45.图1为本发明实施例1中ifitm3片段pcr扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。图中m为dl2000 dna marker；泳道1为pcr扩增产物，箭头指示的是ifitm3片段。
46.图2为本发明实施例1中pef1α
‑
myc
‑
ifitm3以salⅰ和notⅰ双酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图。图中m为dl5000 dna marker；1为pef1α
‑
myc
‑
ifitm3质粒；2为pef1α
‑
myc
‑
ifitm3双酶切产物，箭头指示的是ifitm3基因片段。
47.图3为本发明实施例1中间接免疫荧光验证ifitm3真核表达的结果图。图中a为pef1α
‑
myc转染的阴性对照组，b为pef1α
‑
myc
‑
ifitm3转染的实验组。
48.图4为本发明实施例1中western
‑
blot验证ifitm3真核表达的结果图。
49.图5为本发明实施例1中rt
‑
qpcr检测arvσc相对表达量。图中vec为pef1α
‑
myc转染，ifitm3为pef1α
‑
myc
‑
ifitm3转染，所示数据为平均值
±
标准差，重复数为3，以t
‑
tests分析各组显著性差异，***代表显著性分析结果为p<0.001。
具体实施方式
50.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
51.下述实施例中去内毒素的真核表达载体pef1α
‑
myc为clontech公司产品，货号631991。
52.下述实施例中鸡胚成纤维细胞(df1)、arv病毒s1133毒株记载于非专利文献“万丽军等.禽呼肠孤病毒σc蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析.中国兽医科学，2021，51
(04)：0492
‑
0499”，公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。
53.下述实施例中所有的引物合成和测序均由瑞博兴科生物技术有限公司完成。
54.下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
55.实施例1
56.本次实验中使用的引物如下：
57.表1引物序列
[0058][0059][0060]
注:下划线指示的序列为salⅰ酶识别位点，双下划线指示的序列为notⅰ酶识别位点。
[0061]
1重组表达载体pef1α
‑
myc
‑
ifitm3的构建及鉴定
[0062]
ifitm3是氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。
[0063]
以鸡胚成纤维细胞(df1)抽提的总rna反转录的cdna为模板，用特异性引物(见表1中针对ifitm3基因的f和r)pcr扩增ifitm3基因(核苷酸序列为序列表中的序列2)，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，大小约为342bp(见图1)。将ifitm3基因的pcr产物用t4 dna连接酶16℃过夜连接到以salⅰ和notⅰ双酶切线性化的真核表达载体pef1α
‑
myc上，构建重组质粒pef1α
‑
myc
‑
ifitm3：pef1α
‑
myc
‑
ifitm3是用编码序列(cds)是序列表中序列2的ifitm3基因替换pef1α
‑
myc载体的限制性核酸内切酶salⅰ和notⅰ识别位点间的片段(包括salⅰ的识别位点和notⅰ的识别位点在内的小片段)，保持pef1α
‑
myc载体的其它序列不变，得到的ifitm3基因的重组表达载体。
[0064]
将pef1α
‑
myc
‑
ifitm3转化到dh5α感受态细胞中，筛选阳性菌落得到pef1α
‑
myc
‑
ifitm3重组菌，并对其以salⅰ和notⅰ限制性内切酶双酶切验证及测序验证。双酶切验证结果见图2，从图中可以看出pef1α
‑
myc
‑
ifitm3经双酶切后得到两条目的条带，大小与预计的相符，分别约为4622bp的载体条带和342bp的ifitm3基因条带，说明已将ifitm3基因正确插入到表达载体pef1α
‑
myc。测序结果也证实pef1α
‑
myc
‑
ifitm3含有序列表序列2所示的核苷酸序列，表明真核表达载体pef1α
‑
myc
‑
ifitm3构建成功。
[0065]
