一株草酸青霉菌XZH-2及其应用的制作方法

oxalicum)xzh
‑
2能产较高的lpmo，由草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2固态发酵制得的酶组合制剂的最高lpmo酶活高达17.17u/g底物(lpmo酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液、每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位)，该酶组合制剂的滤纸酶活达7.37iu/g底物。目前已经报道的产lpmo的粗糙脉孢菌(neurospora crassa)和橙色嗜热子囊菌(thermoascus aurantiacus)发酵产酶比较，经同样的固态发酵方式，其lpmo酶活和滤纸酶活均高于比对菌株。因此，本发明的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2所产的lpmo与现有报道中的lpmo具有较高的酶活力，是一种新型高产的产lpmo菌株。
10.本发明的第三个目的是提供所述的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2在纤维素水解中的应用。
11.本发明的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2制备的酶组合制剂可以应用在纤维素水解上，尤其是林木纤维素的水解。杨木经过预处理后，加入商品纤维素酶，然后加入草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2所产的酶组合制剂进行酶解，使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素的水解效率。
12.本发明的第四个目的是提供所述的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2在木质纤维素原料酶解糖化中的应用。
13.本发明的第五个目的是提供所述的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2在生产具有协同降解纤维素的酶组合制剂中的应用。
14.本发明的第六个目的是提供一种具有协同降解纤维素的酶组合制剂的制备方法，包括以下步骤：制备草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2的固态发酵物，然后用na2hpo4‑
柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
15.所述的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2的固态发酵物是通过以下方法制备的：将活化的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2接种到种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液；将种子培养液接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物；所述的种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200g去皮土豆，加水煮沸，经纱布过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1l；所述的固态发酵培养基包括稻杆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5g稻杆加入10.5ml营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(nh4)2so
4 10.0g，kh2po
4 4.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，cacl2·
2h2o 0.5g，余量为水。
16.优选，所述的用na2hpo4‑
柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂具体为：用ph4.8 na2hpo4‑
柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃离心5min，取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
17.本发明的第七个目的是提供所述的制备方法制备得到的具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
18.本发明的第八个目的是提供所述的具有协同降解纤维素的酶组合制剂在纤维素水解中的应用。
19.本发明筛选的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2，该菌能产生一种新型的lpmo，该菌固态发酵制得的酶组合制剂的最高lpmo酶活高达17.17u/g底物(lpmo酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位)，该酶组合制剂的滤纸酶活高达7.37iu/g底物，该酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，有效地降低酶解过程的加酶量。
20.本发明的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：cgmcc no.21425。
附图说明
21.图1是草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2菌丝体及孢子电镜扫描图。
22.图2是构建的系统发育树。
23.图3是草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2在pda培养基上的菌落形态。
24.图4为不同菌株来源的酶组合制剂的lpmo酶活和滤纸酶活，其中，xzh
‑
2为草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2，n1为粗糙脉孢菌n1(neurospora crassa)，t2为橙色嗜热子囊菌t2(thermoascus aurantiacus)。
25.图5是本发明的纤维素酶和lpmo酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解中的酶解效果，其中，xzh
‑
2为草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2，n1为粗糙脉孢菌n1(neurospora crassa)，t2为橙色嗜热子囊菌t2(thermoascus aurantiacus)。
