用于检测新冠病毒的配对抗体及其应用的制作方法

1.本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种用于检测新冠病毒的配对抗体及其应用。


背景技术：

2.2019新型冠状病毒（2019
‑
ncov），2020年1月12日被世界卫生组织命名为“2019
‑
ncov”，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2（sars
‑
cov
‑
2）”。sars
‑
cov
‑
2为圆形或椭圆形的β属新型冠状病毒，呼吸道飞沫传播和接触传播是其主要传播途径。人群普遍易感，潜伏期一般3~7天，潜伏期内存在传染性。sars
‑
cov
‑
2 目前检测方法包括肺部影像、rt
‑
pcr、血液抗体检测方法。rt
‑
pcr是病毒诊断的金标准方法，操作过程麻烦，需要专业设备及仪器。血液总抗体或igg\igm，检测简单快速，但抗体在体内存在较长一段时间，无法区分现症感染与既往感染。此外部分人群感染发病早期（1~7天），免疫系统产生igm/igg抗体滴度较低，导致漏检情况。病毒抗原可以在感染无症状阶段及发病早期检出，及时反映感染状态，区分既往感染与现症感染，取样操作相对简单，是实现人群中新冠病毒快速筛查的重要手段，对于抗击新冠病毒传播具有重要价值。
3.sars
‑
cov
‑
2 n蛋白（nucleocapsid protein）是一种重要的结构蛋白，n蛋白为有419个氨基酸的碱性磷酸蛋白，分子量45.6kd，等电点pi 10.1，由n 端结构域（ntd）和c 端结构域（ctd）以及连接两个结构域及其两侧的三段无规则柔性区（idr）构成，均富含精氨酸和赖氨酸残基，ntd结构域与病毒rna结合，ctd结构域参与n蛋白二聚体结构形成。n蛋白是病毒含量最丰富的结构蛋白，在感染细胞中大量表达，其免疫原性强，是早期病毒抗原检测靶标。
4.但是n蛋白结合核酸，导致抗原表位屏蔽，且核酸po
32
‑
负电荷也降低抗体与n蛋白亲和力，一般的抗体组合容易受到核酸的影响，稳定性较差。同时，临床新冠病毒初筛需要接近rt
‑
pcr病毒检测灵敏度，n抗原检测限50pg/ml甚至更低，目前缺乏满足此临床需求的抗体组合。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种稳定性和灵敏度较好的用于检测新冠病毒的配对抗体。
6.一种用于检测新冠病毒的配对抗体，包括第一检测抗体和第二检测抗体；所述第一检测抗体具有如seq id no:1所示的轻链互补决定区cdr1、如seq id no:2所示的轻链互补决定区cdr2和如seq id no:3所示的轻链互补决定区cdr3，以及如seq id no:4所示的重链互补决定区cdr1、如seq id no:5所示的重链互补决定区cdr2和如seq id no:6所示的重链互补决定区cdr3；所述第二检测抗体具有如seq id no:7所示的轻链互补决定区cdr1、如seq id no:8所示的轻链互补决定区cdr2和如seq id no:9所示的轻链互补决定区cdr3，以及如seq id no:10所示的重链互补决定区cdr1、如seq id no:11所示的重链互补决定区cdr2和如seq id no:12所示的重链互补决定区cdr3。
7.本发明通过新冠病毒重组抗原n蛋白免疫小鼠制备杂交瘤细胞单克隆抗体，并筛选得到具有上述互补决定区序列的配对抗体，其识别n蛋白的不同表位，表位分别位于n蛋白的ntd和ctd结构域，且由于两种抗体识别的是n蛋白非核酸结合区域，不会受核酸负电荷干扰，对核酸抗原表现出了兼容性，具有较好的稳定性。而且，上述配对抗体具有较高的亲和力，病毒n蛋白检测灵敏度可以达到5pg/ml。该配对抗体可以同时适用于化学发光、酶联免疫，特别是胶体金及荧光微球、量子点层析方法，从而应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的初步筛查，能够在数分钟内判断结果，为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段。
8.在其中一个实施例中，所述第一检测抗体包括序列如seq id no:13所示的轻链可变区以及序列如seq id no:14所示的重链可变区。
9.在其中一个实施例中，所述第二检测抗体包括序列如seq id no:15所示的轻链可变区以及序列如seq id no:16所示的重链可变区。
10.在其中一个实施例中，所述第一检测抗体和所述第二检测抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区。
11.在其中一个实施例中，所述第一检测抗体和所述第二检测抗体的类型分别独立地选自igm、ige、iga、igd或igg。
12.本发明还提供了一种杂交瘤细胞组合物，包括保藏号为cgmcc no.20297的杂交瘤细胞和保藏号为cgmcc no.20298的杂交瘤细胞。
13.本发明还提供了一种核酸组合物，包括编码上述第一检测抗体的核酸分子和编码上述第二检测抗体的核酸分子。
14.本发明还提供了一种上述配对抗体、上述杂交瘤细胞组合物或上述核酸组合物在制备用于检测新冠病毒的产品中的应用。
15.本发明还提供了一种用于检测新冠病毒的检测试剂盒，其包括上述配对抗体。
16.在其中一个实施例中，还包括样本处理液，所述样本处理液包括以下浓度的组分：0.02m~0.06m pbs、0.9wt%~6wt% nacl、0.01wt%~0.2wt% sds、0.1wt%~2wt% trition
‑
100、10mm~100mm精胺、1mm~20mm zncl2和1mm~10mm mncl2。
17.本发明还提供了一种新冠病毒检测试剂卡，包括底板和依次搭接设于所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水纸，所述反应膜上设有检测线，所述检测线上包被有上述配对抗体中的一种抗体，所述结合垫上含有标记物标记的上述的配对抗体中的另一种抗体。