2在df1细胞中过表达ifitm3基因
[0066]
采用无内毒素质粒提取试剂盒，抽提pef1α
‑
myc
‑
ifitm3重组质粒和真核表达载体pef1α
‑
myc质粒。
[0067]
于6孔板中培养df1细胞，待细胞密度达到约80％时，参照脂质体转染试剂盒
lipofectamine 3000使用说明，将pef1α
‑
myc
‑
ifitm3(实验组)、pef1α
‑
myc(对照组)分别转染df1细胞，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。
[0068]
3 ifitm3蛋白表达的间接免疫荧光和western
‑
blot验证
[0069]
3.1间接免疫荧光验证
[0070]
步骤2中df1细胞转染48h后(分别转染pef1α
‑
myc
‑
ifitm3(实验组)和pef1α
‑
myc(对照组))，弃去培养液，用pbs洗涤三次，用4％组织细胞固定液4℃固定30min，0.1％triton
‑
x
‑
100通透15min，5％bsa封闭液封闭1h，加入anti
‑
myc tag mouse mab(abcam公司产品)(1:1000稀释)作为一抗，37℃孵育2h，pbs洗涤三次，加入fitc标记的山羊抗鼠igg(invitrogen公司产品)(1:1000稀释)作为二抗，37℃避光孵育1h，pbs洗涤三次，通过荧光显微镜观察拍照。
[0071]
结果见图3，真核表达重组质粒pef1α
‑
myc
‑
ifitm3转染的df1细胞均可观察到绿色荧光，而pef1α
‑
myc转染的阴性对照组细胞未见绿色荧光。表明转染pef1α
‑
myc
‑
ifitm3后的df1细胞表达ifitm3蛋白，转染了pef1α
‑
myc质粒的df1细胞没有表达ifitm3蛋白。
[0072]
3.2 western
‑
blot验证
[0073]
步骤2中df1细胞转染48h后(分别转染pef1α
‑
myc
‑
ifitm3(实验组)和pef1α
‑
myc(对照组))，弃去培养液，pbs洗涤三次，用xtractor buffer细胞裂解液充分裂解细胞，获得蛋白样品，通过western
‑
blot验证ifitm3蛋白的表达，采用anti
‑
myc tag mouse mab(abcam公司产品)(1:1000稀释)作为一抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔igg(碧云天公司产品)(1:500稀释)作为二抗，用bcip/nbt碱性磷酸酯酶显色试剂盒对pvdf膜进行显色并拍照。结果见图4，真核表达重组质粒pef1α
‑
myc
‑
ifitm3转染的df1细胞中能够检测到myc
‑
ifitm3融合蛋白的特异性条带，大小约为12kda，而pef1α
‑
myc转染的阴性对照组没有目的条带，表明转染pef1α
‑
myc
‑
ifitm3后的df1细胞表达ifitm3蛋白，转染了pef1α
‑
myc质粒的df1细胞没有表达ifitm3蛋白。
[0074]
4 rt
‑
qpcr检测ifitm3对arv病毒复制的影响
[0075]
于6孔板中培养df1细胞，待细胞密度达到约80％时，采用脂质体转染法将pef1α
‑
myc
‑
ifitm3转染到细胞中过表达ifitm3基因，24h后感染arv病毒s1133毒株，moi＝1，感染后24h收集细胞样品，抽提rna并反转录成cdna，通过荧光定量pcr方法检测arvσc基因的表达量，并以gadph为内参基因，以pef1α
‑
myc转染为对照，评价过表达ifitm对arv病毒复制的影响。针对arvσc的引物见表1中针对arvσc基因的f和r，针对内参gapdh的引物见表1中针对gapdh基因的f和r。设置3组重复，以t
‑
tests分析各组显著性差异。
[0076]
结果见图5，实验组的arvσc相对表达量低于对照组，且差异性极显著。研究发现σc蛋白参与构成了病毒的外衣壳，以同源三聚体的形式吸附于易感细胞表面的受体，在病毒感染过程中发挥重要的作用，可作为arv的检测指标。由此可以推断df1细胞中过表达ifitm3后能够抑制arv病毒复制，可用于制备禽呼肠孤病毒抑制剂，可用于预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病。
[0077]
本发明为arv感染的临床治疗提供了新的思路，对于诊治arv感染引起的疾病具有重要意义。
[0078]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。