一种伯克霍尔德氏菌及其用途的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种伯克霍尔德氏菌及其用途。


背景技术：

2.硝基苯酚类化合物（nitrophenol）常作为医药、农药、染料等合成前体，不仅在光化学品生产过程中得到广泛应用，也可用作生化检测试剂。随着工业的不断发展，环境中来自于有机合成、制造染料、生产炸药以及医药等行业的硝基苯酚类化合物污染也持续增长。
3.这类化合物在生产和使用过程中很容易被释放到外界环境中，已成为重要的环境污染物质。硝基苯酚类化合物在环境中稳定且难以降解的原因是硝基的引入，芳香硝基化合物苯环上的h被硝基取代，硝基基团的吸电子特性会使得本就具有高稳定性的苯环电子云密度降得更低，更难受到氧的攻击从而被微生物降解，在环境中长期残留、积累，在生物体内滞留、富集。
4.硝基苯酚类化合物对自然和人类产生了巨大的危害，如何处理自然界中残余的此类化合物成为一个重要的问题。目前可用于硝基苯酚污染治理的方法中，物理法主要包括吸附法，但吸附法对吸附材料要求较高；而化学法主要包括氧化法，此种方法能量消耗大且适用范围窄。目前迫切需要找到一种简便高效的降解硝基苯酚类化合物的方法。


技术实现要素：

5.本发明针对上述问题，提供了一种解决方法，即公开了一种伯克霍尔德氏菌及其用途，该种2,6
‑
二硝基酚降解菌株是以2,6
‑
二硝基酚为唯一碳氮源的菌株，对于水体和土壤中的2,6
‑
二硝基酚污染均有较高的降解效率和浓度耐受限度。
6.本发明提供了一种菌株：该菌株于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为cctcc no: m 2020410，分类命名为burkholderia sp.m
‑
1。
7.所述菌株m
‑
1的筛选方法，包括：先将含有硝基苯酚类化合物的土壤或水体在条件适宜的培养基中培养，获得菌落，所述菌落中包含多种菌株；再将所述多种菌株分别培养，通过测定培养基中硝基苯酚类化合物的含量筛选出所述菌株m
‑
1；其中，所述培养基被配置为以硝基苯酚类化合物为唯一碳源的培养基。
8.本发明还提供了所述菌株m
‑
1用于降解硝基苯酚类化合物的用途。
9.经实验验证，菌株m
‑
1在与硝基苯酚类化合物混合培养时，能够脱去硝基苯酚类化合物中的硝基，使得原本因苯环上的h被硝基取代从而难以降解的硝基苯酚类化合物变得易于修复。因此，菌株m
‑
1可以用于降解硝基苯酚类化合物，脱去硝基苯酚类化合物中的硝基基团。
10.本发明还提供了所述菌株m
‑
1用于降解2,6
‑
二硝基酚的用途。
11.经筛选获得的菌株m
‑
1，在以2,6
‑
二硝基酚作为唯一碳源和氮源的无机盐培养基中培养后，能将0.3mm 2,6
‑
二硝基酚完全降解，降解菌株生长的od
600
值上升。同时，未添加
菌株m
‑
1的对照组中，2,6
‑
二硝基酚浓度没有明显变化。菌株m
‑
1降解2,6
‑
二硝基酚的过程中，检测到亚硝酸根的生成，说明该菌株是通过氧化脱硝基降解2,6
‑
二硝基酚；此外，检测到生成的亚硝酸根是2,6
‑
二硝基酚的2倍，说明菌株m
‑
1能够氧化脱去2,6
‑
二硝基酚的2个硝基。
12.使用时将所述菌株m
‑
1与硝基苯酚类化合物在条件适宜的培养基中混合培养，获得降解液；将所述降解液投入到含有硝基苯酚类化合物的土壤或水体中进行降解。
13.具体地，先将具有活性的所述菌株m
‑
1接种在体积比为4：1的无机盐和lb液体培养基（培养基包括作为唯一碳氮源的硝基苯酚类化合物）中振荡培养，将菌体离心后经清洗和重悬后获得降解液，并将该降解液加入包括待降解的硝基苯酚类化合物的无机盐培养基中振荡培养并进行降解反应。
14.在一些可能的实现方式中，所述硝基苯酚类化合物被配置为2,6
‑
二硝基酚。
15.在一些可能的实现方式中，所述菌株m
‑
1降解2,6
‑
二硝基酚的条件为温度25～30℃。
16.在一些可能的实现方式中，所述菌株m
‑
1降解2,6
‑
二硝基酚的条件为ph范围为6～8。