18.本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的新冠病毒的检测方法，其利用上述配对抗体进行检测。
附图说明
19.图1为本发明实施例2中化学发光快速检测的线性拟合结果；图2为本发明实施例5中部分样本的检测结果。
20.本发明中所提供的小鼠杂交瘤细胞，于2020年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为cgmcc no.20297和cgmcc no.20298，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；于2020年9月7日检测完毕，结果为存活。
具体实施方式
21.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
23.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
24.本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
25.本发明一实施例的用于检测新冠病毒的配对抗体，其包括第一检测抗体和第二检测抗体。第一检测抗体具有如seq id no:1所示的轻链互补决定区cdr1、如seq id no:2所示的轻链互补决定区cdr2和如seq id no:3所示的轻链互补决定区cdr3，以及如seq id no:4所示的重链互补决定区cdr1、如seq id no:5所示的重链互补决定区cdr2和如seq id no:6所示的重链互补决定区cdr3。第二检测抗体具有如seq id no:7所示的轻链互补决定区cdr1、如seq id no:8所示的轻链互补决定区cdr2和如seq id no:9所示的轻链互补决定区cdr3，以及如seq id no:10所示的重链互补决定区cdr1、如seq id no:11所示的重链互补决定区cdr2和如seq id no:12所示的重链互补决定区cdr3。具体序列信息如下表1所示。
26.表1本发明通过新冠病毒重组抗原n蛋白免疫小鼠制备杂交瘤细胞单克隆抗体，并筛选得到具有上述互补决定区序列的配对抗体，其识别n蛋白的不同表位，表位分别位于n蛋白的ntd和ctd结构域，且由于两种抗体识别的是n蛋白非核酸结合区域，不会受核酸负电荷干扰，对核酸抗原表现出了兼容性，具有较好的稳定性。而且，上述配对抗体具有较高的亲和力，病毒n蛋白检测灵敏度可以达到5pg/ml。该配对抗体可以同时适用于化学发光、酶联免疫，特别是胶体金及荧光微球、量子点层析方法，从而应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的初步筛查，能够在数分钟内判断结果，为疑似患者排查和无症状感
zncl2和5mm~10mm mncl2。可选地，样本处理液还包括0.01wt%~0.03wt%的proclin300。样本处理液可以快速裂解释放拭子、痰液、病毒保存液样本中的细胞、病毒颗粒的n蛋白，并断裂、置换n蛋白表面核酸，降低n蛋白结合核酸以及蛋白自身负电荷对免疫反应的干扰，提升抗原/抗体亲和力，增加检测灵敏度。
35.可以理解，处理不同样本时处理方法可以根据需要调整。例如病毒保存液样本，取100μl病毒样本保存液，加入100μl样本处理液，混合均匀，室温放置1min，取50
µ
l加入微孔板中，并加入50μl稀释液混合均匀，用封板膜封闭微孔板，37℃孵育1h。例如拭子样本，取250μl样本处理液与250μl稀释液加入1.5ml ep管中，将拭子在管中搅拌1min，弃拭子，取100
µ
l加入微孔板中，用封板膜封闭微孔板，37℃孵育1h。
36.基于该配对抗体和样本处理液的检测试剂盒，操作简便，无需专门设备，也不需要专业人员操作，可应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的初步筛查，能够在数分钟内判断结果，为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段。
37.本发明一实施例的新冠病毒检测试剂卡，其包括底板和设于底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水纸，样品垫、标记垫、反应膜和吸水垫依次搭接，反应膜上设有检测线，检测线上包被有上述配对抗体中的一种抗体，结合垫上含有标记物标记的上述配对抗体中的另一种抗体。
38.本发明一实施例的非疾病的诊断和治疗目的的新冠病毒的检测方法，其利用上述配对抗体进行检测。
39.可以理解，新冠病毒的检测方法可用于多种非疾病的诊断和治疗目的场景，例如检测已经死亡的人体或动物体样本、检测环境样本等等。可以理解，利用上述配对抗体进行检测的方法包括但不限于化学发光法检测、elisa检测或免疫层析快速检测等。
40.以下为具体实施例。
41.实施例1 杂交瘤细胞株制备杂交瘤细胞株制备：以pet
‑
28a
ꢀ‑
n质粒转化bl
‑
21（de3）菌株，可溶性表达n蛋白。以弗氏完全佐剂对balb/c小鼠25
µ
g抗原皮下免疫，利用弗氏不完全佐剂进行二免、三免。三免十天后断尾采血，血清效价达到1:64万。30
µ
g n蛋白腹腔加强免疫，3天后取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按5:1比例进行peg融合。1ml预热50% peg
‑
1450静置1min，水浴中缓缓摇动90s，缓慢滴加15 ml dmem培养基，37℃水浴5min。补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm离心5min弃上清。加入40ml预热的含hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100
µ
l，置培养箱中培养。10天后，n蛋白抗原0.1μg/ml浓度包被，羊抗鼠fc
‑
γ
‑
