一种快速鉴定毛黄堇药材的Dual-SNP-TaqMan荧光探针的制作方法

一种快速鉴定毛黄堇药材的dual-snp-taqman荧光探针
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定毛黄堇药材的dual-snp-taqman荧光探针及其制备方法和试剂盒以及快速鉴定毛黄堇药材的方法。


背景技术：

2.紫堇属是罂粟科最大的属，被认为是分类最复杂的植物类群之一。生长地区复杂的地质结构和当地气候和环境的多变，加之在系统发育上经历典型的网状进化和激烈的分化，紫堇属表现出高水平的形态和生境多样性，其叶片、地下块茎、果实、种子和花部特征都非常的复杂多变，严重影响精准的物种鉴定和系统分类。毛黄堇药材为紫堇属石生黄堇组植物，在重庆民间作为治疗肝炎、肝硬化的特效草药，也可祛瘀止痛，凉血止血。由于生长在石灰岩崖壁缝隙中，资源量极小，市场价格高达2000～3000元/公斤，加之入药以干燥，药材鉴定尤为困难。受利益驱使，常有不法商贩以同属近缘种石生黄堇、紫堇、黄堇、小花黄堇等干燥全草混伪毛黄堇药材药材在市场中大量涌现，出售的毛黄堇药材混伪极为严重。大量研究表明，不同基源药材毛黄堇药材生物碱含量差异较大，而毛黄堇药材不仅在保肝方面，也在心血管疾病与中枢神经系统有重要作用，药材使用的混乱给用药安全埋下巨大隐患。迫切需要建立准确、高效的鉴定方法，应用于毛黄堇药材质量控制，以保障用药安全、有效。
3.准确的物种鉴定是生物多样性研究和保护的前提，也是几乎所有植物学研究的基础。然而，由于毛黄堇药材样品收集的难度，复杂的形态特征，混伪品(紫堇属)较多，传统形态分类有极大的局限，故可使用分子生物学方法鉴定毛黄堇药材及混伪品。核糖体rna内转录间隔区(its)，具有较高的变异率和相对高的物种鉴别能力，已被提议作为种子植物的核心条码。.然而，没有一个单独的序列在植物中具有通用性。不同的序列往往在不同的植物类群中鉴定能力不一样，且对于大类群的紫堇属植物来说，常规的分子鉴定方法较为繁琐，因此，有必寻找一种快速鉴定毛黄堇药材的正品的分子技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供一种快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针及其制备方法，所述快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针可同时对多个位点进行检测，避免试验中出现假阳性，以保证检测的准确性。
5.为实现上述目的，本发明采用以下方案：
6.所述新型荧光探针为扩增阻滞-taqman双重特异位点(dual-snp-taqman)荧光探针，所述荧光探针使用的上引物的核酸序列如seq id no:1所示，下引物的核酸序列如seq id no:2所示，探针的核酸序列如seq id no:3所示。
7.进一步，所述扩增阻滞-taqman双重特异位点荧光探针的上下引物根据毛黄堇药材的第一个特异性snp位点设计，所述第一个特异性snp位点为毛黄堇药材its序列525位c-t的变异。
8.进一步，所述扩增阻滞-taqman双重特异位点荧光探针的taqman探针根据毛黄堇
药材的第二个特异性snp位点设计，所述第二个特异性snp位点为毛黄堇药材its序列555位的a-g变异。
9.进一步，所述的快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针的方法在于以下步骤：
10.1)提取dna；
11.2)pcr扩增its序列并测序分析特异性snp变异位点；
12.3)根据变异位点设计新型荧光探针的上下引物和探针。
13.进一步，步骤2)使用的pcr扩增的上引物的核酸序列如seq id no:4所示，下引物的核酸序列如seq id no:5所示。
14.进一步，步骤2)分析变异位点采用hmmer模型，去除保守的5.8s rrna序列。
15.进一步，第一个特异性snp变异位点为毛黄堇药材its序列525位c-t的变异，第二个特异性snp位点为毛黄堇药材its序列555位的a-g变异。