17.在一些可能的实现方式中，还包括在所述培养基中加入乳酸、葡萄糖或琥珀酸中的一种或多种。
18.在一些可能的实现方式中，所述培养基中2,6
‑
二硝基酚的浓度范围为0.1～1.0mm。
19.本发明具有以下优势：1.本发明提供的菌株m
‑
1是已报道的伯克霍尔德氏菌属中第一株能够利用2,6
‑
二硝基酚作为唯一碳氮源和能源生长的细菌，可以快速有效的将2,6
‑
二硝基酚降解为二氧化碳和水，在去除环境中2,6
‑
二硝基酚污染时能够达到完全脱毒；2.本发明提供的菌株m
‑
1对于2,6
‑
二硝基酚底物浓度的耐受上限值较高，最高能够降解0.9 mm的污染物，证明本发明菌株可以有效地修复污染较为严重的环境；3.本发明对提供的菌株m
‑
1的生长及2,6
‑
二硝基酚降解情况进行了优化，可以更有效、充分地对环境中的2,6
‑
二硝基酚进行降解，解决污染问题；4.本发明采用微生物方法降解环境中的污染物，具有高效、无二次污染、成本低的优点，尤其在对含有2,6
‑
二硝基酚污染物的治理上具有良好的应用前景。
附图说明
20.图1为菌株m
‑
1降解特性的检测结果；图2为菌株m
‑
1降解优化条件的检测结果；图3为菌株m
‑
1的耐受力检测结果。
具体实施方式
21.下面将结合附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，
都属于本发明保护的范围。
22.目前，国内外关于降解2,6
‑
二硝基酚菌种的研究极少，目前只有2株细菌被报道能够降解该污染物。cupriavidus necator jmp134能够利用2,6
‑
二硝基酚为唯一碳源、氮源和能源生长。pseudomonas sp. n
‑
26
‑
8添加琥珀酸为碳源时能够利用2,6
‑
二硝基酚为氮源生长。至今为止，未见伯克霍尔德氏菌属（burkholderia）对2,6
‑
二硝基酚降解的相关报道。
23.实施例1 菌株m
‑
1的分离、鉴定菌株m
‑
1来源于中国烟台某化工厂的活性污染和污水排放口附近的泥土。
24.液体无机盐培养基的组分包括：磷酸氢二钠（na2hpo4•
12h2o）14.3 g，磷酸二氢钾（kh2po4）3 g，硫酸镁（mgso4•
7h2o）0.06 mg，硫酸亚铁（feso4•
7h2o）0.3 mg，硫酸锰（mnso4•
h2o）0.28 mg，硫酸铜（cuso4）0.05 mg，硫酸锌（znso4）0.05 mg，硼酸（h3bo3）0.05 mg；取以上化合物用双蒸水溶解并定容至1000 ml，调节ph至7.0，在121℃高压灭菌20min。
25.无机盐固体培养基的配置：向前述的液体无机盐培养基100ml中加入2g琼脂粉。
26.取采集到的土壤样品1g加入250ml装有100ml无机盐培养基的锥形瓶中，并添加2,6
‑
二硝基酚至终浓度为0.3 mm作为唯一的碳源和氮源。将锥形瓶置于180rpm的摇床中，30℃培养5天。
27.按照10%接种量转接至100ml新鲜无机盐培养基中，加入2,6
‑
二硝基酚使其终浓度为0.3 mm，每隔5天进行转接，重复3次。
28.取最后一次的培养液进行10
‑1到10
‑4梯度稀释，并且将稀释液分别涂布到无机盐平板培养基（加入0.3 mm 2,6
‑
二硝基酚），置于培养箱中30℃培养2天，然后将单个菌种逐个接种到2,6
‑
二硝基酚终浓度为0.3 mm的无机盐液体培养基中，置于180 rpm的摇床中，30℃培养，通过hplc测定培养基中2,6
‑
二硝基酚的含量，同时观察培养液的浑浊度，最终筛选出2,6
‑
二硝基酚降解菌株。
29.经测序，发现与所述菌株m
‑
1序列同源性达到﹥99%并已验证的菌种为伯克霍尔德氏菌属（burkholderia sp.），所以鉴定该菌株为伯克霍尔德氏菌，命名为m
‑
1。
30.实施例2 菌株m
‑
1的降解特性检测取具有活性的菌株m
‑
1单菌落接种在体积比为4：1的无机盐和lb液体培养基中振荡培养，该培养基中2,6
‑
二硝基酚浓度为0.3 mm。过夜培养后收集菌体，用无机盐培养基清洗3次并重悬于无机盐培养基中，作为降解液待用；在含有2,6
‑