hrp二抗，鉴定细胞上清效价，对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆筛选，得到40种识别n蛋白的杂交瘤细胞株。
42.n蛋白序列：msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkad
etqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa利用核酸n抗原、无核酸n抗原的反应活性比较，设计不同截断蛋白n
‑
tail、ntd、ctd、c
‑
tail进行表位筛选，结合计算机辅助模拟确定蛋白识别表位。依据抗体亲和力、不受核酸n蛋白干扰、免疫层析可配对原则，筛选得到2株杂交瘤细胞，分别分泌抗体n17和n24。利用洛阳佰奥通抗体亚型检测试剂盒，确定抗体亚型为igg1、kappa轻链。n17识别表位位于ntd（aa）区域，n24抗体表位识别ctd（aa）区域。分泌n17和n24抗体的小鼠杂交瘤细胞的保藏号分别是cgmcc no.20297和cgmcc no.20298，于2020年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。抗体的可变区序列如下表4所示。
43.表40.1μg/ml n蛋白包被微孔板，n17/n24 50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.56ng/ml、0.78ng/ml、0.39ng/ml，二抗fc
‑
γ
‑
hrp（jackson）1:20000稀释检测od450，结果如下表5所示。
44.表5实施例2 化学发光法的快速检测n24抗体hrp标记：（1）称取hrp 25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。（2）反应后的酶溶液经sephadex g
‑
25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以peg浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。（3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。（4）用1m ph9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。（5）加0.2m赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。（7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15m ph7.4的pbs中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15m ph7.4的pb缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
45.化学发光法快速检测：采用hrp标记n24和n17包被构建化学发光检测体系。反应过
程：1μg/ml n17 n抗原 n24
‑
hrp（500ng/ml）。检测体系性能如下表6所示。
46.表6线性拟合结果如图1所示，x轴为log
10
抗原浓度，y轴为log
10
发光值，线性范围：156.25~10000pg/ml，其线性回归系数（r）为0.9998。
47.实施例3 检测卡制备抗体微球标记：300nm红色羧基微球（thermo）用50mm mes ph6.0 洗涤稀释至1mg/ml，并进行超声分散（宁波新芝），超声程序为5%，超声2s，间隔3s，超声3min。edc两步法活化羧基微球，edc、sulfo
‑
nhs mes溶液（5mg/ml）加入1%（1mg/ml）微球，nhs:edc:
‑
cooh以5:5:1的比例进行混合，30℃旋转活化30min。50mm hepes ph 7.4 偶联缓冲液13000rpm离心清洗微球后，每毫克微球加入80μg n17抗体，37℃旋转偶联2小时，加入5% bsa溶液进行封闭。
48.取pvc底板和样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，将样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次搭接于pvc底板上，将n24抗体包被于反应膜的检测线上，将第一质控抗体包被于反应膜的质控线上，将微球标记的n17抗体和第二质控抗体喷涂于结合垫上。
49.实施例4 检测卡灵敏度及重复性检测以293f细胞重组表达新冠抗原n蛋白及e.coil重组表达n蛋白，不同处理稀释浓度500pg/ml、250pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、10pg/ml、0pg/ml，使用上述检测卡进行检测。如下表7所示，浓度低至10pg/ml时，依旧可确保20min内条带清晰。
50.表7实施例5 临床样本检测
发病后5天的rt
‑
pcr核酸（ct=32）确诊低病毒滴度患者，其痰液样本加入80μl样本处理液，然后采用上述检测卡检测，10分钟后观察结果，按照ct值进行分组统计分析。结果显示，对于高滴度病毒样本（ct<31），检出率100%，低滴度病毒样本（ct>32），检出率达到60%，与pcr整体符合率接近80%，部分结果如图2所示。
51.实施例6采用其他抗体组合进行样品检测，检测体系：1μg/ml n抗体 核酸n抗原 1μg/ml bio n抗体 sa
‑
hrp（1:5000），结果如下表8所示。可见，与其他抗体组合相比，n17/n24检测带核酸抗体的检测限更低。
52.表8以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
53.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。