16.具体的，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，作为第三代分子标记，只有2种等位型，具有二态性和等位基因性，因具备数量多、分布频密、遗传稳定性高、易于分型检测等特征，被广泛应用于分子诊断、临床检验、遗传疾病和新药研发等方面。荧光探针技术是基于实时荧光定量pcr建立的一种核酸定量检测技术，常用于基因表达分析、遗传疾病诊断、病原鉴定。近年来，有学者将其应用到中药材快速鉴定中。与传统pcr电泳或测序法比较，荧光探针检测具有灵敏度高、操作简单、快速等优点，且避免了染料荧光pcr法假阳性和荧光本底信号干扰等问题。
17.taqman荧光探针是使用最普遍的荧光探针。其原理是利用taq酶的5-3’外切酶活性，通过一对引物和一条探针(5’端标记有荧光集团，3’标记有荧光淬灭基团)对特异性片段或特异位点进行检测，从而实现对物种的鉴定。阻滞扩增反应依赖反应中taq dna聚合酶缺少3
′※5′
外切酶活性的特性,对于3
′
末端错配的引物,以低于正常末端配对引物的速度延伸,当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时,3
′
末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸,反应终止，从而表明模板dna没有与引物3
′
末端相应的碱基；反正得到特异长度的扩增条带,表明3
′
末端碱基匹配.
18.taqman荧光探针鉴定的准确性依赖于片段和位点的特异性，不同植物的dna条形码可能不能提供特异性的snp位点，出现分段位点，而在鉴定中，更多信息位点的运用有助于提高准确率，因此，同时对多个位点进行检测，避免试验中出现假阳性，以保证试验准确性十分重要。目前对多位点的检测常用多重探针设计，及根据每个位点分别设计一条特异性探针同时进行检测。理想的鉴定技术应同时满足准确、快速、廉价的要求。多重探针的设计意味着成本的大幅增加，显然多重射击不是理想的选择，如何通过一条探针对多个位点进行检测，是taqman荧光探针改进的方向。
19.为了提高了探针特异性和准确性，且不增加成本，本发明通过一对引物、一条探针同时对两个特异位点进行检测，过扩增毛黄堇药材及其同属近缘物种its序列，分析its序列中特异性snp位点，选择2个snp位点，第一位snp按扩增阻滞反应设计引物(上/下引物)，第二位snp设计taqman探针，通过对上/下引物进行筛选和反应体系优化，最终确定反应体系。
20.本发明的目的之二在于提供一种快速鉴定毛黄堇药材的检测试剂盒及其鉴定方
法，使用所述试剂盒可稳定有效准确的鉴定出毛黄堇药材，从而有利于毛黄堇药材质量控制，以保障用药安全、有效。
21.为实现上述目的，本发明采用以下方案：
22.本发明提供的一种快速鉴定毛黄堇药材的检测试剂盒含有所述的快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针和毛黄堇药材阳性对照品。
23.进一步，快速鉴定毛黄堇药材的方法为所述的快速鉴定毛黄堇药材的检测试剂盒，以待检测品为模板，采用qrt-pcr检测。
24.进一步，所述qrt-pcr的反应条件为95℃5min；[40cycles:95℃30s,60℃50s,72℃15s]；72℃5min。
[0025]
本发明的有益效果在于：
[0026]
本发明提供的快速鉴定毛黄堇药材的新型荧光探针采用了扩增阻滞和taqman的结合技术，可同时对2个位点进行检测，但在实际操作中可根据此设计思路设计多特异性位点的新型荧光探针，更多的避免试验中出现假阳性，以保证检测的准确性；所提供的快速鉴定毛黄堇药材的检测试剂盒可稳定有效准确的鉴定出毛黄堇药材，从而有利于毛黄堇药材质量控制，以保障用药安全、有效。
附图说明
[0027]
图1为its扩增的电泳结果。
[0028]
图2为变异位点的筛选和发现。
[0029]
图3为毛黄堇药材的快速检测。
具体实施方式
[0030]
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0031]
实验条件
[0032]