二硝基酚（0.3 mm）的无机盐培养基中按照初始od
600
=0.05的接种量接入前述的降解液，置于180 rpm的摇床中，30℃培养并间隔取样，用分光光度计检测od
600
，并根据菌体生长情况绘制菌株生长曲线（od
600
，
○
）。
31.另外，取样12000 rpm离心，收集上清，利用hplc检测上清中2,6
‑
二硝基酚的浓度，绘制其降解曲线（2,6
‑
dnp,
×
）。
32.另外，使用盐酸α
‑
萘胺分光光度法检测亚硝酸根离子浓度，绘制浓度曲线（亚硝酸根，
△
）。设置不添加降解菌株的无机盐液体培养基（补加0.3mm 2,6
‑
二硝基酚）为对照组，绘制其曲线（对照，
□
）。
33.具体结果如图1所示，从图1可看出，菌株m
‑
1在无机盐培养基（补加0.3mm 2,6
‑
二硝基酚）中，在20小时内能将0.3mm 2,6
‑
二硝基酚完全降解，同时，降解菌株生长的od
600
值上升。不添加降解菌株的对照组中2,6
‑
二硝基酚浓度没有明显变化。说明菌株m
‑
1能利用2,
6
‑
二硝基酚为唯一碳源和氮源生长。
34.在菌株m
‑
1降解2,6
‑
二硝基酚的过程中，检测到亚硝酸根的生成，说明该菌株是通过氧化脱硝基降解2,6
‑
二硝基酚；此外，生成的亚硝酸根是2,6
‑
二硝基酚的2倍，说明m
‑
1能够氧化脱去2,6
‑
二硝基酚的2个硝基。
35.实施例3 菌株m
‑
1降解条件的优化将菌株m
‑
1接种至含有2,6
‑
二硝基酚浓度为0.3mm的无机盐培养基中，调整无机盐培养基的ph值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，菌株m
‑
1接种量为初始od600=0.05，然后置于180 rpm的摇床中，30℃培养并间隔取样，12000 rpm离心，收集上清，利用hplc检测上清中2,6
‑
二硝基酚的浓度，绘制其降解曲线。结果如图2所示。
36.由图2可知，菌株m
‑
1降解2,6
‑
二硝基酚的最适ph为7.0，在30小时内降解率达到100%，ph为6.0时，在第35小时时降解率达到100%，在ph为5.0和9.0时，2,6
‑
二硝基酚的降解率受到抑制，当ph为8.0时，其在35小时后的降解率仅为30%。
37.实施例4 菌株m
‑
1的最大耐受能力验证将筛选获得的菌株m
‑
1接种至2,6
‑
二硝基酚浓度分别为0.1、0.3、0.6、0.9、1.0mmol/l的无机盐培养基中，培养基ph为7.0，置于温度30℃，转速180 rpm的摇床培养，并间隔取样，12000 rpm离心，收集上清。利用hplc检测上清中2,6
‑
二硝基酚的浓度。结果如图3所示。
38.由图3可知，随着浓度的升高菌株降解效果变差，2,6
‑
二硝基酚浓度在0.9 mm以上时菌体几乎没有生长和降解，因为2,6
‑
二硝基酚浓度越高对细胞的毒性越大，菌株可以耐受0.9mm的2,6
‑
二硝基酚。
39.实施例5 有机物对菌株m
‑
1降解效率的影响将筛选获得的菌株m
‑
1接种至2,6
‑
二硝基酚浓度为0.3mm的无机盐培养基，培养基ph为7.0，向培养基中分别添加乳酸、葡萄糖和琥珀酸，使各有机物浓度分别为0.1、0.5、5.0g/l，菌株m
‑
1的初始接种量为od
600
=0.05，而后置于180 rpm的摇床中，30℃培养，hplc测定2,6
‑
二硝基酚完全降解所需的时间，并用分光光度计检测菌体浓度od
600
。结果如表1所示。
40.表1表1的结果显示，不同种类有机物对菌株m
‑
1降解2,6
‑
dnp的影响作用不同，乳酸、葡萄糖的加入有促进作用，适量琥珀酸的加入也有促进作用，但大量的琥珀酸对降解有抑制作用。
41.尽管已经通过优选实施例进一步详细说明和描述了本发明，但是本发明不限于所
公开的示例，并且本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下从其中得出其他变型。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。