特异性结合热休克蛋白60的亲和多肽的制作方法

1.本发明涉及与热休克蛋白60结合的多肽，涉及编码该多肽的核酸；包含该多肽的组合物；及该多肽或该组合物的应用，尤其是用于肿瘤预防、治疗及诊断目的的用途。


背景技术：

2.热休克蛋白60（hsp60）是线粒体中主要的atp依赖性伴侣蛋白，属于热休克蛋白家族成员，广泛存在于细菌和哺乳动物中，在机体各种生理过程中发挥作用，以维持细胞稳态。其主要功能有参与热激反应、帮助多肽折叠、促进细胞凋亡，也可促进细胞的存活等。特别是参与了多种应激源（如高温、缺氧、高压）下的蛋白质折叠和成熟作用；研究表明，hsp60能够帮助大约15％～30％的细胞蛋白质进行折叠。hsp60主要通过线粒体在癌症治疗中发挥作用，在不同癌症中，hsp60的表达量不一样，作用机制也不同。在卵巢癌中，hsp60高表达，通过稳定线粒体内稳态并激活mtor信号通路促进癌症的发生发展。在胶质母细胞瘤中，hsp60低表达使线粒体中的ros增多，诱导ampk激活，进而抑制了mtorc1介导的s6k和4ebp1磷酸化，蛋白质翻译机器受损，使癌细胞生长减慢。且hsp60家族中有一种ii型异寡聚伴侣蛋白（tric/cct），它通过调节tric的客户蛋白（stat3、cyclinb/e，p53）参与癌症的发生发展。随着近年研究，热休克蛋白家族在多种癌症相关活动（细胞增殖、转移、抗癌药物耐药性）中起重要作用，其具有多种临床用途，可视为癌症诊断和预后的生物标志物以及抗癌治疗的潜在治疗靶标。基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗热休克蛋白60（hsp60） 相关肿瘤疾病的新药物或新方法，以改善目前临床现状。
[0003] 噬菌体展示技术是george p. smith在1985年提出的一种快速筛选多肽、蛋白质、抗体的高通量方法，并在2018年获得了诺贝尔化学奖。该技术的原理是将外源多肽或蛋白质的dna序列插入中噬菌体次要外壳蛋白p iii基因中，外源蛋白随着衣壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面，噬菌体展示肽库在构建、改造及筛选方面具有易操作的优点，因此形成了商业化试剂盒以供科研使用。我们利用噬菌体环七肽库对靶分子进行筛选，通过dna测序并翻译，最终得到靶向结合hsp60的环七肽序列。其优势在于（1）所得到的多肽片段水溶性高且较稳定，增强了多肽的实用性；（2）其筛选属于高通量筛选，提高了筛选效率；（3）建立了蛋白质或多肽基因型和表现型之间的联系，操作更加便利。在多种噬菌体多肽库中，环肽在二硫键和其他作用键的作用下，代谢稳定性和生物利用度提高；且环肽由于环化母肽柔性好，有利于增加多肽与靶点蛋白的结合活性和选择性。基于之前利用噬菌体展示技术靶向筛选hsp60，我们进一步做了验证，通过固相合成法合成了筛选出的多肽氨基酸序列，以证明利用噬菌体展示技术筛选的hsp60靶向结合多肽的高效性，为进一步开展新型肿瘤靶向药物的设计和研发提供候选资源和奠定坚实基础。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供与hsp60特异性结合的多肽。这样的结合多肽尤其适用本发明的目的，在于提供一种靶向新型多肽及其用途，通过特异性靶向结合肿瘤细胞上的hsp60，产生对肿
瘤细胞的特异性亲和力。优选地将这种新型靶向上述多肽或其衍生产品用于制备靶向hsp60抗肿瘤药物或显像制剂。
[0005]
本发明采用以下技术方案实现发明目的：本发明提供了靶向hsp60的亲和多肽，作为优选技术方案，本发明所述肽的氨基酸序列选自seq id no.1-seq id no.17之一所示的氨基酸序列。
[0006]
表1 与hsp60有靶向作用的多肽氨基酸序列本发明还提供了上述多肽的核酸片段，其包含编码上述本发明中多肽的氨基酸序列。
[0007]
作为优选技术方案，所述核酸片段包含编码所述本发明如seq id no.1-seq idno.17之一所示的多肽的核苷酸序列。
[0008]
本发明提供了一种筛选与hsp60靶向识别多肽的方法和多肽库，所述多肽来源于噬菌体展示环七肽库，文库容量为1
×
10
11
pfu/ml。
[0009]
本发明所述的肿瘤为胶质母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌，胰腺癌，卵巢癌。优选为结肠癌。
[0010]
本发明还提供了靶向hsp60的偶联物包括一种药物组合，其包含所述的多肽与药物活性成分，作为用于肿瘤治疗的药物。也可作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等。
[0011]
一种多肽分子探针，包含上述多肽seq id no.1-seq id no.17所述多肽。
[0012]