材料：实验前期选取毛黄堇药材及紫堇属22个种共计20个个体，其中包括4个《中国药典》收载的药材原植物(c.yanhusuo,c.decumbens,c.saxicola and c.bungeana)及其药材(9个岩黄连药材叶片样品，各3个延胡索、夏天无药材的块茎以及3个地丁草药材全草样品)。22个种的118条序列通过测序获得序列，13条序列从genbank下载(下载序列都来源于公开发表的文献报道，我们通过和同种或近缘种的序列进行blast比对以确保序列的正确性)。进行bilast比对寻找变异位点，确定毛黄堇药材特有的snp位点。
[0033]
采集8个毛黄堇药材，4个贵州黄堇，6个石生黄堇，4个川萼黄堇，4个黄堇样品，选取新鲜、健康的叶片，立即硅胶干燥保存供dna提取。
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试剂：天根植物基因组dan提取试剂盒(天根生物，北京，中国)，2x taqpcr mastermix(艾莱德生物科技，北京，中国)，2
×
t5fast qpcr mix(probe)(北京擎科，北京，中国)，探针和引物(擎科合成，北京，中国)，氯仿、异戊醇。
[0035]
仪器：dna样品研磨仪、安捷伦mx3000p实时荧光定量pcr仪、bio-radc1000双通道梯度pcr仪、bio-rad凝胶自动成像系统、nanodrop2000核酸蛋白浓度测定仪、电泳仪、离心
机、水浴锅等。
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实施例1dna提取
[0037]
基因组dna提取以硅胶干燥的叶片为材料，采用“天根植物基因组dna提取试剂盒”，并对试剂盒进行了改进，包括加入更多的裂解液gp1，以及采用核分试剂清洗提取产物1-3次，直到上清液颜色较淡或无色。
[0038]
实施例2pcr扩增及测序
[0039]
在peltier thermal cycler ptc2000(bio-rad)pcr仪上进行扩增，采用25μl扩增体系：模板dna 30ng，2x taq pcr mastermix(艾莱德生物科技，北京，中国),引物各1μl(2.5μm,生工合成，上海，中国)，蒸馏水补齐。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳(0.5
×
tbe缓冲液)检验扩增成功率，然后通过1％琼脂糖凝胶纯化。经纯化的pcr产物在3730xl测序仪上进行双向测序，测序引物采用pcr扩增相同的引物，pcr扩增条件见表1，its序列扩增的结果如图1所示：单独从pcr扩增成功率，its扩增100％，26个样品均扩增出来，且扩增质量高。由于扩增个数较多，此处仅展示7个样品电泳结果，在500bp-750bp有明亮清晰条带.经纯化回收之后送至测序公司测序。
[0040]
表1引物、序列及pcr扩增条件
[0041][0042]
实施例3数据分析
[0043]
所有的原始序列去除扩增引物，在condon code aligner v 5.1.5(condon code co.,美国)软件上进行组装和剪切。its序列采用hmmer(隐马尔可夫)模型，去除保守的5.8s rrna和its1序列。序列比对采用mega6.06分析变异位点。结果如图2所示：分析序列发现，毛黄堇药材its序列有2个特异性snp位点，分别在525位为c-t变异，555位a-g变异，并以此设计引物和探针。
[0044]
实施例4设计引物和探针
[0045]
设计引物设计并优化上引物，设计如表2所示，最终确定反应程序为：95℃5min；[40cycles:95℃30s,60℃50s,72℃15s]；72℃5min。选择qf3 rm这对引物。
[0046]
表2引物和探针设计
[0047][0048]
实施例5快速鉴定毛黄堇药材
[0049]
以毛黄堇药材(3个)和混伪品dna(4个混伪品各2个样品)为模板，采用qrt-pcr检测，试验结果如图3所示：只有毛黄堇药材样品和阳性对照能检测到荧光扩增曲线，混淆品无荧光曲线，证明该方法能够鉴定出毛黄堇药材。
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最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。