具体实施方式
26.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
27.实施例1：菌株的筛选
28.从河道污泥的生态系统中进行采集。把采集的污泥样品置于锥形瓶中，放入几粒玻璃珠，添加适量生理盐水，然后放于150rpm，1h摇床上振摇混匀；移取2ml混匀液于100ml富集培养液中，然后置于30℃，150rpm的摇床上振荡培养3d，获得富集培养物，富集培养液的配方是：nacl 1.0g，k2hpo
4 1.5g，kh2po
4 0.5g，nh4no
3 1.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，羧甲基纤维素(cmc)10.0g，蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000ml。将富集培养物直接涂布于刚果红初筛培养基，30℃观察培养3d，刚果红初筛培养基的配方是：每升培养基中含有kh2po
4 0.5g，(nh4)2so
4 2.0g，mgso4·
7h2o 0.25g，cmc 2.0g，刚果红0.2g，技术琼脂粉20g，余量为水，自然ph值。挑取水解透明圈较大的单菌落在pda平板培养基上划线纯化，纯化的菌株进行pda斜面保存。
29.菌株产纤维素酶和lpmo活力复筛：将pda斜面保存的纯化菌株分别接种到等量的复筛固态发酵培养基中，30℃，120rpm，培养5d，上述的复筛固态发酵培养基由5g稻杆和10.5ml营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(nh4)2so
4 10.0g，kh2po
4 4.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，cacl2·
2h2o 0.5g，余量为1000ml水。菌株经固态培养发酵后离心取上清液，即为粗酶液。分别用标准滤纸酶活(fpa)法和amplex red
‑
辣根过氧化氢酶法测定菌株产粗酶液的fpa和lpmo酶活。fpa法测定具体方法为：15ml具塞试管中分别加
入0.25ml粗酶液，1.75ml ph4.8 na2hpo4‑
柠檬酸缓冲液，1
×
6cm新华中速定量滤纸条(约50mg)，充分混匀后放入50℃水浴反应60min；然后加入2ml dns试剂，在沸水浴中煮沸10min；冷却后用蒸馏水定容至15ml；定容后550nm下测定od值。空白中的粗酶液用煮沸灭活的粗酶液代替。测得od值后，查标准曲线，求出溶液中葡萄糖的含量(酶活力单位定义：在上述测定条件下，每l ml粗酶液每分钟水解产生1μmol底物(葡萄糖180)所需的酶量为一个酶活单位iu)。amplex red
‑
辣根过氧化物酶法的具体方法为：参照red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit说明书，配制100μm red reagent 50μl，加入粗酶液20μl，1
×
reaction buffer 30μl，共100μl反应体系，使用酶标仪(eon，biotek)在波长530nm获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有lpmo的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。以h2o2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(lpmo酶活力单位定义：在反应体系中每毫升粗酶液，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位u)。最后选择lpmo和滤纸酶活较高的菌株使用pda斜面保存。
30.经筛选获得1株lpmos活力较高的菌株xzh
‑
2。采用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒b518259提取该菌株总dna，选择扩增真菌18s rdna序列的通用引物its1(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑3′
，如seq id no.1所示)和its4(5
′‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3′
，如seq id no.2所示)对菌株xzh
‑
2总dna进行its区域rdna序列的扩增。在50μl的pcr反应体系中含有10
×
taq buffer(with mgcl2)5μl，dntp(mix)(10mmol/l each)2μl，10μm引物its1 2μl，10μm引物its4 2μl，tag酶(5u/μl)0.5μl，20～50ng/μl的模板dna1μl，其余体积以无菌超纯水补足。变性梯度pcr扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，55～60℃退火30sec，72℃延伸50sec，35个循环，72℃延伸10min。pcr扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，经测序，其序列如seq id no.1所示，将该序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比较分析，并从数据库获得相关种属的its区域rdna序列，构建系统发育树，如图2所示。经序列比对分析，菌株xzh
‑
2属于青霉属，将其命名为草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2，该菌于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：cgmcc no.21425。
31.实施例2：酶组合制剂的制备以及酶活力测定
32.1.酶组合制剂的制备：挑取pda斜面保存的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2菌块接种到50ml pda液体培养基中，30℃，150rpm培养3d活化，将活化的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2以50μl的接种量接种到50ml pda种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液。pda种子培养基为每升培养基含土豆200.0g浸汁，葡萄糖20.0g，余量为水；配制方法：称取200.0g去皮土豆，加入适量水煮沸30分钟，纱布过滤，滤液即土豆浸汁，然后加入葡萄糖20.0g，溶解后加水定容至1l，115℃灭菌30min。将种子培养液以2ml的接种量接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物。上述的固态发酵培养基由5g稻杆和10.5ml营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(nh4)2so