一种显像剂，包含本发明所述多肽和显影剂或放射性核素，seq id no.1-seq id no.17所述的多肽，用于临床肿瘤的成像和诊断。
[0013]
本发明的有益效果在于：（1）本发明应用噬菌体展示技术，一次性筛选出多条靶向结合hsp60多肽，其特点为高通量，高效，文库种类较多，并且筛选得到的多肽稳定性高，水溶性好（2）所述多肽来源为噬菌体展示环七肽文库，由于环化结构，多肽的结合活性和选择性被相应增强，同时提高了多肽的生物稳定性，更容易在大规模化生产制备中保持其稳定性，为靶向多肽的筛选提供有效的方法。
[0014]
（3）所述多肽分子量相对较小，纯度高，靶向性强，组织渗透性好，活性高，低免疫原性和低毒性，安全可靠，可成为具有高灵敏度和特异性的分子探针或形成新的靶向药物引入体内，实现特异性的诊断或靶向治疗作用，在筛查和靶向治疗中具有重要应用价值。
[0015]
（4）靶向结合筛选效率高，通过热休克蛋白60，筛选出的多肽与肿瘤细胞有特异性亲和作用，为进一步研发肿瘤靶向治疗提供方案。
附图说明
[0016]
图1为筛选出的环七肽seq id no.1-seq id no.17的dna测序波形图。
[0017]
图2为17个阳性噬菌体克隆与热休克蛋白60的结合作用。
[0018]
图3为moe软件预测阳性多肽seq id no.4与热休克蛋白60的结合作用。a为环七肽seq id no.4与hsp60 2d平面结合图；b为环七肽seq id no.4与hsp60结合打分函数；c为环七肽seq id no.4与hsp60相互作用键。
[0019]
图4为多肽seq id no.4的质谱图。
[0020]
图5为fitc标记的多肽seq id no.4与结肠癌细胞sw480的特异性亲和作用。a为流式实验图；b为流式柱状图。
具体实施方式
[0021]
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0022]
实施例1筛选出的多肽seq id no.1-seq id no.17的dna测序结果图。
[0023]
1.1 hsp60纯化及靶向筛选将构建的hsp60表达质粒感受态细胞涂布到含有卡那霉素的lb平板上，将平板倒置于37℃恒温保温箱中过夜。次日，从平板中挑选出单克隆菌接种到含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃摇床培养，当od
600
在0.6左右时，向菌液中加入iptg进行诱导，摇菌并离心。使用his标签蛋白纯化试剂盒对hsp60进行纯化，并测定浓度，用sds-page凝胶电泳之后考马斯亮蓝染色，初步判断hsp60的纯度。以纯化的hsp60作为靶分子且参照噬菌体环七肽库试
剂盒的说明书；利用噬菌体展示技术，通过三轮靶向筛选，并尽量保证每一轮的噬菌体投入量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。
[0024]
1.2 噬菌体蓝斑提取测序挑选第三轮筛选后大小合适的蓝斑，置于过夜菌中，在37℃快速振荡扩增4.5h使达到对数生长期。离心取上清液，此即为扩增的单克隆噬菌体储存液。取扩增后的噬菌体储存液于lb培养基中，加入对数生长期菌液，于37℃振荡4.5h。离心取上清液，加入六分之一体积的peg/nacl,4℃过夜。次日，4℃，14000r/min离心10min，弃上清。加入tbs重悬沉淀，将混悬液转入离心管中，4℃，10000r/min离心5min。将上清转移到新的离心管中，并加入六分之一peg/nacl，4℃静置2h。离心，彻底弃掉上清液后加入nai，混合均匀后加入无水乙醇，室温静置10min。离心弃上清，用预冷的70%乙醇轻微洗3次，然后室温晾至干燥。用te溶解，即得到单克隆噬菌体dna溶液。利用质粒快速抽提试剂盒纯化得到的dna溶液，并送至上海生工进行测序。根据测序峰值图在knp i和eag i位点之间查找编码环七肽的基序,即5'-(knp i)g gta cct ttc tat tct cac tct gct gct tgt (nnk) 7 tgc ggt gga ggt cca tcg gcc g(eag i)-3'。该序列中(nnk)7即为编码环七肽的基序,该基序两侧的tgt、tgc密码子是编码环七肽成环的半胱氨酸。按照氨基酸密码子表对基序(nnk)7进行翻译，即可得到环七肽的氨基酸序列。
[0025]
结果如图1所示，17个阳性噬菌体的dna测序结果图。根据测得的17个氨基酸序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性，结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性。a为seq id no.1-seq id no.4的测序波形图；b为seq id no.5-seq id no.8的测序波形图；c为seq id no.9-seq id no.12的测序波形图；d为seq id no.13-seq id no.16的测序波形图；e为seq id no.17的测序波形图。
[0026]
实施例2 酶联免疫吸附试验（elisa）验证17个阳性噬菌体克隆与hsp60的结合作用（1）固定：将纯化的hsp60铺在96孔板中（0.5
ꢀµ
g /孔），4℃摇床过夜固定。
[0027]
（2）阻断：取出固定后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次，然后加入3%过氧化氢,于37
º
c细胞恒温培养箱中封闭30min，用以阻断内源性过氧化物酶的活性。
[0028]
（3）封闭：取出阻断后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次，再加入3%bsa/pbs于37
º
c细胞恒温培养箱中封闭1h。
[0029]
（4）加阳性噬菌体：取出封闭后的96孔板，拍干孔中液体后，加入纯化后的阳性噬菌体，于37
º
c细胞恒温培养箱中反应1h。
[0030]
（5）加一抗：取出反应后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次后加入1:4000的m13抗体，4
º
c过夜。二抗：取出反应后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次后加入二抗,于37
º
c细胞恒温培养箱中反应30min。
[0031]
（6）加底物tmb：将pbs洗涤3次后的96孔板于避光条件下加入tmb显示剂，避光置于37
º
c细胞恒温培养箱中15min。
[0032]
（7）终止：取出反应后的96孔板，加入2m硫酸终止反应。
[0033]
（8）测定：将完成全部反应的96孔板置于酶标仪中，于405nm处测定其od值，保存结果并进行分析。
[0034]
结果如图2所示，经细胞酶联免疫分析初步鉴定,阳性单克隆噬菌体与hsp60的亲
和力用k
d
表示。结果显示hsp60与阳性单克隆噬菌体结合力均达到nm以上水平，有一些可以达到pm水平，说明阳性噬菌体对hsp60有靶向作用。
[0035]
实施例3 moe软件预测阳性多肽seq id no.4与hsp60的亲和力。
[0036]
在pdb(protein data bank）下载人源hsp60的结构。在分子操作环境界面，导入下载的hsp60并优化处理，确定蛋白的活性口袋。将seq id no.4氨基酸序列的环七肽结构导入界面中，通过不断优化环七肽位置和构象，寻找hsp60和环七肽作用的最佳构象，并预测其结合模式、亲和力并通过打分函数挑选出近天然构象的与受体亲和力最佳的配体。
[0037]
结果如图3所示，根据moe分子对接结果，多肽seq id no.4可以与蛋白hsp60很好地结合，s打分为-45.2941。多肽seq id no.4与hsp60结合的2d平面结合图显示多肽与蛋白的asp395形成盐键， asp52、asn82、glu83、glu362、asp399、asn402之间存在氢键等稳定的相互作用力（图3a）；且二者结合的最高评分为-45.2941（图3b）；其相互作用的键见（图3c）。
[0038]
实施例4 合成多肽seq id no.4委托生工生物工程(上海)股份有限公司，通过固相合成法合成纯度为98%的seq id no.4（chvsiarsc）多肽和fitc标记的seq id no.4（chvsiarsc）多肽序列。结果如图4所示。
[0039]
实施例5 流式细胞术鉴定fitc标记的seq id no.4环七肽与结肠癌sw480细胞的亲和力培养sw480和hiec细胞，选择生长状态良好的细胞用胰酶消化，1000 r/min离心5min。弃上清，加入1ml培养基混匀后进行细胞计数。细胞浓度调为4x106个/ml。每种细胞均分为2个组别：空白对照组、5μm多肽组。sw480和hiec细胞平均分装到2个1.5 ml的离心管中，1000 r/min离心5min，弃上清。空白对照组加pbs，实验组加5μm fitc-多肽，混合均匀，37℃孵育10 min。1000 r/min离心，弃上清。加pbs混匀，1000 r/min离心，弃上清。加混匀，用流式细胞仪（bd）检测荧光强度和阳性率。
[0040]
结果如图5所示,环七肽seq id no.4与结直肠癌细胞系sw480共孵育结合的荧光强度与平均百分数，实验结果图（5a）和柱形图（5b）显示fitc标记的环七肽对结直肠癌sw480细胞具有特异性靶向结合能力。sw480和hiec分别用5μm 的多肽孵育10min，在hiec细胞上观察到强荧光信号，而在sw480细胞上检测到较弱的荧光信号。*p<0.05，**p <0.01，***p <0.001。