4 10.0g，kh2po
4 4.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，cacl2·
2h2o 0.5g，余量为1000ml水。然后用50ml ph4.8 na2hpo4‑
柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃冷冻离心5min，取上清即为酶组合制剂(即纤维素酶和lpmo酶组
合制剂)，4℃保存备用。
33.2.滤纸酶活(fpa)测定：15ml具塞试管中分别加入0.25ml纤维素酶和lpmo酶组合制剂，1.75ml ph4.8 na2hpo4‑
柠檬酸缓冲液，1
×
6cm新华中速定量滤纸条(约50mg)，充分混匀后放入50℃水浴反应60min；然后加入2ml dns试剂，在沸水浴中煮沸10min；冷却后用蒸馏水定容至15ml；定容后550nm下测定od值。空白中的纤维素酶和lpmo酶组合制剂用煮沸灭活的纤维素酶和lpmo酶组合制剂代替。测得od值后，查标准曲线，求出溶液中葡萄糖的含量。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每l ml纤维素酶和lpmo酶组合制剂每分钟水解产生1μmol底物(葡萄糖180)所需的酶量为一个酶活单位iu。经测定，经步骤1得到的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2产的纤维素酶和lpmo酶组合制剂的滤纸酶活达到7.37u/g底物。
34.3.lpmo酶活力测定：参照red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit说明书，配制100μm red reagent 50μl，加入纤维素酶和lpmo酶组合制剂20μl，1
×
reaction buffer30μl，共100μl反应体系，使用酶标仪(eon，biotek)在波长530nm获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有lpmo的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。以h2o2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(lpmos酶活力单位定义：在反应体系中每毫升纤维素酶和lpmo酶组合制剂，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位u)。经测定，经步骤1得到的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2产的纤维素酶和lpmo酶组合制剂的lpmo酶活达到17.17u/g底物，具有较高的酶活力。
35.结果表明，本发明的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2能高产lpmo，由草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2固态发酵制得的纤维素酶和lpmo酶组合制剂的lpmo酶活高达17.17u/g底物，该纤维素酶和lpmo酶组合制剂的滤纸酶活达7.37iu/g底物，目前已经报道的产lpmo的橙色嗜热子囊菌(thermoascus aurantiacus)和粗糙脉孢菌(neurospora crassa)，经步骤1同样的固态发酵方式，其中由粗糙脉孢菌固态发酵制得的纤维素酶和lpmo酶组合制剂的lpmo酶活为15.45u/g底物，滤纸酶活为4.68iu/g底物；由橙色嗜热子囊菌固态发酵制得的纤维素酶和lpmo酶组合制剂的lpmo酶活为12.50u/g底物，滤纸酶活仅为0.66iu/g底物(见图4)。因此，本发明的产纤维素酶和lpmo的草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2与现有报道中的产lpmo菌株相比具有较高的产酶能力，是一种新型高产的产纤维素酶和lpmo菌株。
36.实施例3：纤维素酶和lpmo酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解
37.1.反应底物：杨木粉碎至60目，105℃烘干至恒重，称取2.5g杨木粉与2.5g固体酸(具体制备方法参见专利zl 201110126178.7的实施例3)混合，170℃预处理30min，得到反应底物。
38.2.称取步骤1的反应底物0.5g，加入商品纤维素酶10fpu/g反应底物，再加入实施例2步骤1制得的纤维素酶和lpmo酶组合制剂25mg，得到酶解反应体系；50℃水解72h。hplc检测还原糖含量。
39.以不加本发明的纤维素酶和lpmo酶组合制剂作为对照，同时以实施例2步骤1同样的固态发酵方式分别发酵粗糙脉孢菌n1(neurospora crassa)和橙色嗜热子囊菌t2(thermoascus aurantiacus)所产的纤维素酶和lpmo酶组合制剂与商品纤维素酶按照步骤
2的酶解反应体系和反应条件共同作用比较，研究由草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2菌株固态发酵制得的纤维素酶和lpmo酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解的效果。
40.结果如图5所示，筛选所得草酸青霉菌(penicillium oxalicum)xzh
‑
2菌株固态发酵制得的纤维素酶和lpmo酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解中，与不加纤维素酶和lpmo酶组合制剂相比，酶解率提高13.35％。该纤维素酶和lpmo酶组合制剂使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素的水解效率，尤其适合于林木纤维素降解的应用。该纤维素酶和lpmo酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，从而有效地降低酶解过程的加酶量。对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。
41.上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。